一種測試純系玉米新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及一種測試純系玉米新品種的特異性、一致性 與穩(wěn)定性的方法。
【背景技術】
[0002] 作為一種特化的知識產(chǎn)權，植物新品種已經(jīng)成為一個公司及至一個國家的核心競 爭力。植物新品種授權與相關法律問題的解決依賴于DUS測試，即對待測玉米品種的特異 性（Distinctness)、一致性（Uniformity)和穩(wěn)定性（Stability)的田間種植鑒定或室內(nèi)分 子標記鑒定。田間種植鑒定流程為：將待測玉米品種與近似品種同時植于田間，在2年及以 上的生長季節(jié)內(nèi)，觀察它們的多個性狀，根據(jù)性狀表現(xiàn)判斷待測玉米品種與近似品種的差 異顯著性，即特異性，同時判斷群體內(nèi)雜株比例，即一致性和穩(wěn)定性；室內(nèi)分子標記鑒定的 流程為：分單株提取待測玉米品種與近似品種中每個樣本的DNA，并分別對每個樣本的每 個測試區(qū)域進行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應），并對每個PCR產(chǎn)物進 行電泳或一代測序檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，獲得待測玉米品種與近似品種的差異位點比例，根 據(jù)差異位點比例，判斷待測玉米品種的特異性。
[0003] 田間種植鑒定的缺點是：周期長、工作量大，環(huán)境影響性狀，導致判斷不準確。室內(nèi) 分子標記鑒定的缺點是：需要分別處理每個樣本的每個測試區(qū)域，工作量大，不能對樣本與 測試區(qū)域大量抽樣，無法計算雜株率，因而無法進行穩(wěn)定性與一致性的測試。田間種植鑒定 與室內(nèi)分子標記鑒定的共同缺點是：均由于工作量的原因，無法從現(xiàn)有品種中客觀選擇近 似品種，只能由品種權申請人提供，而基于商業(yè)利益等動機，品種權申請人提供的近似品種 可能不真實，從而造成錯誤品種授權的法律后果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術中的問題，本發(fā)明實施例提供了一種測試純系玉米新品種的特 異性、一致性與穩(wěn)定性的方法。所述技術方案如下：
[0005] 本發(fā)明實施例提供了一種測試純系玉米新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方 法，所述方法包括：
[0006] 獲得不同玉米品種間的變異位點；
[0007] 通過所述變異位點確定待測玉米品種的測試區(qū)域，所述測試區(qū)域包括通用測試區(qū) 域，至少部分所述變異位點包含在所述通用測試區(qū)域內(nèi)；
[0008] 構(gòu)建包含所述不同玉米品種在所有所述測試區(qū)域的基因型的數(shù)據(jù)庫；
[0009] 確定所述待測玉米品種的抽樣量SN后，隨機抽樣混合并提取混合樣本的DNA ;
[0010] 制備擴增所述測試區(qū)域的引物，所述引物包括所述通用測試區(qū)域引物；
[0011] 利用所述引物對所述混合樣本的DNA進行擴增，得到所述測試區(qū)域的擴增產(chǎn)物， 所述擴增產(chǎn)物作為高通量測序文庫；
[0012] 對所述高通量測序文庫進行高通量測序，得到測序片段組；
[0013] 分析所述測序片段組，獲得待測玉米品種基因型和雜株基因型；
[0014] 將所述待測玉米品種基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較，獲得 所述待測玉米品種的近似品種、變異位點和變異位點率；
[0015] 將所述雜株基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較，獲得雜株品種 后，計算雜株率；
[0016] 利用所述變異位點、所述變異位點率和所述雜株率，判斷所述待測玉米品種特異 性、一致性和穩(wěn)定性。
[0017] 具體地，所述抽樣量5"茜足如下條件出預0^1階^]?，0.95)/5^^彡1.15柳，其 中ΒΙΝ0Μ. INV為excel 2010中的函數(shù)，M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時所選用的閾值，所 述抽樣量SN滿足的條件含義為：即使所述雜株率只超出一致性和穩(wěn)定性時的判斷閾值M的 15%，所述抽樣量在95%的概率保證下，可正確判斷所述待測玉米品種的穩(wěn)定性與一致性。
[0018] 具體地，所述高通量測序的深度CF滿足如下條件：BIN0M. DIST (10, 10, BI NOM. DIST(8, 20, BINOM. DIST(0, CF, 0. 1 % , TRUE), TRUE), FALSE) ^99.9 %, I-BIN 0M. DIST (10000, 10000, 1-BIN0M. DIST (8, 20, 1-BIN0M. DIST (99. 99 % *CF, CF, 99. 9 989 %，TRUE)，TRUE)，F(xiàn)ALSE)彡 0.1 % 且 BIN0M.DIST(10*(1-M)*CF，10*CF，1-110 % *M，TRUE)多95. 0 %，其中，CF為所述高通量測序的深度，M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時所 選用的閾值，BINOM. DIST為excel 2010中的函數(shù)，所述高通量測序的深度CF滿足的條件 含義為：在所述雜株率低至〇. 1 %、所述雜株品種為10個且所述雜株品種與所述待測玉米 品種間平均僅有20個差異位點的條件下，由所述高通量測序的深度CF決定的檢出全部所 述雜株品種的概率多99. 9% ;在所述數(shù)據(jù)庫的品種為10000個且所述雜株品種與所述待測 玉米品種間平均僅有20個差異位點的條件下，由所述高通量測序的深度CF決定的存在誤 判所述雜株品種的概率< 〇. 1% ;在所述雜株品種為10個且真實雜株率僅超過判斷特異性 時所選用的閾值的10%時，由所述高通量測序的深度CF決定的對穩(wěn)定性與一致性的判定 結(jié)論正確的概率彡95.0%。
[0019] 具體地，所述測試區(qū)域還包括非通用測試區(qū)域，所述引物還包括非通用測試區(qū)域 引物。
[0020] 進一步地，所述非通用測試區(qū)域引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物包 括第一正向引物和第一反向引物，所述第二引物包括第二正向引物和第二反向引物，所述 第一引物和所述第二引物分別進行單獨擴增得到兩個所述非通用測試區(qū)域的擴增產(chǎn)物，將 兩個所述非通用測試區(qū)域的擴增產(chǎn)物等量混合用于構(gòu)建單獨擴增的高通量測序文庫；
[0021] 所述第一正向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1，所述第 一反向引物中的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列2 ;
[0022] 所述第二正向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列2,所述第 二反向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1。
[0023] 具體地，利用所述變異位點、所述變異位點率和所述雜株率，判斷所述待測玉米品 種特異性、一致性和穩(wěn)定性的方法包括：
[0024] 當所述變異位點率多SD或所述非通用測試區(qū)域存在所述變異位點時，所述待測 玉米品種具有特異性，當所述變異位點率< SD且所述變異位點不存在于所述非通用測試 區(qū)域中時，所述待測玉米品種不具有特異性，其中，SD為判斷特異性時所選用的閾值；
[0025] 當所述待測玉米品種的所述雜株率< M時，所述待測玉米品種具有一致性和穩(wěn)定 性，當所述待測玉米品種的所述雜株率大于> M時，所述待測玉米品種不具有一致性和穩(wěn) 定性，M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時所選用的閾值；
[0026] 所述雜株率R = R1+R2-R3-R4,其中：
[0027]
【主權項】
1. 一種測試純系玉米新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方法，其特征在于，所述方法 包括： 獲得不同玉米品種間的變異位點； 通過所述變異位點確定待測玉米品種的測試區(qū)域，所述測試區(qū)域包括通用測試區(qū)域， 至少部分所述變異位點包含在所述通用測試區(qū)域內(nèi)； 構(gòu)建包含所述不同玉米品種在所有所述測試區(qū)域的基因型的數(shù)據(jù)庫； 確定所述待測玉米品種的抽樣量SN后，隨機抽樣混合并提取混合樣本的DNA ; 制備擴增所述測試區(qū)域的引物，所述引物包括所述通用測試區(qū)域引物； 利用所述引物對所述混合樣本的DNA進行擴增，得到所述測試區(qū)域的擴增產(chǎn)物，所述 擴增產(chǎn)物作為高通量測序文庫； 對所述高通量測序文庫進行高通量測序，得到測序片段組； 分析所述測序片段組，獲得待測玉米品種基因型和雜株基因型； 將所述待測玉米品種基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較，獲得所述 待測玉米品種的近似品種、變異位點和變異位點率； 將所述雜株基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較，獲得雜株品種后， 計算雜株率； 利用所述變異位點、所述變異位點率和所述雜株率，判斷所述待測玉米品種特異性、一 致性和穩(wěn)定性。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抽樣量SN滿足如下條件：BINOM. 1階^]?，0.95)/5^^彡1.15柳，其中81勵^1階為61〇612010中的函數(shù)，]\1為判斷所述一 致性和穩(wěn)定性時所選用的閾值，所述抽樣量SN滿足的條件含義為：即使所述雜株率只超出 閾值M的15%，所述抽樣量在95%的概率保證下，可正確判斷所述待測玉米品種的穩(wěn)定性 與一致性。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量測序的深度CF滿足如下條 件：BINOM. DIST (10, 10, BINOM. DIST (8, 20, BINOM. DIST (0, CF，0? 1 %，TRUE)，TRUE)，F(xiàn)ALSE) ^99. 9%, 1-BINOM. DIST(10000, 10000, 1-BINOM. DIST(8, 20, 1-BINOM. DIST(99. 99% *CF, C F，99.9989%,TRUE),TRUE)，F(xiàn)ALSE)彡 0? 1%且 BINO M.DIST(10*(1-M)*CF, 10*CF, 1-110% *M，TRUE)多95. 0 %，其中，CF為所述高通量測序的深度，M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時所 選用的閾值，BINOM. DIST為excel 2010中