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技術(shù)領(lǐng)域：
】本發(fā)明涉及一種一種檢測1型2型糖尿病易感位點的方法及試劑盒，更具體的涉及xrcc1基因和tlr2基因核苷酸多態(tài)性及其與1型、2型糖尿病的相關(guān)性，及其檢測核苷酸多態(tài)性的方法和試劑盒，本發(fā)明可用于疾病的輔助診斷、治療和新藥開發(fā)，屬于分子生物學和醫(yī)學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：糖尿病是常見病、多發(fā)病，其患病率正隨人民生活水平的提高、人口老化和生活方式的改變迅速增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)估計，全球目前有超過1.5億糖尿病患者，到2025年這一數(shù)字將增加一倍。我國現(xiàn)有糖尿病患者3千萬，居世界第2位。糖尿病已成為發(fā)達國家中繼心血管病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病，對社會和經(jīng)濟帶來沉重的負擔，是嚴重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。根據(jù)who和國際糖尿病聯(lián)盟(idf)專家組的建議，糖尿病可分為1型、2型、其他特殊類型及妊娠糖尿病四種。糖尿病的病因和發(fā)病機制較為復雜，至今尚未完全明了。目前認為1型糖尿病(typeidiabetes,t1dm)是一種在遺傳與環(huán)境相互作用下，以t細胞介導的特異性胰島β細胞自身免疫性破壞為主要發(fā)病機制的一種疾病。1型糖尿病具有多基因遺傳背景，易感性十分復雜，疾病的發(fā)生是多種基因相互作用、相互影響的結(jié)果。近年來，隨著對1型、2型糖尿病相關(guān)基因的研究日趨深入，證實了多種基因在1型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中的作用，為1型糖尿病的早期診斷和治療提供了理論依據(jù)?，F(xiàn)有技術(shù)檢測1型和2型糖尿病易感人群，采用雜交芯片法或玻璃板芯片法，以及采用taqman探針，前兩種方法準確率低、假陰性和假陽性率較高，且不能批量檢測；另一種直接測序法雖然準確率高，但其成本也很高，同樣很難實現(xiàn)批量檢測。因此，鑒于糖尿病嚴重影響人們身體健康，為了盡早診斷糖尿病，有必要提出一種新的檢測方法以解決上述問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的是提供一種輔助診斷1型2型糖尿病的方法，該方法操作簡單、快速，使用成本低，結(jié)果準確，可以實現(xiàn)批量檢測。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測1型和2型糖尿病易感位點的試劑盒，該試劑盒包括pcr引物及含有該引物的試劑盒，其可以實現(xiàn)擴增與hrm分析。為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種檢測1型糖尿病易感位點的方法，包括如下步驟：(1)提取樣品的基因組dna，利用特異性引物擴增樣品的xrcc1基因外顯子中包含rs370865696號位點的區(qū)域，tlr2基因包含和rs763297202號位點的區(qū)域，得到擴增產(chǎn)物；(2)將所述擴增產(chǎn)物利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點的基因型。進一步的，xrcc1基因的rs370865696位點的基因型帶有g(shù)g時，該ctla-4基因所屬樣品的測試者對于1型、2型糖尿病的易感性高于基因型不帶gg的測試者；tlr2基因的rs763297202位點的基因型帶有tt時，該tlr2基因所屬樣品的測試者對于1型、2型糖尿病的易感性高于基因型不帶tt的測試者；進一步的，使用特異性引物擴增樣品的xrcc1基因外顯子中包含rs370865696位點的區(qū)域，該特異性引物是指針對xrcc1基因上rs370865696號snp位點而設(shè)計，能特異性擴增出包含上述snp位點的dna片段的引物對。進一步的，所述擴增過程包括：95℃預變性3min，95℃變性30s，60℃退火30s，75℃延伸150s，共60個循環(huán)。進一步的，所述特異性引物具有seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5和seqidno：6所示的核苷酸序列。進一步的，使用hrm分析技術(shù)直接檢測擴增后包含上述snp位點的dna片段的引物對的基因型。將擴增后包含上述snp位點的dna片段的引物對轉(zhuǎn)移至分析裝置，然后使用hrm分析技術(shù)對該引物對的基因型進行分析。進一步的，所述熔解曲線的確定基因分型具體為：xrcc1基因熔解曲線：熔解溫度為63±0.5℃為aa型，熔解溫度為65±0.5℃為gg型，熔解溫度63±0.5℃和65±0.5℃為ag型；tlr2基因熔解曲線：熔解溫度為56±0.5℃為tt型，熔解溫度為66±0.5℃位cc型，熔解溫度56±0.5℃和66±0.5℃為tc型。進一步的，所述1型糖尿病易感位點的檢測方法在體外非診斷性檢測1型糖尿病易感性方面的應用。為了解決上述問題，本發(fā)明采用的另一技術(shù)方案是：一種用于檢測1型糖尿病易感位點的試劑盒，其可以對xrcc1基因外顯子中包含rs370865696號位點的區(qū)域和tlr2基因包含和rs763297202號位點的區(qū)域進行擴增及hrm技術(shù)分析。進一步的，所述試劑盒包括特異性擴增xrcc1基因外顯子中包含rs370865696號位點的區(qū)域和tlr2基因包含和rs763297202號位點的區(qū)域的特異性引物。進一步的，所述特異性引物具有seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5和seqidno：6所示的核苷酸序列。進一步的，試劑盒的組分及含量包括3.5ul2xlightcycler480highresolutionmeltingmastermix、2ul25mmmgcl2溶液、1ul2μmprimermix、1ul5ng/μl左右dna、2.5ulh2o、具有seqidno：3和seqidno：4所示的核苷酸序列的特異性引物seqidno：3seqidno：4。進一步的，所述試劑盒在檢測1型糖尿病易感性方面的應用。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：采用hrm分析技術(shù)對擴增后的xrcc1基因外顯子中包含rs370865696號位點的區(qū)域和tlr2基因包含和rs763297202號位點的區(qū)域進行基因型分析，該方法操作簡單、快速，使用成本低，結(jié)果準確，可以實現(xiàn)批量檢測?！靖綀D說明】圖1是xrcc1基因中rs370865696號位點基因型的hrm檢測結(jié)果，圖1a為在引物seqidno：3下的檢測曲線，圖1b為在引物seqidno：4下的檢測曲線；圖2是tlr2基因包含和rs763297202號位點基因型的hrm檢測結(jié)果，圖2a為在引物seqidno：5下的檢測曲線，圖2b為在引物seqidno：6下的檢測曲線；【具體實施方式】下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人、分子克隆、實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照廠商所建議的條件。本發(fā)明提供了一種1型、2型糖尿病易感位點的檢測方法及試劑盒，所述方法包括如下步驟：提取樣品的基因組dna，利用特異性引物擴增樣品的xrcc1基因外顯子中包含rs370865696號位點的區(qū)域，tlr2基因包含和rs763297202號位點的區(qū)域，得到擴增產(chǎn)物；(2)將所述擴增產(chǎn)物利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點的基因型。進一步的，xrcc1基因的rs370865696位點的基因型帶有g(shù)g時，該ctla-4基因所屬樣品的測試者對于1型、2型糖尿病的易感性高于基因型不帶gg的測試者；tlr2基因的rs763297202位點的基因型帶有tt時，該tlr2基因所屬樣品的測試者對于1型、2型糖尿病的易感性高于基因型不帶tt的測試者；進一步的，使用特異性引物擴增樣品的xrcc1基因外顯子中包含rs370865696位點的區(qū)域，該特異性引物是指針對xrcc1基因上rs370865696號snp位點而設(shè)計，能特異性擴增出包含上述snp位點的dna片段的引物對。進一步的，所述擴增過程包括：95℃預變性3min，95℃變性30s，60℃退火30s，75℃延伸150s，共60個循環(huán)。進一步的，所述特異性引物具有seqidno：3和seqidno：4所示的核苷酸序列。進一步的，使用hrm分析技術(shù)直接檢測擴增后包含上述snp位點的dna片段的引物對的基因型。將擴增后包含上述snp位點的dna片段的引物對轉(zhuǎn)移至分析裝置，然后使用hrm分析技術(shù)對該引物對的基因型進行分析。進一步的，所述熔解曲線的確定基因分型具體為：xrcc1基因熔解曲線：熔解溫度為63±0.5℃為aa型，熔解溫度為65±0.5℃為gg型，熔解溫度63±0.5℃和65±0.5℃為ag型；tlr2基因熔解曲線：熔解溫度為56±0.5℃為tt型，熔解溫度為66±0.5℃位cc型，熔解溫度56±0.5℃和66±0.5℃為tc型。脫氧核糖核酸(dna)序列編號：rs370865696位置基于seqidno：1所示的核苷酸序列，rs763297202位置基于seqidno：2所示的核苷酸序列；引物1基于seqidno：3所示的核苷酸序列；引物2基于seqidno：4所示的核苷酸序列；引物3基于seqidno：5所示的核苷酸序列；引物4基于seqidno：6所示的核苷酸序列；擴增產(chǎn)物3基于seqidno：7所示的核苷酸序列。經(jīng)過多年研究證明了xrcc1基因單核苷酸多態(tài)性位點rs370865696和tlr2基因單核苷酸多態(tài)性位點rs763297202均與1型和2型糖尿病密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能：xrcc1基因單核苷酸多態(tài)性位點rs370865696位于xrcc1外顯子中的基因型的改變將導致1型或2型糖尿病的發(fā)病風險升高，tlr2基因單核苷酸多態(tài)性位點rs763297202位于tlr2外顯子中的基因型的改變將導致1型或2型糖尿病的發(fā)病風險升高，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在xrcc1基因rs370865696和tlr2基因rs763297202a→g在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(p<0.05)，該snp多態(tài)性可改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。xrcc1基因的詳細序列可參見登錄號為rs370865696的核苷酸序列，tlr2基因的詳細序列可參見登錄號為rs763297202(可參見網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。實施例1：熒光pcr檢測一、實驗材料lightcycler480熒光定量pcr儀購自瑞士羅氏(roche)公司，聚合酶鏈反應液(lightcycler480highresolutionmeltingmaster)由瑞士羅氏(roche)公司定制合成。二、引物及探針設(shè)計與合成：以xrcc1基因和tlr2基因外顯子的部分序列為模板，使用primerpremier5軟件分析引物，并由上海生工生物工程有限公司定制合成。檢測用引物：xrcc1基因rs370865696上游引物序列：5＇-gtgaatgagacactggccga-3＇(seqidno：3)xrcc1基因rs370865696下游引物序列：5＇-atgggctcacgaacaaiagt-3＇(seqidno：4)；tlr2基因rs763297202上游引物序列：5＇-atgggctcacgaacaaiagt-3＇(seqidno：5)tlr2基因rs763297202下游引物序列：5＇-gcaaacagcaacdaayccat-3＇(seqidno：6)三、樣本檢測：實驗共檢測100例1型糖尿病病例、100例2型糖尿病病例和100例正常對照人群，每例收集血樣標本約2ml，用酚/氯仿抽屜基因組dna，抽提結(jié)果用微量紫外/可見光分光光度計(thermofisher公司)檢測。按如下體系進行熒光pcr擴增，最后用rochelc480software1.5掃描并聚類分析四、基因型檢測結(jié)果：基因組dna抽提的檢測結(jié)果：所有樣本的基因組dna符合檢測要求(260/280>1.8，濃度>10ng/ul)實施例2：taqman法檢測xrcc1基因rs370865696位點的基因型和tlr2基因rs763297202位點的基因型用taqman法檢測xrcc1基因rs370865696位點和tlr2基因rs763297202位點。挑選上述病例-對照組樣本各10例進行taqman分型實驗，判斷rs370865696的基因型和rs763297202的基因型。一、實驗方法taqman探針方法使用美國應用生物系統(tǒng)公司的taqman探針，蘇州新海生物科技有限公司的taqmanmix。按如下體系進行pcr擴增，最后用rochelc480software1.5掃描并聚類分析384孔板(ul)taqmanmix3taqmanprobe0.2dna(5ng/μl左右)2h2o4.8反應總體積10二、實驗結(jié)果最終，20例的taqman分型結(jié)果與lightcycler480熒光pcr的hrm分析結(jié)果完全一致。三、xrcc1基因rs370865696、tlr2基因rs763297202和1型糖尿病和2型糖尿病易感的關(guān)聯(lián)分析xrcc1基因rs370865696和tlr2基因rs763297202在1型、2型糖尿病病人和對照中分布的比較采用rxcχ2檢驗.用spss軟件進行統(tǒng)計分析，檢測結(jié)果的spss軟件分析結(jié)果如下表所示：實施例3：1型糖尿病易感位點的檢測試劑盒本發(fā)明提供的檢測試劑盒可以對xrcc1基因外顯子中包含rs370865696位點的區(qū)域和tlr2基因外顯子中包含rs763297202位點進行擴增及hrm技術(shù)分析，該檢測試劑盒可以檢測1型糖尿病的易感性，其包含有可擴增出xrcc1基因外顯子中包含rs370865696位點的區(qū)域和tlr2基因外顯子中包含rs763297202位點的特異性引物及其他pcr-hrm相應試劑，pcr擴增與hrm分析的組分含量相同。檢測試劑盒供100人份檢測應用，于-20℃避光保存，其組分及含量包括：3.5ul2xlightcycler480highresolutionmeltingmastermix2ul25mmmgcl2溶液1ul2μmprimermix1ul5ng/μl左右dna2.5ulh2o具有seqidno：3和seqidno：4所示的核苷酸序列的特異性引物各0.2um。本發(fā)明具有實用性的例證：檢測該個體的xrcc1基因的rs370865696位點的區(qū)域和tlr2基因的rs763297202位點的基因型，以此判斷該個體患1型、2型糖尿病的發(fā)病風險是否高于普通人群。xrcc1基因的rs370865696位點的區(qū)域和tlr2基因的rs763297202位點的多態(tài)性可直接用于1型、2型糖尿病的個性化治療。檢測xrcc1基因的rs370865696位點的區(qū)域和tlr2基因的rs763297202位點的基因型也可用于診斷1型、2型糖尿病。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用做參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)特點已揭示如上，然而熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員仍可能基于本發(fā)明的教示及揭示進行種種不背離本發(fā)明精神的替換和修飾。因此，本發(fā)明的保護范圍應不限于實施方式所揭示的內(nèi)容，而包括各種不背離本發(fā)明的替換和修飾，均為本專利申請權(quán)利要求所涵蓋。序列表〈110〉光瀚健康咨詢管理（上海）有限公司〈120〉一種檢測1型2型糖尿病易感位點的方法及試劑盒〈130〉〈160〉7〈170〉patentinversion3.5〈210〉1〈211〉51〈212〉dna〈213〉智人（homosapiens）〈400〉1ctctgaatcctccatcctccaggaargatcccaaacacatctcaattctag51〈210〉2〈211〉51〈212〉dna〈213〉智人（homosapiens）〈400〉1gagaagacaataaatttatgataggrtttcgggtattgagaagtactatga51〈210〉3〈211〉21〈212〉dna〈213〉人工序列〈400〉2gtgaatgagacactggccga20引物〈210〉4〈211〉19〈212〉dna〈213〉人工序列〈400〉3atgggctcacgaacaaiagt20引物〈210〉5〈211〉19〈212〉dna〈213〉人工序列〈400〉3atgggctcacgaacaaiagt20引物〈210〉6〈211〉19〈212〉dna〈213〉人工序列〈400〉3gcaaacagcaacdaayccat20引物〈210〉7〈211〉71〈212〉dna〈213〉人工序列〈400〉4tgttcgatgttgcgctgggcgcccttgagttgctgttgctagtttcgggctgttggtcat60ccacgcagaaacccagaggtcatagtcaactgctctctggacggccgcatt51擴增片段當前第1頁12