本發(fā)明屬于獸醫(yī)微生物領域，具體涉及一種用于快速鑒別禽多殺性巴氏桿菌致病力的培養(yǎng)基，以及利用該培養(yǎng)基鑒別禽多殺性巴氏桿菌致病力的方法。
背景技術：
：禽霍亂是由禽多殺巴氏桿菌引起的一種家禽細菌性傳染病。該病廣泛流行于世界各地，侵害各種禽類。禽霍亂以出血性敗血癥為特征，發(fā)病禽死亡率高達60％-100％，給養(yǎng)禽業(yè)造成較大的危害，多年來一直為國內外所關注，是家禽主要細菌性傳染病。目前國內通常采用藥物控制的方法減輕疫病的危害，但長期反復用藥不僅使飼養(yǎng)成本上升，而且導致細菌耐藥性增強以及藥物殘留等一系列問題，事實證明僅依賴藥物控制不是防治禽霍亂的上選對策。相比而言，采用疫苗免疫，既不會造成細菌耐藥性增強，也不會產(chǎn)生藥物殘留，因而更容易被廣大養(yǎng)殖者和消費者接受。用于預防禽霍亂的疫苗包括強毒滅活疫苗和弱毒活疫苗，其中強毒滅活疫苗免疫后只能對相同血清型的強毒攻擊提供保護，而不能獲得對不同血清型菌株的交叉免疫保護力。而弱毒活疫苗接種家禽后，可在體內增殖時產(chǎn)生具有交叉保護作用的抗原——交叉保護因子(cross-protectivefactor，CPF)，使用弱毒活疫苗具有較廣的免疫譜，可以為不同血清型強毒的攻擊提供免疫保護，因而備受關注。研制禽霍亂活疫苗的關鍵是進行弱毒菌株的篩選，即判定菌株的致病性。目前確定禽多殺性巴氏桿菌分離株的致病力主要通過動物致死性試驗進行判定，這種方法不僅消耗大量的實驗動物，而且費時費力、增加實驗成本、違反動物福利，給禽霍亂弱毒活疫苗的研制帶來了較大的難度。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的旨在提供一種用于快速鑒別禽多殺性巴氏桿菌致病力的培養(yǎng)基，以及利用該培養(yǎng)基鑒別禽多殺性巴氏桿菌致病力的方法。其原理是將禽多殺性巴氏桿菌接種于本發(fā)明提供的固體培養(yǎng)基，于40℃培養(yǎng)12-15h，在外加斜射光線條件下，通過顯微鏡觀察菌落熒光色彩的差異(強毒菌株呈現(xiàn)橙色熒光，弱毒菌株呈現(xiàn)天藍色熒光)，進而對菌株的致病性進行快速鑒別。本發(fā)明提供了一種用于鑒別禽多殺性巴氏桿菌致病性的培養(yǎng)基，其組分為：脫水小牛腦浸粉15-20g/L、胰蛋白胨10-15g/L、甘油5.0-6.0ml/L、檸檬酸鈉0.8-1.0g/L、硫酸錳0.3-0.4g/L、硫酸鎂0.15-0.2g/L、硫酸鋅0.15-0.2g/L、磷酸氫二鉀2.5-3.0g/L、卡拉膠0.2-0.3g/L、水解乳蛋白4.0-5.0g/L、葡萄糖10-12g/L、L-谷氨酸鈉1.4-1.5g/L、維生素B60.2-0.3g/L、維生素B120.15-0.2g/L、馬血清50-60ml/L、雞紅細胞裂解液4.0-5.0ml/L、純化瓊脂粉15g/L，其余為去離子水。制備以上所述的培養(yǎng)基時，需先將脫水小牛腦浸粉、胰蛋白胨、甘油、檸檬酸鈉、硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅、磷酸氫二鉀、卡拉膠、水解乳蛋白、葡萄糖、L-谷氨酸鈉、純化瓊脂粉等組分加入去離子水，加熱溶解后經(jīng)氫氧化鈉溶液調節(jié)PH至7.4，121℃滅菌15min。待冷卻至50℃后，加入馬血清、雞紅細胞裂解液和過濾除菌的維生素B6與維生素B12溶液，充分混勻后注入平板制成固體培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果在于：用本發(fā)明提供的禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)基可以直觀的進行禽多殺性巴氏桿菌菌種篩選，具有簡易、方便、快速等優(yōu)點。與傳統(tǒng)方法相比，減少了實驗動物的用量，同時改善了動物福利，縮短了實驗周期。研究表明，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基可以使禽多殺性巴氏桿菌菌落具有典型的致病力鑒別特性，即使多次傳代后仍可穩(wěn)定保持菌落原有的熒光鑒別特性。具體實施方式下面的實施例是對本發(fā)明的進一步詳細描述。實施例1取脫水小牛腦浸粉20g、胰蛋白胨10g、甘油5.0ml、檸檬酸鈉0.8g、硫酸錳0.3g、硫酸鎂0.2g、硫酸鋅0.2g、磷酸氫二鉀3.0g、卡拉膠0.2g、水解乳蛋白5.0g、葡萄糖12g、L-谷氨酸鈉1.5g和純化瓊脂粉15g加入900ml去離子水中，加熱至沸騰，并不斷攪拌直至混合液完全溶解，用氫氧化鈉溶液調節(jié)PH值至7.4，121℃滅菌15min。滅菌后待冷卻至50℃，分別加入馬血清50ml、雞紅細胞裂解液5.0ml、過濾除菌的1％維生素B6溶液20ml(含維生素B60.2g)和1％維生素B12溶液20ml(含維生素B60.2g)，充分混勻后注入滅菌平板，每副平板約15ml，凝固后得到禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)基。實施例2取脫水小牛腦浸粉15g、胰蛋白胨15g、甘油6.0ml、檸檬酸鈉1.0g、硫酸錳0.4g、硫酸鎂0.15g、硫酸鋅0.15g、磷酸氫二鉀2.5g、卡拉膠0.3g、水解乳蛋白4.0g、葡萄糖10g、L-谷氨酸鈉1.4g和純化瓊脂粉15g加入900ml去離子水中，加熱至沸騰，并不斷攪拌直至混合液完全溶解，用氫氧化鈉溶液調節(jié)PH值至7.4，121℃滅菌15min。滅菌后待冷卻至50℃，分別加入馬血清60ml、雞紅細胞裂解液4.0ml、過濾除菌的2％維生素B6溶液15ml(含維生素B60.3g)和1％維生素B12溶液15ml(含維生素B60.15g)，充分混勻后注入滅菌平板，每副平板約15ml，凝固后得到禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)基。實施例3將6株已知致病力的禽多殺性巴氏桿菌強毒菌株或弱毒菌株接種于按實施例1所述方法制成的禽多殺性巴氏桿菌固體培養(yǎng)基，40℃培養(yǎng)12h后取出，在外加45°斜射光線條件下，通過解剖顯微鏡觀察菌落的熒光色彩，結果顯示3株已知為強毒菌株的禽多殺性巴氏桿菌(C48-1、X73和P1059)均呈現(xiàn)橙色熒光，而3株已知為弱毒菌株的禽多殺性巴氏桿菌(CU、P7810和1010)均呈現(xiàn)天藍色熒光(表1)，與本發(fā)明的鑒別方法相符。結果表明，使用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基可以通過菌落熒光色彩的差異將強毒菌株和弱毒菌株進行直觀的鑒別。表1不同致病力的禽多殺性巴氏桿菌菌落熒光色彩菌株編號來源分離宿主致病力菌落熒光色彩C48-1中國標準株雞強毒菌株橙色X73國際標準株雞強毒菌株橙色P1059國際標準株火雞強毒菌株橙色CU美國疫苗株火雞弱毒菌株天藍色P7810中國疫苗株鴨弱毒菌株天藍色1010中國疫苗株雞弱毒菌株天藍色實施例4使用本發(fā)明所述的方法對234株禽多殺性巴氏桿菌分離株(所有禽多殺性巴氏桿菌分離株均由江蘇省家禽科學研究所保存提供，其中雞源分離株98株，鴨源分離株64株，鵝源分離株61株，火雞源分離株11株)進行致病力鑒別。將234株分離株接種實施例1所述方法制成的禽多殺性巴氏桿菌固體培養(yǎng)基，40℃培養(yǎng)15h后取出，在外加45°斜射光線條件下，通過解剖顯微鏡觀察菌落的熒光色彩，結果見表2。由表可見，234株禽多殺性巴氏桿菌分離株中菌落熒光色彩為橙色的菌株占96.2％(225/234)，而熒光色彩為天藍色的菌株僅占3.8％(9/234)，按本發(fā)明所述的方法判定強毒菌株有225株，弱毒菌株有9株。表2234株禽多殺性巴氏桿菌分離株菌落分型為了進一步驗證本發(fā)明方法的準確性，從所述234個分離株中選取22株(包括13株強毒株和所有9株弱毒株)。分離株經(jīng)腦心浸液肉湯增菌后，以1×103菌落形成單位(colonyformingunits，CFU)的劑量對3月齡非免疫雞進行頸部皮下注射攻毒(每個分離株攻毒5只非免疫雞)，連續(xù)觀察14天，死亡率達到80％以上的分離株為強毒株，死亡率低于20％的分離株為弱毒株。結果見表3，由表可見9株菌落熒光色彩為天藍色的禽多殺性巴氏桿菌分離株注射攻毒后，所有試驗雞均存活，表明上述菌株均為弱毒菌株。而13株菌落熒光色彩為橙色的禽多殺性巴氏桿菌分離株注射攻毒后，除D002分離株動物存活率為20％(1/5)，其余12株分離株的致死率均為100％(5/5)，表明這13株菌株均為強毒菌株。上述結果表明，使用本發(fā)明所述的禽多殺性巴氏桿菌致病力鑒別方法與動物致死性試驗結果完全一致。表3禽多殺性巴氏桿菌分離株動物致病性試驗實施例5選取10株已知致病力的禽多殺性巴氏桿菌，分別在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基和本發(fā)明提供的培養(yǎng)基上不加選擇地連續(xù)傳代30次，每10代觀察記錄菌落熒光色彩，結果見表4。結果表明，無論是強毒菌株還是弱毒菌株，在本發(fā)明提供的培養(yǎng)基上傳代30次后其菌落熒光色彩仍具有典型的鑒別特性。而在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基3種禽多殺性巴氏桿菌常用培養(yǎng)基上的菌落在有無熒光、熒光亮度和熒光色彩等方面均顯著不如本發(fā)明的提供的培養(yǎng)基，且連續(xù)傳代導致菌落熒光色彩發(fā)生較大變異，無論是強毒菌株還是弱毒菌株，在上述3種培養(yǎng)基上連續(xù)傳代30代以后其菌落均完全觀察不到熒光。上述結果表明，使用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基可以使禽多殺性巴氏桿菌菌落具有典型的致病力鑒別特性，即使多次傳代后仍可穩(wěn)定保持菌落原有的熒光鑒別特性。表4禽多殺性巴氏桿菌在不同培養(yǎng)基傳代后的熒光特性盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。當前第1頁1 2 3