真菌熒光染色液及其染色方法與流程

文檔序號：12457459閱讀：7370來源：國知局

本發(fā)明涉及熒光染色液領域，尤其涉及一種真菌熒光染色液及其染色方法。

背景技術(shù)：

真菌是一種真核生物，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上萬種真菌，而這些真菌中，對人類有致病性的約有300多個種類。除新型隱球菌、念珠菌和蕈外，醫(yī)學上有意義的致病性真菌幾乎都是霉菌。真菌具有堅固的細胞壁和真正的細胞核，以寄生或腐生方式生存，典型者兼有有性生殖和無性生殖，產(chǎn)生各種形態(tài)的袍子。

真菌容易引起真菌性皮膚病，也稱皮膚真菌病，該疾病是指由病原真菌所引起的人類皮膚以及黏膜、毛發(fā)和甲等皮膚附屬器的一大類感染類疾病。其分為淺部真菌病和深部真菌病兩大類，在中國90％以上的真菌病屬于淺部真菌病，該類真菌只侵犯表、角質(zhì)層、毛發(fā)和甲板，臨床上多呈水皰鱗屑型表現(xiàn)，損害多限于一側(cè)，初發(fā)生小水皰，數(shù)目多不一，皰液干涸后脫屑，范圍日漸擴大，久之脫屑處皮膚粗糙增厚，皮紋寬深，失去正常的光澤，柔韌性，觸之有粗沙感。侵犯皮下組織和內(nèi)臟的稱深部真菌病。深部真菌病指的是致病性真菌侵犯皮下組織、黏膜和內(nèi)臟，感染器所引起的真菌感染性疾病。

為了判斷皮膚性疾病是否是真菌感染引起的，通常采用熒光染色液，熒光染色中含有熒光素，熒光素能夠與各類真菌細胞壁上的多糖、幾丁質(zhì)高親和力結(jié)合從而發(fā)出熒光，但是現(xiàn)有的熒光染色液無法檢測卡式肺袍子蟲囊腫、寄生物，以及各種地域性變異真菌菌絲，檢測適用性低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種真菌熒光染色液及其染色方法，能夠解決現(xiàn)有熒光染色液檢測適用性低的技術(shù)問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

一種真菌熒光染色液，包括染色A液和染色B液；

所述染色A液包括0.03～0.1重量份的熒光素、1～5重量份的清潔劑和80～150重量份的水；

所述染色B液包括0.3～1重量份的染料和80～150重量份的水。

優(yōu)選地，所述熒光素選擇異硫氰酸熒光素，羧基熒光素、四氯熒光素、六氯熒光素、羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素、羧基四甲基羅丹明中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述清潔劑選自醇醚硫酸紙、醇硫酸酯、烷醇酰胺、烷基磺酸枝、氧化胺、兩性清潔劑、陰離子清潔劑、甜菜堿衍生物、陽離子清潔劑、二黃酸酯、十二烷基苯磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯水溶助長劑、月桂醇硫酸酯、甘油單酯、甘油二酯、非離子清潔劑、磷酸酯、脫水山梨糖醇衍生物和強堿中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述染料為伊文思藍臺盼藍、滂胺天藍、直接綠26、酸性綠125或媒介綠17。

優(yōu)選地，還包括0.005～0.02重量份的熒光增白劑，所述熒光增白劑選自香豆素型熒光增白劑、吡唑啉型熒光增白劑和苯二甲酰亞胺型熒光增白劑中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了上述真菌熒光染色液的染色方法，包括以下步驟：

a)將載有樣本的載破片上滴加滴染色A液，染色A液以覆蓋或淹沒整個樣本為準；室溫染色1～3min；

b)再滴加染色B液，染色B液以覆蓋或淹沒整個樣品為準，室溫染色1～3min；蓋上蓋玻片，用棉簽吸去多余染色液；

c)置于熒光顯微鏡下觀察。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供的真菌熒光染色液，染色A液能夠與各類真菌中的細胞壁β-多糖結(jié)合，從而標記熒光進行檢測；染色B液作為復染液，用于減少熒光背景；以染色A液、染色B液構(gòu)成的真菌熒光染色液是一種快速真菌感染檢測產(chǎn)品，其能夠與各種真菌結(jié)合發(fā)出熒光，從而能夠檢測各種疑似真菌感染疾病，是否為真菌感染。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種真菌熒光染色液及其染色方法，本領域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所述類似的替換和改動對本領域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及引用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明提供了一種真菌熒光染色液，包括染色A液和染色B液；

染色A液包括0.03～0.1重量份的熒光素、1～5重量份的清潔劑和80～150重量份的水；

染色B液包括0.3～1重量份的染料和80～150重量份的水。

本發(fā)明中，染色A液能夠與各類真菌中的細胞壁β-多糖結(jié)合，從而標記熒光進行檢測；染色B液作為復染液，用于減少熒光背景；以染色A液、染色B液構(gòu)成的真菌熒光染色液是一種快速真菌感染檢測產(chǎn)品，其能夠與各種真菌結(jié)合發(fā)出熒光，從而能夠檢測各種疑似真菌感染疾病，是否為真菌感染。

在本發(fā)明的實施例中，熒光素選自異硫氰酸熒光素，羧基熒光素、四氯熒光素、六氯熒光素、羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素、羧基四甲基羅丹明中的一種或多種；在本發(fā)明的其他實施例中，所述熒光素選自異硫氰酸熒光素，羧基熒光素、六氯熒光素、羧基四甲基羅丹明中的一種或兩種。

在本發(fā)明中，染色A液中熒光素的重量分數(shù)為0.03～0.1份；在本發(fā)明的實施例中，熒光素的重量分數(shù)為0.05～0.07份。

在本發(fā)明的實施例中，清潔劑選自醇醚硫酸酯、醇硫酸酯、烷醇酰胺、烷基磺酸枝、氧化胺、兩性清潔劑、陰離子清潔劑、甜菜堿衍生物、陽離子清潔劑、二黃酸酯、十二烷基苯磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯水溶助長劑、月桂醇硫酸酯、甘油單酯、甘油二酯、非離子清潔劑、磷酸酯、脫水山梨糖醇衍生物和強堿中的一種或多種。在本發(fā)明的其他實施例中，清潔劑選自非離子清潔劑、兩性清潔劑、陰離子清潔劑、陽離子清潔劑、強堿中的一種或兩種。

其中，非離子清潔劑選自十乙二醇單十二烷基醚、辛?；?N-甲基葡糖酰胺、癸?；?N-甲基葡糖酰胺、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、異十三烷基-聚(乙二醇醚)N、N-癸?；?N-甲基葡糖胺、正癸基-A,D-吡喃葡萄糖苷、癸基-P-D-吡喃麥芽糖苷、正月桂?；?N-甲基葡糖胺、正十二烷基-A,D-麥芽糖苷、正十二烷基-P-D-麥芽糖苷、七乙二醇單癸基醚、七乙二醇單十四烷基醚、正十六烷基-P-D-麥芽糖苷、七乙二醇單十八烷基醚、七乙二醇單十四烷基醚、辛基苯基-聚乙二醇、九乙二醇單十二烷基醚、N-壬酰-N-甲基葡糖胺、八乙二醇單癸基醚、八乙二醇單十二烷基醚、八乙二醇單十六烷基醚、八乙二醇單十八烷基醚、八乙二醇單十四烷基醚、、五乙二醇單十二烷基醚、五乙二醇單十六烷基醚、五乙二醇單己基醚、五乙二醇單十八烷基醚、五乙二醇單辛基醚、五乙二醇單甘油二醚、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、脫水山梨糖醇三硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯、脫水山梨糖醇三油酸酯、十四烷基-P-D-麥芽糖苷、四乙二醇單癸基醚、四乙二醇單十二烷基醚、四乙二醇單十四烷基醚、三乙二醇單癸基醚、三乙二醇單十二烷基醚、三乙二醇單十六烷基醚、三乙二醇單辛基醚、三乙二醇單十四烷基醚、聚乙二醇4-叔辛基苯基醚、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯中的一種或多種。

陰離子清潔劑選自鵝去氧膽酸、膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、毛地黃皂苷、毛地黃毒苷配基、N,N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、多庫酯鈉、甘氨鵝去氧膽酸鈉、甘氨膽酸、甘氨去氧膽酸、甘氨石膽酸3-硫酸二鈉鹽、甘氨石膽酸乙酯、N-月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸鋰、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、可選取代的十二烷基硫酸鈉、辛基硫酸鈉、?；悄懰徕c、?；蛆Z去氧膽酸鈉、豬磺去氧膽酸鈉、?；鞘懰?-硫酸二鈉鹽、牛磺熊去氧膽酸鈉鹽中的一種或多種。

陽離子清潔劑選自溴化烷基三甲銨、氯化苯甲羥銨、氯化苯甲基二甲基十六烷基銨、氯化苯甲基二甲基十四烷基銨、溴化苯甲基十二烷基二甲銨、四氯碘酸苯甲基三甲銨、溴化二甲基雙十八烷基銨、溴化十二烷基乙基二甲銨、溴化十二烷基三甲銨、溴化乙基十六烷基二甲銨中的一種或多種

兩性離子清潔劑選自3-{(3-膽酰氨基丙基)-二甲銨卜L-丙烷-磺酸酯、3-{(3-膽酰氨基丙基)二甲銨}-2-羥基-1-丙烷-磺酸酯、3-(癸基二甲銨)丙磺酸酯、3-(十二烷基二甲銨)丙磺酸酯、3-(N,N-二甲基十四烷基銨)丙磺酸酯、3-(N,N-二甲基十八烷基銨)丙磺酸酯、3-(N,N-二甲基辛基銨)丙磺酸酯和3-(N,N-二甲基椋櫚基銨)丙磺酸酯中的一種或多種。

強堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種或兩種。

在本發(fā)明中，染色A液中清潔劑的重量分數(shù)為1～5份；在本發(fā)明的實施例中，清潔劑的重量分數(shù)為2～3.5份。

在本發(fā)明實施例中，染色A液中水為純水或超純水。

在本發(fā)明中，染色A液中水的重量分數(shù)為80～150份；在本發(fā)明的實施例中，水的重量分數(shù)為100～130份。

在本發(fā)明的實施例中，為了降低熒光背景的影響，染料為伊文思藍、臺盼藍、滂胺天藍、直接綠26、酸性綠125或媒介綠17；在本發(fā)明的其他實施例中，染料為伊文思藍、臺盼藍、直接綠26或媒介綠17。

在本發(fā)明中，染色B液中染料的重量分數(shù)為0.3～1份；在本發(fā)明的實施例中，染料的重量分數(shù)為0.5～0.7份。

在本發(fā)明的實施例中，染料B液中水為純水或超純水。

在本發(fā)明中，水的重量分數(shù)為80～150份；在本發(fā)明的實施例中，水的重量分數(shù)為100～130份。

本發(fā)明還提供了上述真菌熒光染色液的染色方法，包括以下步驟：

a)將載有樣本的載破片上滴加滴染色A液，染色A液以覆蓋或淹沒整個樣本為準；室溫染色1～3min；

b)再滴加染色B液，染色B液以覆蓋或淹沒整個樣品為準，室溫染色1～3min；蓋上蓋玻片，用棉簽吸去多余染色液；

c)置于熒光顯微鏡下觀察。

本發(fā)明提供的真菌熒光染色液的染色方法簡單，制片時間短，利于觀察者清楚地觀察樣本，直接讀取真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而能夠判斷各種疑似真菌感染是否為真菌感染。

為了進一步說明本發(fā)明，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的真菌熒光染色液及其染色方法進行詳細描述。

實施例1

染色A液包括0.1g羧基熒光素、5g3-(N,N-二甲基十四烷基銨)丙磺酸酯和150g水；染色B液包括1g滂胺天藍、0.005g香豆素型熒光增白劑和80g水。

樣品為56歲女性患者的進行肺移植的痰液；

在載有痰液樣品的載玻片上滴加1滴染色A液，染色1min；再在載玻片上滴加1滴染色B液，染色1min；蓋上蓋玻片，拭去多余染色液，并置于熒光顯微鏡下觀察，并觀察到菌體發(fā)射的熒光。

實施例2

染色A液包括0.03g四氯熒光素、1g氯化苯甲基二甲基十四烷基銨和80g水；染色B液包括0.3g媒介綠17、0.02g吡唑啉型熒光增白劑和130g水。

樣品為28歲女性的尿液；

在載有尿液樣品的載玻片上滴加1滴染色A液，染色3min；再在載玻片上滴加1滴染色B液，染色1min；蓋上蓋玻片，拭去多余染色液，并置于熒光顯微鏡下觀察，并觀察到菌體發(fā)射的熒光。

實施例3

染色A液包括0.05g六氯熒光素、2g甘氨去氧膽酸和130g水；染色B液包括0.5g直接綠26、0.01g吡唑啉型熒光增白劑和100g水。

樣品為9歲男童的傷口皮屑；

在載有尿液樣品的載玻片上滴加1滴染色A液，染色2min；再在載玻片上滴加1滴染色B液，染色1min；蓋上蓋玻片，拭去多余染色液，并置于熒光顯微鏡下觀察，并觀察到菌體發(fā)射的熒光。

實施例4

染色A液包括0.07g羧基四甲基羅丹明、3.5g正辛基葡萄糖苷和100g水；染色B液包括0.7g臺盼藍、0.01g苯二甲酰亞胺型熒光增白劑和150g水。

樣品為40歲男性的胸水；

實施例5