本發(fā)明屬于荔枝遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定早、晚花荔枝雜交后代真雜種的分子標(biāo)記。

背景技術(shù)：

荔枝(litchichinensissonn.)起源于中國，為典型的無患子科(sapindaceae)荔枝屬(litchisonn.)亞熱帶常綠果樹，因果實(shí)形、色、香、味俱佳和營養(yǎng)豐富而譽(yù)稱“嶺南果王”、“人間仙果”以及“佛果”等美譽(yù)馳名中外。我國是荔枝的最大生產(chǎn)國，主產(chǎn)區(qū)主要分布在廣東、廣西以及海南，福建、云南、四川、貴州等省份有少量種植，然而隨著荔枝產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，很多產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)突出問題開始大量顯現(xiàn)，其中一個主要問題是各主產(chǎn)區(qū)品種栽培結(jié)構(gòu)不夠合理：特早熟和特晚熟品種所占比例特小，而中熟品種所占比例得多，造成荔枝產(chǎn)期過于集中，在6、7月份大量上市，常造成廣大果農(nóng)豐產(chǎn)年而不豐收，嚴(yán)重影響了我國荔枝產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的提高，消減了果農(nóng)栽培荔枝的積極性，出現(xiàn)荔枝果園無人管理現(xiàn)象，大片果園荒廢令人惋惜。造成以上結(jié)果的一個主要原因是現(xiàn)有的荔枝品種已經(jīng)很難滿足荔枝生產(chǎn)發(fā)展的需求，缺乏品質(zhì)優(yōu)良的特早熟和特晚熟荔枝品種。因此，培育優(yōu)質(zhì)的荔枝新品種刻不容緩，特別是特早熟和特晚熟優(yōu)良品種的選育，進(jìn)而為荔枝不同品種栽培結(jié)構(gòu)比例的優(yōu)化提供品種支撐，以達(dá)到延長荔枝產(chǎn)期的目的。

雜交育種有利于綜合雙親的優(yōu)良性狀，可以針對目標(biāo)性狀進(jìn)行有目的的育種，在荔枝育種方法中，人工雜交育種是最要的方法之一。然而荔枝是長壽命木本果樹，童期長，一般從實(shí)生種子播種到開花需要5年左右，造成荔枝雜交育種周期在10年以上，同時荔枝樹體高大，占地面積多，管理上費(fèi)工、費(fèi)時，再加上荔枝基因組高度雜合、遺傳背景不清、缺乏有效的雜種鑒別技術(shù)以及我國荔枝人工雜交育種起步晚，以上原因?qū)е吕笾﹄s交育種的成效至今甚微。分子標(biāo)記輔助育種是植物雜交育種中一個重要技術(shù)手段，可以在幼苗階段對真雜種進(jìn)行早期鑒定，能夠顯著縮短育種周期。因此，針對以上問題，借助分子標(biāo)記輔助育種手段在荔枝雜交育種上尤為重要。

毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis，ce)是20世紀(jì)80年代問世的一種高效液相分離法，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，被認(rèn)為是當(dāng)代分析科學(xué)最具活力的前沿研究課題。毛細(xì)管電泳技術(shù)因其分離效率高、分析速度快、樣品用量少、易于自動化等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、高分子等領(lǐng)域，尤其在生物分析及生命科學(xué)相關(guān)研究中顯示廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明人通過人工設(shè)施栽培在夏季對荔枝開展反季節(jié)低溫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，有力證明了低溫是誘導(dǎo)荔枝成花的關(guān)鍵環(huán)境因子，對荔枝的葉片和頂芽開展局部低溫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，證明了荔枝的葉片是感受低溫誘導(dǎo)信號的關(guān)鍵器官，為此申請工作人員對低溫處理0h、8h、32h、9d、27d、47d和61d的葉片開展rna-seq和小rna高通量深度測序。其中通過rna-seq篩選到一個荔枝成花關(guān)鍵基因lcft1，進(jìn)一步研究證明低溫是通過誘導(dǎo)荔枝葉片中l(wèi)cft1基因的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致其成花，并且lcft1基因啟動子存在兩個類型，早花荔枝屬于一個類型，晚花荔枝屬于另一個類型，這種啟動子差異導(dǎo)致誘導(dǎo)早、晚花荔枝lcft1基因表達(dá)所需低溫量不同，進(jìn)而導(dǎo)致早花荔枝易成花并早于晚花荔枝(相關(guān)結(jié)果以promoterdifferenceoflcft1isaleadingcauseofnaturalvariationoffloweringtimingindifferentlitchicultivars(litchichinensissonn.)發(fā)表在plantscience,2015,241:128-137)。早花品種(如“三月紅”、“褐毛荔”、“妃子笑”等)僅需要較短時間的低溫就能夠完成成花誘導(dǎo)(十月中下旬)，因而易成花，一般在2月左右開花；而晚花品種(如“馬貴荔”、“桂味”、“糯米糍”等)必須經(jīng)過整個冬天的低溫才能完成成花誘導(dǎo)(一月上中旬)，因而難成花，一般在4月左右開花，兩者相差兩個多月。研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)早花品種和晚花品種起源不同，早花品種起源于北方地區(qū)如云南等地，而晚花品種起源于南方地區(qū)如海南等地，由于開花時間的不同造成它們之間存在生殖上的隔離。一般而言荔枝花期早晚與熟期早晚是相關(guān)聯(lián)的，即早花品種是早熟品種，晚花品種是晚熟品種，當(dāng)然不同品種果實(shí)發(fā)育的快慢也與熟期有關(guān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首次根據(jù)早花荔枝lcft1基因啟動子屬于一個類型，晚花荔枝lcft1基因啟動子屬于另一個類型，開發(fā)一種基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的用于鑒定早、晚花荔枝雜交后代真雜種的分子標(biāo)記。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記可顯著縮短荔枝熟期雜交育種周期，節(jié)省人力、物力及土地。

本發(fā)明目的之一是提供一種鑒定早、晚花荔枝雜交后代真雜種的分子標(biāo)記開發(fā)的原理。

本發(fā)明目的之二是提供上述分子標(biāo)記的檢測方法。

本發(fā)明目的之三是提供上述分子標(biāo)記在早、晚花荔枝雜交育種中的用途。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種鑒定早、晚花荔枝真雜種的分子標(biāo)記celczw，其由下列引物對經(jīng)pcr擴(kuò)增獲得，所述引物對的上游引物為seqidno.1所示的序列，所述引物對的下游引物為seqidno.2所示的序列。

本發(fā)明還提供了一種鑒定早、晚花荔枝雜交后代真雜種鑒定的分子標(biāo)記celczw的設(shè)計(jì)方法，根據(jù)lcft1基因啟動子存在兩個類型，早花荔枝屬于一個類型，晚花荔枝屬于另一個類型，在兩者lcft1基因啟動子中smallindels突變序列兩端相同的區(qū)域設(shè)計(jì)一對引物celczw-f和celczw-r。

本發(fā)明還提供一種對早、晚花荔枝雜交后代進(jìn)行真雜種檢測的試劑盒，所述的pcr檢測試劑盒反應(yīng)體系共25μl，具體組成如下：dna模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，2×taqpcrmastermix(tiangen)12.5μl，ddh2o9.5μl。

作為優(yōu)選，所述的上游引物為celczw-f所示的序列，所述的下游引物為celczw-r所示的序列。

本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記celczw用于鑒定早、晚花荔枝雜交后代真雜種的方法，其特征包括以下步驟：以早花荔枝dna為模板，pcr擴(kuò)增的目的片段在672bp處左右出現(xiàn)峰值；以晚花荔枝dna為模板，pcr擴(kuò)增的目的片段在657bp處左右出現(xiàn)峰值；以早、晚花荔枝雜交f1代dna為模板，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物如果在672bp和657bp處左右都出現(xiàn)峰值則表明為真雜種，如果在672bp和657bp處左右只出現(xiàn)其中一個峰值則表明為假雜種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明提供了一個基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的分子標(biāo)記celczw，用以鑒定早、晚花荔枝雜交后代的真假性。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記及其鑒定方法不僅分離效率高、分析速度快、樣品用量少、易于自動化、鑒定結(jié)果精確等特點(diǎn)，同時不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確。對于木本果樹的荔枝來說，可在幼苗階段進(jìn)行早期鑒定，在早、晚花荔枝間雜交育種上具有重要的意義，可顯著縮短育種周期，大大節(jié)省人力、物力及土地，具有很高的社會經(jīng)濟(jì)價值和廣泛的應(yīng)用前景。

(2)本發(fā)明所提供的分子標(biāo)記及鑒定方法能夠在dna水平上對早、晚花荔枝雜交后代進(jìn)行真假性鑒定，有助于建立早、晚花荔枝的分子標(biāo)記輔助育種體系，便于快速、高通量的應(yīng)用于早、晚花荔枝間雜交育種實(shí)踐中。

附圖說明

圖1為早、晚花荔枝lcft1基因啟動子序列比對圖；其中，‘z’為早花荔枝lcft1基因啟動子序列；‘w’為晚花荔枝lcft1基因啟動子序列；三角形為早花荔枝lcft1基因啟動子smallindels差異：橫線標(biāo)注部分為分子標(biāo)記celczw上下游引物所在位置；方框?yàn)閘cft1基因開放閱讀框(orf)起始密碼子atg。

圖2為以早花荔枝dna為模板擴(kuò)增的目的片段毛細(xì)管電泳圖，在672bp處左右出現(xiàn)目的片段峰值(橫坐標(biāo)表示擴(kuò)增片段大小，縱坐標(biāo)表示信號強(qiáng)度)；

圖3為以晚花荔枝dna為模板擴(kuò)增的目的片段毛細(xì)管電泳圖，在657bp處左右出現(xiàn)目的片段峰值(橫坐標(biāo)表示擴(kuò)增片段大小，縱坐標(biāo)表示信號強(qiáng)度)；

圖4為以早、晚花荔枝雜交f1代真雜種dna為模板擴(kuò)增的目的片段毛細(xì)管電泳圖在672bp和657bp處左右都出現(xiàn)目的片段峰值(橫坐標(biāo)表示擴(kuò)增片段大小，縱坐標(biāo)表示信號強(qiáng)度)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種修改，這些等價變化同樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1：分子標(biāo)記celczw鑒定“三月紅”和“桂味”雜交f1代真雜種的方法(注：“三月紅”為早花荔枝，作為母本；“桂味”為晚花荔枝，作為父本)。

(1)引物的設(shè)計(jì)原理

所述分子標(biāo)記celczw開發(fā)的原理是根據(jù)lcft1基因啟動子存在兩個類型，早花荔枝屬于一個類型，晚花荔枝屬于另一個類型，在兩者lcft1基因啟動子中smallindels突變序列兩端相同的區(qū)域設(shè)計(jì)一對引物celczw-f和celczw-r(圖1)。

所述分子標(biāo)記lccezw1是由celczw-f所示的核苷酸堿基序列和celczw-r所示的核苷酸堿基序列組成。以“三月紅”dna為模板擴(kuò)增的目的片段大小為672bp，其具有如seqidno.3所示的序列；以“桂味”dna為模板擴(kuò)增的目的片段大小為657bp，其具有如seqidno.4所示的序列，比早花荔枝少15bp。

所述分子標(biāo)記celczw是由celczw-f所示的上游引物和celczw-r所示的下游引物擴(kuò)增得到；

celczw-f：5’-ttgttggcgttgtcggttctaat-3’；

celczw-r：5’-agctaagcagccacaaactcaat-3’。

(2)待檢測荔枝基因組dna的提取

采集母本“三月紅”和父本“桂味”以及它們雜交f1代幼苗植株健康的葉片，采用改良ctab法提取待檢測荔枝葉片基因組dna，具體步驟如下：

(1)將葉片材料洗凈放入液氮冷凍的研缽中，加少許不溶性的pvp，加液氮研磨成粉末；

(2)取0.5g粉末轉(zhuǎn)移至10ml離心管中并加入3ml65℃水浴的ctab提取液，劇烈震蕩，65℃水浴30-60min，每隔10min輕輕震蕩一次；

(3)加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(v/v/v：25：24：1)輕柔顛倒混勻，12000rpm離心10min；

(4)取上清，加入等體積的氯仿：異戊醇(v/v：24：1)輕柔顛倒混勻，12000rpm離心10min；

(5)取上清，加入等體積的氯仿：異戊醇(v/v：24：1)，輕柔顛倒混勻，12000rpm離心10min，取上清，加入2/3v預(yù)冷的異丙醇輕柔顛倒混勻，-20℃沉淀dna30min；

(6)12000rpm離心20min，棄上清，加70％乙醇洗滌沉淀2次；

(7)加100-300μlte緩沖液，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測其濃度與純度，最終將dna稀釋到50ng/μl，放入-20℃冰箱備用。

(3)pcr擴(kuò)增篩選

分別以母本“三月紅”和父本“桂味”以及它們雜交f1代植株的dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，其標(biāo)準(zhǔn)pcr反應(yīng)體系為25μl，具體組成如下：

dna模板1μl，celczw-f上游引物1μl，celczw-r下游引物1μl，2×taqpcrmastermix(tiangen)12.5μl，ddh2o9.5μl。

pcr具體擴(kuò)增程序如下：

94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35循環(huán)，72℃延伸10min，10℃停止。

(4)毛細(xì)管電泳檢測擴(kuò)增dna片段

從熒光選擇擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物中取1μl加入到96孔板的各孔中，再分別加入9μl去離子甲酰胺，1μlgs3730-500分子量內(nèi)標(biāo)，95℃預(yù)變性5min，4℃保溫10min后3000rpm離心1min，然后通過abi3730xldna分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳30min，電壓2kv，進(jìn)樣時間5s，熒光6-fam，用abidatacollection2.1軟件收集原始數(shù)據(jù)，再用genemarkerv1.91demo軟件對收集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，系統(tǒng)將各峰值的位置與其泳道中g(shù)s3730-500分子量內(nèi)標(biāo)做比較確定片段大小，生成圖像。

(5)“三月紅”和“桂味”雜交f1代植株真雜種鑒定

分子標(biāo)記celczw用于鑒定母本“三月紅”和父本“桂味”以及它們雜交f1代植株，如圖2所示一樣，以母本“三月紅”dna為模板，擴(kuò)增的目的片段通過毛細(xì)管電泳在672bp左右處出現(xiàn)峰值；如圖3所示一樣，以父本“桂味”dna為模板，擴(kuò)增的目的片段通過毛細(xì)管電泳在657bp處左右出現(xiàn)峰值；如圖4所示一樣，以“三月紅”和“桂味”雜交f1代植株dna為模板，擴(kuò)增的目的片段通過毛細(xì)管電泳在672bp和657bp處左右都出現(xiàn)峰值，表明為真雜種，否則為假雜種。

sequencelisting

<110>廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所

<120>一種鑒定早、晚花荔枝雜交后代真雜種的分子標(biāo)記

<130>zyws

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttgttggcgttgtcggttctaat23

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<400>3

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