本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種與獼猴桃果實(shí)縱徑性狀qtl位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

獼猴桃富含維生素c、膳食纖維和多種礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，是一種深受消費(fèi)者青睞的健康水果。中國(guó)是獼猴桃屬植物的原始起源中心，獼猴桃資源極為豐富，形態(tài)和遺傳多樣性高，中國(guó)擁有全世界獼猴桃物種資源總數(shù)的96％左右。憑借豐富的自然資源，選育聚合優(yōu)良性狀的新品種，對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展起到關(guān)鍵作用。果實(shí)大小是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素之一，縱徑為衡量果實(shí)大小的重要指標(biāo)，直接影響果實(shí)大小，進(jìn)而影響果園的單位產(chǎn)量和果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收益。因此，增加果實(shí)縱徑、增加果實(shí)大小對(duì)改善獼猴桃果實(shí)品質(zhì)至關(guān)重要，是獼猴桃育種的重要目標(biāo)之一。

傳統(tǒng)獼猴桃育種中，童期長(zhǎng)、種植占地面積大等是影響育種效率的主要困難。隨著分子生物學(xué)和測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，對(duì)性狀的選擇正在逐漸由表型選擇向基因型選擇過渡。分子標(biāo)記輔助育種能利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記對(duì)個(gè)體進(jìn)行篩選，以達(dá)到提高目標(biāo)性狀選擇效率、縮短育種年限的目的。近年來，在蘋果、梨、葡萄等果樹中，已成功開發(fā)了重要農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇也日趨成熟。然而，獼猴桃重要農(nóng)藝性狀定位及相關(guān)分子標(biāo)記開發(fā)工作比較匱乏。2013年，獼猴桃基因組草圖的公布為基因組學(xué)研究和獼猴桃分子輔助育種提供了重要基礎(chǔ)。隨后，基于構(gòu)建獼猴桃高密度遺傳圖譜，開發(fā)了3個(gè)性別鑒定標(biāo)記，在育種早期進(jìn)行性別鑒定，避免了人力和物力的浪費(fèi)。農(nóng)藝性狀qtl定位就是在遺傳分離群體的基礎(chǔ)上，借助分子標(biāo)記和遺傳圖譜，利用qtl作圖軟件對(duì)分離群體的數(shù)量性狀表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而確定數(shù)量性狀基因在染色體上的位置和效應(yīng)。利用遺傳連鎖圖譜，結(jié)合表型數(shù)據(jù)開展數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitativetraitloci，qtl)掃描，已成為解析復(fù)雜數(shù)量遺傳學(xué)規(guī)律、有效定位關(guān)鍵農(nóng)藝性狀、開發(fā)關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記以及對(duì)優(yōu)良性狀進(jìn)行早期選擇的有效手段。

目前，對(duì)獼猴桃重要品質(zhì)性狀果實(shí)縱徑的qtl定位以及發(fā)掘與果實(shí)縱徑相關(guān)的分子標(biāo)記研究尚未開展。開展獼猴桃果實(shí)縱徑的qtl研究，基于qtl位點(diǎn)信息進(jìn)行分子標(biāo)記篩選，有助于提高對(duì)獼猴桃果實(shí)縱徑性狀選擇的育種效率，節(jié)約育種成本，提升獼猴桃產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種獼猴桃第11號(hào)染色體第473892個(gè)堿基在獼猴桃果實(shí)縱徑篩選育種中的應(yīng)用，包括針對(duì)獼猴桃第11號(hào)染色體第473892個(gè)堿基設(shè)計(jì)的引物在獼猴桃果實(shí)縱徑篩選育種中的應(yīng)用，包括包含有獼猴桃第11號(hào)染色體第473892個(gè)堿基的獼猴桃序列在獼猴桃果實(shí)縱徑篩選育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的在于提供了一種與獼猴桃果實(shí)縱徑性狀qtl位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物，引物為vd-f：5’-agctccggtagtactttacga-3’和vd-r：5’-tggcttccttgctaaacctag-3’。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種與獼猴桃果實(shí)縱徑性狀qtl位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲得：

①使用果實(shí)縱徑小的山梨獼猴桃‘mt570001’獼猴桃和果實(shí)縱徑大的中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’雜交構(gòu)建f1分離群體。在該群體結(jié)果第6年，選擇150株f1群體的后代單株為研究對(duì)象。

②采集群體150份單株葉片，利用ctab法提取總dna。根據(jù)radseq方法構(gòu)建中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’、山梨獼猴桃‘mt570001’以及150株子代的文庫(kù)并測(cè)序。

③將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除低質(zhì)量堿基含量大于50％的序列，剔除有測(cè)序接頭污染和大量重復(fù)的序列。使用軟件soap2將符合過濾標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行位點(diǎn)變異檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性位點(diǎn)在群體中的遺傳類型。

④利用joinmap4.0分析軟件構(gòu)建基于snp標(biāo)記的獼猴桃遺傳圖譜。將符合遺傳分離規(guī)律的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，按joinmap4.0軟件格式導(dǎo)入，剔除數(shù)據(jù)缺失率在10％的位點(diǎn)，排除顯著偏分離位點(diǎn)，采用kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜。

⑤在果實(shí)成熟期，對(duì)中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’、山梨獼猴桃‘mt570001’以及150株群體單株果實(shí)縱徑進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)樣本隨機(jī)采集40個(gè)果實(shí)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量果實(shí)縱徑。

⑥將樣本平均果實(shí)縱徑的表型數(shù)據(jù)和標(biāo)記的基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入mapqtl5.0軟件，選擇多區(qū)間作圖法，設(shè)置lod閾值為3.0，對(duì)獼猴桃果實(shí)縱徑進(jìn)行qtl定位分析。最終檢測(cè)到與果實(shí)縱徑相關(guān)的主效qtl位點(diǎn)，對(duì)該性狀的貢獻(xiàn)率為27.26％，該位點(diǎn)相鄰的snp標(biāo)記在連鎖群上的遺傳距離為89.4cm。

⑦提取獼猴桃第11號(hào)染色體第473892個(gè)堿基上下游各100bp的序列，按照設(shè)計(jì)引物原則，開發(fā)設(shè)計(jì)snp標(biāo)記引物。正向引物vd-f：5’-agctccggtagtactttacga-3’，反向引物vd-r：5’-tggcttccttgctaaacctag-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為113bp。

本發(fā)明的保護(hù)范圍包括：獼猴桃11號(hào)染色體第473892個(gè)堿基在獼猴桃果實(shí)縱徑篩選育種中的應(yīng)用，或者基于獼猴桃第11號(hào)染色體第473892個(gè)堿基設(shè)計(jì)的引物在獼猴桃果實(shí)縱徑篩選育種中的應(yīng)用，或是seqidno.3所示序列在獼猴桃果實(shí)縱徑篩選育種中的應(yīng)用。

以上所述的應(yīng)用，可利用現(xiàn)有技術(shù)，對(duì)待檢獼猴桃的第11號(hào)染色體的第473892個(gè)堿基進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)獼猴桃果實(shí)縱徑篩選進(jìn)行早期育種的目的。

本發(fā)明的積極效果：

本發(fā)明首次定位了獼猴桃中控制果實(shí)縱徑的主效qtl位點(diǎn)，可解釋27.26％的表型方差。在常規(guī)育種方法中，獼猴桃果實(shí)縱徑表型鑒定要等到成熟期，浪費(fèi)大量時(shí)間和精力，且選擇效率低下，而通過檢測(cè)與果實(shí)縱徑主效位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，可以在苗期進(jìn)行淘汰，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率。本發(fā)明中獼猴桃果實(shí)縱徑的主效基因位點(diǎn)位置明確，分子標(biāo)記位點(diǎn)的檢測(cè)方法方便快捷，不受環(huán)境影響。通過檢測(cè)與果實(shí)縱徑性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，即可預(yù)測(cè)獼猴桃果實(shí)縱徑，進(jìn)而準(zhǔn)確快速篩選果實(shí)縱徑較大的優(yōu)良單株。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，為常規(guī)技術(shù)；所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1：

與獼猴桃果實(shí)縱徑主效qtl及開發(fā)連鎖的分子標(biāo)記的獲得：

①本實(shí)施例中使用果實(shí)縱徑小的山梨獼猴桃‘mt570001’獼猴桃和果實(shí)縱徑大的中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’雜交構(gòu)建f1分離群體。在該群體結(jié)果第6年，選擇150株f1群體的后代單株為研究對(duì)象。

②采集群體150份單株葉片，利用ctab法提取總dna。根據(jù)radseq方法構(gòu)建中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’、山梨獼猴桃‘mt570001’以及150株子代的文庫(kù)并測(cè)序。

③將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除低質(zhì)量堿基含量大于50％的序列，剔除有測(cè)序接頭污染和大量重復(fù)的序列。使用軟件soap2將符合過濾標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行位點(diǎn)變異檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性位點(diǎn)在群體中的遺傳類型。

④利用joinmap4.0分析軟件構(gòu)建基于snp標(biāo)記的獼猴桃遺傳圖譜。將符合遺傳分離規(guī)律的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，按joinmap4.0軟件格式導(dǎo)入，剔除數(shù)據(jù)缺失率在10％的位點(diǎn)，排除顯著偏分離位點(diǎn)，采用kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜。

⑤在果實(shí)成熟期，對(duì)中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’、山梨獼猴桃‘mt570001’以及150株群體單株果實(shí)縱徑進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)樣本隨機(jī)采集40個(gè)果實(shí)，用游標(biāo)卡尺量取果實(shí)縱徑。

⑥將樣本果實(shí)縱徑的表型數(shù)據(jù)和標(biāo)記的基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入mapqtl5.0軟件，選擇多區(qū)間作圖法，設(shè)置lod閾值為3.0，對(duì)獼猴桃果實(shí)縱徑進(jìn)行qtl定位分析。最終檢測(cè)到與果實(shí)縱徑相關(guān)的主效qtl位點(diǎn)，對(duì)該性狀的貢獻(xiàn)率為27.26％，該位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的snp標(biāo)記在連鎖群上的遺傳距離為89.4cm。

⑦提取獼猴桃第11號(hào)染色體第473892個(gè)堿基上下游各100bp的序列，按照設(shè)計(jì)引物原則，開發(fā)設(shè)計(jì)snp標(biāo)記引物。正向引物vd-f：5’-agctccggtagtactttacga-3’，反向引物vd-r：5’-tggcttccttgctaaacctag-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為113bp。

在中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’中擴(kuò)增的序列為seqidno.3所示；

在山梨獼猴桃‘mt570001’中擴(kuò)增的序列為seqidno.4所示。

⑧利用高分辨率溶解曲線(hrm)技術(shù)對(duì)果實(shí)縱徑進(jìn)行分型。按照premixextaq^tmii(tlirnasehplus),roxplus試劑盒說明，設(shè)計(jì)20ul反應(yīng)體系：5ng·ul^-1獼猴桃基因組dna模板2ul，2×sybrpremix10ul，50×roxdyeii0.4ul，10umvd-f和vd-r各0.8ul，雙蒸水補(bǔ)足余量。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5s，60℃退火1min；95℃變性5s，60℃退火30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。溶解程序?yàn)椋?5℃15s；60℃1min，再?gòu)?0-95℃連續(xù)升溫，每升高0.3℃收集1次熒光，95℃15s，最后降溫至40℃。在genescanning軟件中自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線。

⑨對(duì)該分子標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線進(jìn)行分析，40個(gè)雜交后代分為兩類基因型。線型分組1(與親本中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’的溶解曲線相同)中，23個(gè)后代單株的果實(shí)平均縱徑為56.14mm；線型分組2(與親本山梨獼猴桃‘mt570001’的溶解曲線相同)中，17個(gè)后代單株果實(shí)平均縱徑為45.86mm。對(duì)40個(gè)雜交子代的平均縱徑進(jìn)行顯著性檢測(cè)，分析顯示兩類基因型個(gè)體的果實(shí)平均縱徑差值為10.28mm，差異極其顯著(p<0.005)。因此，通過對(duì)果實(shí)縱徑的測(cè)定和hrm分析結(jié)果分析，證明該特異分子標(biāo)記可以檢測(cè)獼猴桃果實(shí)縱徑的差異。

實(shí)施例2：

一種與獼猴桃果實(shí)縱徑性狀qtl位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記在獼猴桃育種中的應(yīng)用，其步驟是：

(1)以具有抗寒性高、抗病性好但果實(shí)縱徑小的山梨獼猴桃做為母本，果實(shí)風(fēng)味佳且果實(shí)縱徑大的中華獼猴桃為父本雜交得到f1代，選取f1代群體中60個(gè)單株為研究對(duì)象。

(2)在果實(shí)成熟期，采集f1代群體60個(gè)單株的果實(shí)，每株采40個(gè)果實(shí)，用游標(biāo)卡尺量取果實(shí)縱徑。

(3)提取f1代60個(gè)單株的總dna，按照premixextaqii(tlirnasehplus),roxplus試劑盒說明，設(shè)計(jì)20ul反應(yīng)體系：5ng·ul^-1獼猴桃基因組dna模板2ul，2×sybrpremix10ul，50×roxdyeii0.4ul，10umvd-f和vd-r各0.8ul，雙蒸水補(bǔ)足余量。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5s，60℃退火1min；95℃變性5s，60℃退火30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。溶解程序?yàn)椋?5℃15s；60℃1min，再?gòu)?0-95℃連續(xù)升溫，每升高0.3℃收集1次熒光，95℃15s，最后降溫至40℃。在genescanning軟件中自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線。

對(duì)該分子標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線進(jìn)行分析，60個(gè)雜交后代分為兩類基因型。線型分組1(與親本中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’的溶解曲線相同)中，25個(gè)后代單株平均縱徑為55.17mm；線型分組2(與親本山梨獼猴桃‘mt570001’的溶解曲線相同)中，35個(gè)后代單株平均縱徑為46.22mm。對(duì)60個(gè)雜交子代的平均縱徑進(jìn)行顯著性檢測(cè)，分析顯示兩類基因型個(gè)體的平均縱徑差值為8.95mm，差異極其顯著(p<0.005)。因此，通過對(duì)果實(shí)縱徑的測(cè)定和hrm分析結(jié)果分析，說明通過分子標(biāo)記輔助選擇果實(shí)縱徑位點(diǎn)，可以明顯提高選擇效率。

sequencelisting

<110>中國(guó)科學(xué)院武漢植物園

<120>一種與獼猴桃果實(shí)縱徑性狀qtl位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用

<130>一種與獼猴桃果實(shí)縱徑性狀qtl位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用

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