本發(fā)明涉及分子檢測領域，具體涉及一種用于‘秋盛芥藍’雜交種子純度鑒定的引物及方法。

背景技術(shù)：

芥藍是起源于華南地區(qū)的一種特色葉菜，為甘藍的一個變種。‘秋盛芥藍’是以Sb06M為母本，Sb06F為父本育成的國內(nèi)首次通過品種審定的雜交種。具有生長勢強，產(chǎn)量高，抗病抗逆型強的特點。是華南地區(qū)推廣面積較多的品種。但是由于有限的親本資源以及雜交品種的不斷涌現(xiàn)，使得品種間，尤其是雜交種子之間的遺傳差異越來越小，蔬菜種子的真實性與品種純度鑒定也越來越難，加之‘秋盛芥藍’是利用自交不親和系配制而成的雜交一代，在制種過程中母本有一定的自交結(jié)實率，常常會出現(xiàn)假雜種，導致種子遺傳純度下降，給生產(chǎn)造成巨大損失。為了避免這種損失，需要對種子的純度和真?zhèn)芜M行鑒定。目前品種的純度和真?zhèn)舞b定是以形態(tài)學標記為依據(jù)，這種鑒定方法雖然從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)角度具有穩(wěn)定可靠的優(yōu)點，但是在大規(guī)模檢測中存在耗時較多，錯誤率較高的缺點，因而不利于大規(guī)模推廣。

因此為了保證優(yōu)良品種發(fā)產(chǎn)生最大的經(jīng)濟效益，因此一種快速、準確、有效的品種鑒定方法非常重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于利用SSR分子標記技術(shù)提供一種用于快速、準確鑒定“秋盛芥藍”雜交種子純度的引物及方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種用于鑒定 ‘秋盛芥藍’雜交種子純度的 SSR 分子標記組，SSR分子標記組由S69和BOE135組成。

優(yōu)選的，SSR 分子標記S69的引物對序列如下所示 ：

S69-F: 5’-TCGCCAATAGAACCCAAAACTT-3’(SEQ ID NO:3)

S69-R: 5’-CATCTCCATTGCTGCATCTGCT-3’(SEQ ID NO:4)。

優(yōu)選的，SSR 分子標記BOE135的引物對序列如下所示 ：

BOE135-F:5’-CGTGGGGGATATGGTGGTGGTTA-3’ (SEQ ID NO:5)

BOE135-R: 5’-AATGCCTGTGTTCTCCTGCTCGTC-3’ (SEQ ID NO:6)。

一種用于 ‘秋盛芥藍’雜交種子純度鑒定的方法，包括如下步驟：

1）提取芥藍幼苗基因組DNA；

以芥藍基因組DNA為模板，使用S69和/或BOE135的SSR引物進行PCR擴增；

2）對擴增的產(chǎn)物進行凝膠電泳；

對電泳結(jié)果進行分析，只有同時具有親本特異性條帶的單株做為雜交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種。

本發(fā)明的有益效果是：將‘秋盛芥藍’雜交種與其母本、父本區(qū)分開來，快速檢測出雜交種子的純度。本方法具有快速、準確、低成本，操作簡單等優(yōu)點，能夠替代傳統(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應用價值。

附圖說明

圖1為引物BOE135‘秋盛芥藍’種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜（P1：母本；P2：父本：F1為雜交一代種子）；

圖2為引物S69‘秋盛芥藍’種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜（P1：母本；P2：父本：F1為雜交一代種子）；

圖3為秋盛芥藍商品種種植后取葉片DNA進行電泳跑膠的圖片，其中P1（c條帶）為母本，P2（d條帶）為父本，1-42分別對應商品種1-42株，其中41為假雜種。

具體實施方式

一種用于鑒定 ‘秋盛芥藍’雜交種子純度的 SSR 分子標記S69，包括母本Sb06M和父本 Sb06F，其母本Sb06M的核苷酸序列如 SEQ ID NO：1所示，父本Sb06F的核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示。

優(yōu)選的，SSR分子標記S69引物對，其序列如下所示 ：

S69-F: 5’-TCGCCAATAGAACCCAAAACTT-3’(SEQ ID NO:3)

S69-R: 5’-CATCTCCATTGCTGCATCTGCT-3’(SEQ ID NO:4)。

一種用于鑒定 ‘秋盛芥藍’雜交種子純度的 SSR 分子標記BOE135引物對，其序列如下所示 ：

BOE135-F:5’-CGTGGGGGATATGGTGGTGGTTA-3’ (SEQ ID NO:5)

BOE135-R: 5’-AATGCCTGTGTTCTCCTGCTCGTC-3’ (SEQ ID NO:6)

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1 ‘秋盛芥藍’ 雜交種子純度檢測方法的建立

（1）芥藍DNA的提取

實驗材料為‘秋盛芥藍’商品種及其母本、父本幼嫩真葉DNA。步驟如下：

①用液氮在2ml的離心管內(nèi)用研杵研磨，在液氮快蒸發(fā)干時迅速加入1000μL 2%CTAB提取緩沖液，混勻后置于65℃水浴中溫浴50min（每隔5min搖動一次）。

②靜置至室溫后在4℃ 下12000rpm離心10min，將上清（約800μL）轉(zhuǎn)移到新的2ml 離心管。

③加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，靜置3-5分鐘，在4℃ 下12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中。

④加2/3體積340μL預冷的異丙醇，緩慢混勻（緩慢顛倒20次），置于－20℃下培養(yǎng)30min。

⑤在4℃下13000rpm離心10min，棄上清，加入200-300μL預冷的70%乙醇洗滌DNA沉淀（兩次），微干。

⑥加入100μL無菌水溶解。

（2）SSR-PCR 擴增：

PCR體系（20μL）

DNA模板：5ng

引物-F：0.25 mmol?L^-1

引物-R：0.25 mmol?L^-1

dNTP：0.2mmol?L^-1

Mg2+：0.15mmol?L^-1

10×PCR buffe：2.0μL

Taq酶：0.2U

ddH20補足至20μL

PCR擴增程序

94℃預變性5min后，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35個循環(huán)后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待檢測。

（3）凝膠電泳

擴增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個小時，電泳結(jié)束后進行0.1%AgNO₃銀染15min；銀染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na₂CO₃顯色，顯色后在燈箱上拍照分析。

（4）擴增結(jié)果

兩種引物在‘秋盛芥藍’父母本及雜交一代種子分別能擴增出兩條特異帶；其中BOE135引物母本p1擴增出的a條帶，母本p2號擴增出b的條帶；引物S69母本擴增出c條帶，父本擴增出d條帶。(見圖1）

回收特異條帶c和d，送上海生物工程有限公司測序。條帶的序列如SEQ ID NO:1-2所示，雜交種子中與父本、母本擴增產(chǎn)物的序列相符。

實施例2 檢測準確度驗證

采用實施例1的方法對從白云基地的種子純度鑒定田取的50株‘秋盛芥藍’，對其單株編號，提取單株DNA進行檢測（部分電泳圖見圖3），檢測結(jié)果兩個引物檢測結(jié)果一致，種子純度為98%，與田間調(diào)查結(jié)果一致，準確率為100%。

以上實施例表明，本發(fā)明的方法可將‘秋盛芥藍’雜交種子與其父母本種子進行有效區(qū)分，快速、準確檢測出種子純度。并且選取任何一個引物均能準確鑒別。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所

<120> 用于'秋盛芥藍'雜交種子純度的鑒定的引物及方法

<130> Cabbage mustard

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 280

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 1

ggatattttg tttttgatgg agacgaagca tagtcgtgat gatttggtgg atgtgcaaac 60

ttggcttggc tacgatagga tcatgactgt caatcctatt gggtacagcg gaggtctagc 120

cttgatgtgg aagaattctg taaatatcgg gtttaagttt gtagacaaga atcttgtaga 180

tttcggtgtg aagtttggca aagaatcttt ctttgtgtcg tgtgtctacg gtgaaccaat 240

ccaaggtaat agagcaaagg tgtgggaaag gttatctagg 280

<210> 2

<211> 258

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 2

taattaaaca ttagagaacc tcgatcacat caattaccaa aataacttcc gatcacatca 60

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ttagaaaaca actcaaaaaa ctaaagctct caaactcata agatatgcaa acacccttgc 240

atctctttat ataacttt 258

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

tcgccaatag aacccaaaac tt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 4

catctccatt gctgcatctg ct 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 5

cgtgggggat atggtggtgg tta 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 6

aatgcctgtg ttctcctgct cgtc 24