本發(fā)明涉及分子標記技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于鑒別玉米品種“先玉335”和“先玉696”的引物及其應用。
背景技術(shù)：
通常鑒別玉米品種的方法為籽粒形態(tài)鑒定、幼苗鑒定和小區(qū)種植鑒定。籽粒形態(tài)鑒定可供比較的性狀差異少，鑒定準確性差；幼苗鑒定只適用于某些差異較大的品種，可鑒定的品種少；廣泛采用的小區(qū)種植鑒定的方法，不僅費用高，而且時間長，幾乎相當于一個生長發(fā)育周期。種子企業(yè)常因在種子銷售季節(jié)開始時還沒鑒定種子純度而導致標簽失真；監(jiān)督檢驗機構(gòu)常在種子銷售以后甚至是農(nóng)民播種以后才能鑒定出種子純度。失去了阻止劣質(zhì)種子播種的機會。上述方法的檢測結(jié)果還常受到檢驗人員的判斷能力和掌握標準程度的影響，以至于不同檢驗人員對同一樣品有不同的鑒定結(jié)果。
為克服上述方法存在的缺陷，科學家們將蛋白質(zhì)電泳技術(shù)引入到種子檢驗領(lǐng)域。創(chuàng)建了雜交玉米種子純度蛋白質(zhì)電泳鑒定技術(shù)體系，制定了《玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法》(ny/t449-2001)標準，該方法具有操作相對簡單、檢測速度快，受實驗環(huán)境和人為因素影響小等特點，在種子質(zhì)量檢驗實際中得到廣泛應用。但由于蛋白質(zhì)是基因轉(zhuǎn)錄后的次生產(chǎn)物，在對遺傳基礎(chǔ)相近的種子純度與品種真實性鑒定時具有一定的局限性。
ssr(simplesequencerepeats)分子標記技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新型dna指紋技術(shù)，已應用于玉米品種鑒定和純度檢測研究中，技術(shù)具有標記數(shù)量豐富、多態(tài)性高、呈共顯性遺傳、能基因定位、無污染、重復性好、結(jié)果可靠，而且所需dna數(shù)量少，質(zhì)量要求不高，檢測容易等諸多優(yōu)點。由于不同玉米品種遺傳組成不同，基因組dna中簡單重復序列的重復次數(shù)存在差異，這種差異可通過pcr擴增及電泳方法進行檢測，從而能夠區(qū)分不同玉米品種。
先玉335和先玉696都是是鐵嶺先鋒種子研究有限公司選育的國審玉米雜交種,具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗倒伏、適應性廣、熟期適中、株型合理等優(yōu)點，其中先玉696既克服了先玉335的主要缺陷(如不抗大斑病、絲黑穗病、玉米螟)，還繼承了先玉335的籽粒品質(zhì)好脫水快，出籽率高的優(yōu)勢，近年來深受農(nóng)民喜愛,推廣面積逐年加大。
然而先玉696和先玉335有著相同的母本(ph6wc)，只是父本不同，二者為同母異父品種。不僅從種子外觀上二者無任何差異，而且利用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)進行鑒別，由于蛋白質(zhì)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后的次生產(chǎn)物，在對遺傳基礎(chǔ)相近的品種鑒定時具有一定的局限性，同樣也是無法區(qū)分先玉696和先玉335。ssr廣泛存在于生物的基因組中，是由1～6個堿基為重復單位組成的串聯(lián)重復序列，相同座位上的重復序列由于重復次數(shù)不同而產(chǎn)生了等位基因的多態(tài)性。
圖1為使用國家標準(ny/t449-2001)《玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法》的電泳圖譜，1-6先玉335，8-14先玉696。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種用于鑒別玉米品種“先玉335”和“先玉696”的引物及其應用。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：該種用于鑒別玉米品種“先玉335”和“先玉696”的引物，所述引物為phi065，所述引物的核苷酸序列為：
一種采用權(quán)利要求1所述的引物進行玉米品種“先玉335”和“先玉696”鑒別的方法，鑒別步驟包括：
1)、提取“先玉335”和“先玉696”的dna；
2)、dna質(zhì)量檢測：分別對提取的“先玉335”和“先玉696”的dna進行質(zhì)量檢測，取5μldna溶液在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳15分鐘，并利用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄；
3)、pcr擴增反應：采用25μl的反應體系得到擴增產(chǎn)物；pcr擴增反應的引物為phi065；反應程序為：96℃，預變性2min；94℃，45s，55℃，1min，72℃，45s，反應35個循環(huán)；72℃，延伸2min；
4)、擴增產(chǎn)物檢測：采用電泳儀和與之配套的電泳槽；8％非變性聚丙烯酰胺凝膠，150伏進行電泳，1小時結(jié)束；銀染：①固定，②滲透，③漂洗，④顯色；
5)、結(jié)果判定：判斷樣品間差異位點數(shù)的數(shù)量，當樣品間差異位點數(shù)≥2，判定為“不同”；當樣品間差異位點數(shù)＝1，判定為“近似”；當樣品間差異位點數(shù)＝0，判定為“近似”或“相同”。
上述步驟1)dna提?。杭羧?5℃條件下發(fā)芽4天的種子幼苗150mg，置于1.5ml離心管中，加入400μldna提取液，磨碎，置于65℃水浴30min；加入400μl體積比24:1的氯仿-異戊醇(v/v)，振蕩混勻；室溫下10000r/min離心5分鐘；將上清液200μl轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，加入200μl冰冷乙醇沉淀dna；10000r/min離心1min，倒去上清液，加入500μl乙醇-乙酸氨溶液，離心收集沉淀，加入100μlph為8.0的te溶解dna。
進一步地，dna提取液為2％(w/v)ctab，1.4mol/lnacl，20mmol/ledta，100mmol/ltris-hclph8.0，1％pvp。
上述步驟4)中銀染：①固定：10％乙醇和0.5％冰乙酸中浸泡5分鐘；②滲透：0.1％硝酸銀溶液中浸泡10分鐘；③漂洗：將膠片移入重蒸水中洗滌3-5秒；④顯色：將膠片移入顯色液中搖晃，直至顯現(xiàn)出清晰譜帶，即可終止顯色，用流動的自來水沖洗膠片。
上述步驟3)中反應體系為25μl的反應體系，包括10mmol/ltris-hcl，50mmol/lkcl，3.0mmol/lmgcl2，0.4μmol/lssr引物，0.25mmol/ldntp，1.0單位taqdna聚合酶，5μldna溶液。
綜上，本發(fā)明的上述技術(shù)方案的有益效果如下：
找到明確的引物：本發(fā)明是在已有的研究基礎(chǔ)上，通過篩選確定選用多態(tài)性、穩(wěn)定性好，效率高的引物phi065用于鑒定相似品種先玉335與先玉696，取得了良好的效果，能夠方便，清楚、準確、便捷的找到該兩個品種的不同位點，從而鑒別這兩個品種。
根據(jù)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程ssr標記法》(ny/t1432-2014)，檢測pcr產(chǎn)物通常采用變性page電泳，大板制膠(寬38cm，高32cm)，并且使用前要進行處理(分別涂剝離硅烷和親水硅烷)，板子的體量大，使用的凝膠液也多，每塊膠板約為50ml。并且在電泳后膠片染色時，使用的固定液、染色液、清洗液、顯影液等4種試劑也均為1000ml，而非變性page電泳玻板的大小僅為寬20cm，高10.5cm，使用前玻板不需要專門處理，僅用蒸餾水沖洗干凈即可。每塊膠板使用的凝膠液為30ml，電泳后膠片染色時使用的上述4種試劑均為100ml，而且膠片從玻板上剝離下來，無需帶板染顯色，操作非常輕松，因此非變性page與變性page相比具有制膠簡便快捷，點樣迅速，效果好，電泳后條帶整齊，易判讀，樣品不用變性，節(jié)省時間等優(yōu)點。
附圖說明
圖1為使用國家標準ny/t449-2001《玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法》的電泳圖譜。1-6先玉335，8-14先玉696。
圖2為本發(fā)明電泳圖譜，1-5為先玉335，6-10為先玉696。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖圖1和圖2對本發(fā)明的特征和原理進行詳細說明，所舉實施例僅用于解釋本發(fā)明，并非以此限定本發(fā)明的保護范圍。
材料的提供：先玉696和先玉335玉米雜交種。
用于鑒別玉米品種“先玉335”和“先玉696”的引物，所述引物為phi065，所述引物的核苷酸序列為：
一種采用權(quán)利要求1所述的引物進行玉米品種“先玉335”和“先玉696”鑒別的方法，鑒別步驟包括：
1)、提取“先玉335”和“先玉696”的dna；
2)、dna質(zhì)量檢測：分別對提取的“先玉335”和“先玉696”的dna進行質(zhì)量檢測，取5μldna溶液在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳15分鐘，并利用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄；(圖2)
3)、pcr擴增反應：采用25μl的反應體系得到擴增產(chǎn)物；pcr擴增反應的引物為phi065；反應程序為：96℃，預變性2min；94℃，45s，55℃，1min，72℃，45s，反應若干個循環(huán)(35個循環(huán)即可)；72℃，延伸2min；
4)、擴增產(chǎn)物檢測：采用電泳儀和與之配套的電泳槽；8％非變性聚丙烯酰胺凝膠，150伏進行電泳，1小時結(jié)束；銀染：①固定，②滲透，③漂洗，④顯色；
5)、結(jié)果判定：判斷樣品間差異位點數(shù)的數(shù)量，當樣品間差異位點數(shù)≥2，判定為“不同”；當樣品間差異位點數(shù)＝1，判定為“近似”；當樣品間差異位點數(shù)＝0，判定為“近似”或“相同”。dna模板經(jīng)加入引物擴增后，產(chǎn)生的特異性片段，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳將擴增產(chǎn)物檢測，表現(xiàn)出的譜帶的差異。譜帶位置的不同就可說明品種間的不同，在結(jié)果判定上要有2個或以上的位點的不同，才能說是品種的不同。如圖2所示，1-5為先玉335,6-10為先玉696。圖2中箭頭所指位置為兩個明顯的差異位。
上述步驟1)dna提?。杭羧?5℃條件下發(fā)芽4天的種子幼苗150mg，置于1.5ml離心管中，加入400μldna提取液，磨碎，置于65℃水浴30min；加入400μl體積比24:1的氯仿-異戊醇(v/v)，振蕩混勻；室溫下10000r/min離心5分鐘；將上清液200μl轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，加入200μl冰冷乙醇沉淀dna；10000r/min離心1min，倒去上清液，加入500μl乙醇-乙酸氨溶液(70％乙醇，10mmol/l乙酸氨)，離心收集沉淀(5min，10,000r/min)，加入100μlph為8.0的te溶解dna。
進一步地，dna提取液為2％(w/v)ctab，1.4mol/lnacl，20mmol/ledta，100mmol/ltris-hclph8.0，1％pvp。
上述步驟4)中銀染：①固定：10％乙醇和0.5％冰乙酸中浸泡5分鐘；②滲透：0.1％硝酸銀溶液中浸泡10分鐘；③漂洗：將膠片移入重蒸水中洗滌3-5秒；④顯色：將膠片移入顯色液中搖晃，直至顯現(xiàn)出清晰譜帶，即可終止顯色，用流動的自來水沖洗膠片。
上述步驟3)中反應體系為25μl的反應體系，包括10mmol/ltris-hcl，50mmol/lkcl，3.0mmol/lmgcl2，0.4μmol/lssr引物，0.25mmol/ldntp，1.0單位taqdna聚合酶(1.0單位taqdna聚合酶：在74℃、30分鐘內(nèi)，以活性化的大馬哈魚精子dna作為模板引物，將10nmol脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質(zhì)所需的酶量)，5μldna溶液。
上述實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行的描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設計精神的前提下，本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員對本發(fā)明的各種變形和改進，均應擴入本發(fā)明權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。