本發(fā)明涉及船舶攜帶的壓載水中生物活體的檢測方法及裝置，詳細(xì)講是一種檢測精度高、數(shù)據(jù)真實可靠的船舶壓載水中10-50um生物快速檢測方法及裝置。

背景技術(shù)：

我們知道，遠(yuǎn)洋運(yùn)輸船舶為了保證船舶穩(wěn)定性，一般在始發(fā)港口加裝壓載水，待?？吭谀康母劭跁r再排放壓載水，其所攜帶的生物會給目的港口國帶來生物入侵風(fēng)險。為了應(yīng)對此問題，國際海事組織（IMO）、美國海岸警衛(wèi)隊（USCG）和美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）均制定了相應(yīng)的生物入侵應(yīng)對措施和壓載水排放控制公約，要求多數(shù)商業(yè)運(yùn)輸船舶必須加裝壓載水處理設(shè)備（BWTS）以處理壓載水。IMO G8導(dǎo)則和USCG參考的ETV草案明確規(guī)定了排放壓載水中生物的尺寸及存活生物濃度，如下所示：

最小尺寸大于或等于 50μm 的存活生物少于 10 個/m³；

最小尺寸小于 50μm 但大于或等于 10μm 的存活生物少于10個/ml；

且作為人體健康標(biāo)準(zhǔn)，指標(biāo)微生物小于下述濃度：

有毒霍亂弧菌 (血清型 O1 和 O139)少于1 cfu/100ml；

大腸桿菌：少于250 cfu/100ml；

腸道球菌：少于100 cfu/100ml。

目前，IMO國際壓載水公約還未生效，但生效日期也已臨近。USCG已經(jīng)單方面宣布其規(guī)范生效，強(qiáng)制規(guī)定凡進(jìn)入美國水域的商業(yè)運(yùn)輸船舶必須安裝符合USCG規(guī)范和排放標(biāo)準(zhǔn)的BWTS，否則無法靠港進(jìn)行相關(guān)作業(yè)。因各個水域的水質(zhì)和生物分布情況有所差異，船舶所安裝的BWTS不能保證每次排放的壓載水都能滿足排放標(biāo)準(zhǔn)，必須在靠近港口國排放前自行檢測目標(biāo)生物含量，因此，船上檢測人員必須具有豐富的生物基礎(chǔ)知識和檢測經(jīng)驗，同時配備先進(jìn)的生物檢測儀器。對于絕大多數(shù)船舶設(shè)施和船員知識水平來說，很難滿足此要求。

一般來說，10-50um生物主要為單細(xì)胞藻類，因其物種特殊性，既不能通過過濾方法完全去除，也不能通過紫外照射或化學(xué)方法完全滅殺，且種類繁多，已成為壓載水中生物檢測的難點?，F(xiàn)有的快速檢測裝置是根據(jù)藻類葉綠素的含量預(yù)估藻細(xì)胞數(shù)量，經(jīng)實驗表明，部分已死亡藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素仍然能保持完整，依據(jù)葉綠素含量判定細(xì)胞存活狀態(tài)的方法誤差大、可靠性低，甚至出現(xiàn)誤判。另一方面，現(xiàn)有的的檢測設(shè)備會將一些10um以下的藻細(xì)胞也計入，檢測數(shù)據(jù)不精準(zhǔn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種結(jié)構(gòu)簡單、使用方便，檢測速度快、精度高，數(shù)據(jù)真實可靠的船舶壓載水中10-50um生物快速檢測方法及裝置。

本發(fā)明解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足所采用的技術(shù)方案是：

一種船舶壓載水中10-50um生物快速檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)使用大孔徑過濾器將經(jīng)壓載水處理設(shè)備處理后的（待排放的）壓載水樣品中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；

（2）取Aml濾出液，使用小孔徑過濾器過濾并截留濾出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物隨液體濾出；

（3）使用3-10%Aml的清洗液反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；

（4）向樣品槽內(nèi)加入活細(xì)胞熒光染色劑，染色5-30（10）分鐘；

（5）染色后，向樣品槽內(nèi)加入其內(nèi)液體體積0.5-2倍的細(xì)胞裂解液；

（6）待細(xì)胞（膜）充分裂（溶）解后，使用熒光計檢測樣品槽內(nèi)液體的相對熒光強(qiáng)度；

相對熒光強(qiáng)參考值的獲取方法如下：

a、選用已知符合壓載水處理D-2標(biāo)準(zhǔn)中對10-50um存活生物的規(guī)定、含10-50um存活生物個數(shù)達(dá)到上限的水樣作為參考檢測樣品，使用大孔徑過濾器將參考檢測樣品中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；

b、取Aml濾出液，使用小孔徑過濾器過濾并截留濾出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物隨液體濾出；

c、使用3-10%Aml的清洗液反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；

d、向樣品槽內(nèi)加入活細(xì)胞熒光染色劑，染色5-30（10）分鐘；

e、染色后，向樣品槽內(nèi)加入其內(nèi)液體體積0.5-2倍的細(xì)胞裂解液；

f、待細(xì)胞充分裂解后，使用熒光計檢測樣品槽內(nèi)液體的相對熒光強(qiáng)度；

g、按步驟a中參考檢測樣品的選取標(biāo)準(zhǔn)選取1-100種不同的參考檢測樣品，每種參考檢測樣品按步驟a、b、c、d、e、f的操作方法檢測至少一次，根據(jù)所得數(shù)據(jù)求出平均相對熒光強(qiáng)度值，該平均相對熒光強(qiáng)度值為相對熒光強(qiáng)度參考值；

將第（6）步獲得的相對熒光強(qiáng)度值與第g步獲得的相對熒光強(qiáng)度參考值對比，判斷該壓載水樣品是否符合排放標(biāo)準(zhǔn)。

本發(fā)明中第a步中所述的參考檢測樣品經(jīng)如下方法獲得：使用大孔徑過濾器將經(jīng)壓載水處理設(shè)備處理后的（待排放的）壓載水樣品中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；取Aml濾出液，使用小孔徑過濾器過濾并截留濾出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物隨液體濾出；使用3-10%Aml的清洗液反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；將樣品槽內(nèi)的液體經(jīng)FDA-CMFDA法在熒光顯微鏡下檢測，其中10-50um存活生物的含量符合要求時，即可成為參考檢測樣品。

本發(fā)明中第a步中所述的參考檢測樣品也可經(jīng)如下方法獲得：人工配制藻類溶液或自然海水經(jīng)紫外線（UV）處理或經(jīng)次氯酸鈉（NaClO）處理，得測試液；使用大孔徑過濾器將測試液中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；取Aml濾出液，使用小孔徑過濾器過濾并截留濾出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物隨液體濾出；使用3-10%Aml的清洗液反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；將樣品槽內(nèi)的液體經(jīng)FDA-CMFDA法在熒光顯微鏡下檢測，其中10-50um存活生物的含量符合要求時，即可成為參考檢測樣品。

本發(fā)明中所述的大孔徑過濾器為使用網(wǎng)孔對角線長度為35-50um的尼龍篩絹制成的過濾器；所述的小孔徑過濾器為使用絕對孔徑為10um 的微孔濾膜制成的、可以反沖洗的過濾器；

本發(fā)明中所述活細(xì)胞熒光染色劑為FDA或/和CMFDA，其加入量根據(jù)樣品槽內(nèi)液體體積、以1-3mg/ml（2mg/ml）的比例加入。染色反應(yīng)時間為5-30（10）分鐘。FDA為熒光素二乙酸酯。

本發(fā)明中所述的清洗液是BES、MOPS、PBS（pH=7.0）、Tris-HCl(0.2-1.0M，pH=6.0-7.2)中的至少一種。可以有效防止FDA或CMFDA的非生物水解。

本發(fā)明中所述細(xì)胞裂解液為甲醇與氯仿（體積比1:1-1:3）的混合液或丙酮中的一種。

一種船舶壓載水中10-50um生物快速檢測裝置，其特征在于包括樣品箱、沖洗液箱、裂解液箱、廢水箱、檢測箱、一級過濾器和二級濾器，一級過濾器的出口與樣品箱進(jìn)口相連，檢測箱上設(shè)有染色劑加入口，樣品箱、沖洗液箱和染色劑箱的出口上分別設(shè)有樣品泵、沖洗泵和裂解泵，樣品泵的出口經(jīng)過濾閥與二級過濾器的一端口相連，二級過濾器的另一端口經(jīng)沖洗閥與沖洗泵出口相連，二級過濾器與沖洗閥間的連接管經(jīng)排液閥與廢水箱相連，檢測箱的進(jìn)液口經(jīng)進(jìn)液閥與過濾閥和二級過濾器間的連接管路相連，裂解泵出口與檢測箱相連，檢測箱上設(shè)有熒光計。

本發(fā)明中所述的一級過濾器為網(wǎng)孔對角線長度為35-50um的尼龍篩絹；二級濾器為絕對孔徑為10um 的微孔濾膜；熒光計的發(fā)射光波長為460-490nm，接收的激發(fā)光波長為510-550nm。所述的檢測箱下部經(jīng)排放閥與廢水箱相連。

本發(fā)明中所述的10-50um生物是指：尺寸小于50um但大于或等于10um的存活生物。

使用本發(fā)明的裝置及方法來檢測待排放的船舶壓載水中10-50um生物時，首先按照相對熒光強(qiáng)參考值的獲取方法來測試出使用特定的某種清洗液、活細(xì)胞熒光染色劑、細(xì)胞裂解液組合時的相對熒光強(qiáng)度參考值；在船舶需要檢測時，使用該特定的清洗液、活細(xì)胞熒光染色劑、細(xì)胞裂解液的組合按照步驟1-6檢測出相對熒光強(qiáng)度，當(dāng)相對熒光強(qiáng)度不大于相對熒光強(qiáng)度參考值時，說明待排放的船舶壓載水符合排放標(biāo)準(zhǔn)，反之說明待排放的船舶壓載水不符合排放標(biāo)準(zhǔn)，使用相同的各種試劑的情況下，相對熒光強(qiáng)度參考值僅需檢驗一次，即可在多次、甚至無數(shù)次檢驗中成為參考值，有此參考值得情況下，本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡單、使用方便，檢測速度快、精度高，數(shù)據(jù)真實可靠。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中速檢測裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是本發(fā)明中相對熒光強(qiáng)度與四爿藻活細(xì)胞含量之間的對應(yīng)關(guān)系圖。

具體實施方式

一種船舶壓載水中10-50um生物快速檢測方法，包括如下步驟：

(1)使用大孔徑過濾器將經(jīng)壓載水處理設(shè)備處理后的待排放的壓載水樣品中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；

（2）取Aml濾出液，使用小孔徑過濾器過濾并截留濾出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物隨液體濾出；

（3）使用3-10%Aml的清洗液反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；

（4）向樣品槽內(nèi)加入活細(xì)胞熒光染色劑，染色5-30分鐘；

（5）染色后，向樣品槽內(nèi)加入其內(nèi)液體體積0.5-2倍的細(xì)胞裂解液；

（6）待細(xì)胞充分裂解后，使用熒光計檢測樣品槽內(nèi)液體的相對熒光強(qiáng)度；

相對熒光強(qiáng)參考值的獲取方法如下：

a、選用已知符合壓載水處理D-2標(biāo)準(zhǔn)中對10-50um存活生物的規(guī)定、含10-50um存活生物個數(shù)達(dá)到上限的水樣作為參考檢測樣品；使用大孔徑過濾器將參考檢測樣品中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；

b、取Aml濾出液，使用小孔徑過濾器過濾并截留濾出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物隨液體流出；

c、使用3-10%Aml的清洗液反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；

d、向樣品槽內(nèi)加入活細(xì)胞熒光染色劑，染色5-30（10）分鐘；

e、染色后，向樣品槽內(nèi)加入其內(nèi)液體體積0.5-2倍的細(xì)胞裂解液；

f、待細(xì)胞（膜）充分裂（溶）解后，使用熒光計檢測樣品槽內(nèi)液體的相對熒光強(qiáng)度；

g、按步驟a中參考檢測樣品的選取標(biāo)準(zhǔn)選取1-100種不同的參考檢測樣品，每種參考檢測樣品按步驟a、b、c、d、e、f的操作方法檢測至少一次，根據(jù)所得數(shù)據(jù)求出平均相對熒光強(qiáng)度值，該平均相對熒光強(qiáng)度值為相對熒光強(qiáng)度參考值；

將第（6）步獲得的相對熒光強(qiáng)度值與第g步獲得的相對熒光強(qiáng)度參考值對比，判斷該壓載水樣品是否符合排放標(biāo)準(zhǔn)。

其中A為任何數(shù)值，優(yōu)選100-500的自然數(shù)。

本發(fā)明中第a步中所述的參考檢測樣品經(jīng)如下方法獲得：使用大孔徑過濾器將經(jīng)壓載水處理設(shè)備處理后的待排放的壓載水樣品中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；取Aml濾出液，使用小孔徑過濾器過濾并截留濾出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物隨液體濾出；使用3-10%Aml的清洗液反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；將樣品槽內(nèi)的液體經(jīng)FDA-CMFDA法在熒光顯微鏡下檢測，其中10-50um存活生物的含量符合要求時，該經(jīng)壓載水處理設(shè)備處理后的待排放的壓載水樣品即可成為參考檢測樣品。

本發(fā)明中第a步中所述的參考檢測樣品也可經(jīng)如下方法獲得：人工配制藻類溶液或自然海水經(jīng)紫外線（UV）處理或經(jīng)次氯酸鈉（NaClO）處理，得測試液；使用大孔徑過濾器將測試液中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；取Aml濾出液，使用小孔徑過濾器過濾并截留濾出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物隨液體濾出；使用3-10%Aml的清洗液反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；將樣品槽內(nèi)的液體經(jīng)FDA-CMFDA法在熒光顯微鏡下檢測，其中10-50um存活生物的含量符合要求時，該經(jīng)壓載水處理設(shè)備處理后的待排放的壓載水樣品即可成為參考檢測樣品。

更進(jìn)一步的，所述的大孔徑過濾器為使用網(wǎng)孔對角線長度為35-50um的尼龍篩絹制成的過濾器；所述的小孔徑過濾器為使用絕對孔徑為10um 的微孔濾膜制成的、可反沖洗的過濾器。所述活細(xì)胞熒光染色劑為FDA或/和CMFDA，其加入量根據(jù)樣品槽內(nèi)液體體積、以1-3mg/ml（2mg/ml）的比例加入。染色反應(yīng)時間為5-30（10）分鐘。FDA為熒光素二乙酸酯；所述的清洗液是BES、MOPS、PBS（pH=7.0）、Tris-HCl(0.2-1.0M，pH=6.0-7.2)中的至少一種，可有效防止FDA或CMFDA的非生物水解。其中PBS為：硫化鉛、Tris-HCl為：三（羥甲基）氨基甲烷。所述的細(xì)胞裂解液為甲醇與氯仿（體積比1:1-1:3）的混合液或丙酮中的一種。

用于實現(xiàn)上述檢測方法的船舶壓載水中10-50um生物快速檢測裝置，結(jié)構(gòu)如圖1所示：包括樣品箱2、沖洗液箱13、裂解液箱3、廢水箱14、檢測箱17、一級過濾器1和二級濾器8，一級過濾器1為使用網(wǎng)孔對角線長度為50um的尼龍篩絹制成的過濾器；二級濾器是使用絕對孔徑為10um的微孔濾膜制成的過濾器。一級過濾器的出口與樣品箱2進(jìn)口相連，經(jīng)一級過濾器過濾后的液體進(jìn)入與樣品箱2內(nèi)一級過濾器和樣品箱2間連接管路上可以設(shè)有一級泵，也可以是一級過濾器設(shè)在樣品箱2上方，利用液體的重力自然流入。檢測箱17上設(shè)有染色劑加入口12，樣品箱2、沖洗液箱14和裂解液箱3的出口上分別設(shè)有樣品泵4、沖洗泵13和裂解泵5，樣品泵4的出口經(jīng)過濾閥6與二級過濾器8的一端口相連，二級過濾器8的另一端口經(jīng)沖洗閥11與沖洗泵13出口相連，二級過濾器8與沖洗閥11間的連接管經(jīng)排液閥10與廢水箱15相連，檢測箱17的進(jìn)液口經(jīng)進(jìn)液閥9與過濾閥6和二級過濾器8間的連接管路相連，裂解泵5出口經(jīng)裂解閥7與檢測箱17相連，檢測箱17上設(shè)有熒光計18，熒光計18的檢測探頭設(shè)在檢測箱17內(nèi)；熒光計的發(fā)射光波長為460-490nm，接收的激發(fā)光波長為510-550nm；所述的檢測箱下部經(jīng)排放閥16與廢水箱15相連。

本發(fā)明中所述的10-50um生物是指：尺寸小于50um但大于或等于10um的存活生物。

船舶壓載水中10-50um生物快速檢測裝置工作時，將待檢測的壓載水樣品放入一級過濾器內(nèi)，一級過濾器將壓載水樣品中不小于50um的存活生物濾出，經(jīng)其過濾后的濾出液進(jìn)入樣品箱內(nèi)，向沖洗液箱和裂解液箱內(nèi)分別加入清洗液和細(xì)胞裂解液；打開過濾閥和排液閥，其它閥門關(guān)閉，樣品泵工作，定量的將樣品箱內(nèi)的濾出液經(jīng)二級過濾器過濾，濾出的液體排入廢水箱內(nèi)，而不小于10um的存活生物被二級過濾器截留；關(guān)閉過濾閥和排液閥，此時染色閥和排放閥也處于關(guān)閉狀態(tài)，打開沖洗閥和進(jìn)液閥，沖洗泵工作，使用定量的沖洗液對二級過濾器反沖洗，將其截留的10-50um生物沖洗進(jìn)檢測箱內(nèi)；關(guān)閉沖洗閥和進(jìn)液閥，經(jīng)向染色劑加入口向樣品箱內(nèi)加入適量的活細(xì)胞熒光染色劑、對活細(xì)胞進(jìn)行熒光染色；對活細(xì)胞染色完成（約10分鐘）后，打開裂解閥，裂解泵工作，將細(xì)胞裂解液輸入檢測箱內(nèi)，待細(xì)胞充分裂解后，使用熒光計測出檢測箱內(nèi)的相對熒光強(qiáng)度值。選取80種通過實驗室方法已經(jīng)確定的、含9個10-50um存活生物的待排放壓載水水樣作為待檢測的壓載水樣品，通過上述的使用方法使用該裝置進(jìn)行檢測，求取平均值作為相對熒光強(qiáng)度參考值；將相對熒光強(qiáng)度值與相對熒光強(qiáng)度參考值對比，當(dāng)相對熒光強(qiáng)度不大于相對熒光強(qiáng)度參考值時，說明待排放的船舶壓載水符合排放標(biāo)準(zhǔn)，反之說明待排放的船舶壓載水不符合排放標(biāo)準(zhǔn)，使用相同的各種試劑的情況下，相對熒光強(qiáng)度參考值僅需求取一次，即可在多次、甚至無數(shù)次檢驗中成為參考值，有此參考值的情況下，本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡單、使用方便，檢測速度快、精度高，數(shù)據(jù)真實可靠。

實例1

一種船舶壓載水中10-50um生物快速檢測方法，包括如下步驟：使用網(wǎng)孔對角線長度為50um的尼龍篩絹制成的過濾器將經(jīng)壓載水處理設(shè)備處理后的待排放的壓載水樣品中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；取200ml濾出液，小于10um的存活生物隨液體濾出；使用10ml的物質(zhì)的量濃度為0.8mol/L、pH=7的Tris-HCl反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；向樣品槽內(nèi)加入活細(xì)胞熒光染色劑熒光素二乙酸酯20mg，染色10分鐘；染色完成后，向樣品槽內(nèi)加入10ml的細(xì)胞裂解液（細(xì)胞裂解液為甲醇與氯仿按體積比1:2混合而成的液體），靜置5分鐘；細(xì)胞充分裂解后，使用熒光計檢測樣品槽內(nèi)液體的相對熒光強(qiáng)度。

相對熒光強(qiáng)參考值的獲取方法如下：選用60種已知的、每毫升含9個10-50um存活生物的待排放壓載水水樣作為參考檢測樣品；對每種參考檢測樣品進(jìn)行如下操作：使用網(wǎng)孔對角線長度為50um的尼龍篩絹制成的過濾器將參考檢測樣品中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；取200ml濾出液，小于10um的存活生物隨液體濾出；使用10ml的物質(zhì)的量濃度為0.8mol/L、pH=7的Tris-HCl反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；向樣品槽內(nèi)加入活細(xì)胞熒光染色劑熒光素二乙酸酯20mg，染色10分鐘；染色完成后，向樣品槽內(nèi)加入10ml的細(xì)胞裂解液（細(xì)胞裂解液為甲醇與氯仿按體積比1:2混合而成的液體），靜置5分鐘；細(xì)胞充分裂解后，使用熒光計檢測樣品槽內(nèi)液體的相對熒光強(qiáng)度值。計算出該60種參考檢測樣品處理后得到的相對熒光強(qiáng)度的平均值，該平均值為相對熒光強(qiáng)度參考值。將待檢測壓載水處理后得到的相對熒光強(qiáng)度值與相對熒光強(qiáng)度參考值對比，即可判斷該待檢測壓載水樣品是否符合排放標(biāo)準(zhǔn)。

參考檢測樣品經(jīng)如下方法獲得：使用大孔徑過濾器將經(jīng)壓載水處理設(shè)備處理后的待排放的壓載水樣品中不小于50um的存活生物濾出，得濾出液；取Aml濾出液，使用小孔徑過濾器過濾并截留濾出液中不小于10um的存活生物、小于10um的存活生物隨液體濾出；使用3-10%Aml的清洗液反沖洗小孔徑過濾器、將截留的尺寸在10-50um的存活生物沖洗進(jìn)入到樣品槽內(nèi)；將樣品槽內(nèi)的液體經(jīng)FDA-CMFDA法在熒光顯微鏡下檢測，其中10-50um存活生物的含量符合要求時，即可成為參考檢測樣品。本發(fā)明中分別采用清洗液選用BES、MOPS、PBS（pH=7.0）、Tris-HCl(0.2-1.0M，pH=6.0-7.2)中的至少一種，能夠最大限度的減少FDA的非生物水解。細(xì)胞裂解液能夠使活細(xì)胞內(nèi)部的熒光素浸出，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

FDA連有兩個共軛的醋酸自由基，是一種非極性物質(zhì)，能自由通過藻類細(xì)胞膜，被細(xì)胞中的酯酶、蛋白酶、脂肪酶等非專一性酶催化水解成熒光素。FDA是無色化合物，本身沒有熒光，而反應(yīng)產(chǎn)物熒光素是一種極性且具有熒光發(fā)光性能的物質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不易被分解，難以穿過細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)積累。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)儲存的熒光素超過一定量后釋放到環(huán)境中，由于反應(yīng)物與產(chǎn)物的熒光特性不同，因此即使反應(yīng)物過剩，也不干擾產(chǎn)物的測定。

相對熒光強(qiáng)度與10-50um生物含量之間的關(guān)系

配制不同濃度的四爿藻溶液，其存活細(xì)胞含量使用FDA-CMFDA法檢測確定。將各溶液加入到本發(fā)明的裝置中，使用本發(fā)明的方法進(jìn)行相對熒光強(qiáng)度的測試。以四爿藻活細(xì)胞含量為x軸，以測得的相對熒光強(qiáng)度為y軸，作出圖2，由圖2可知，本發(fā)明的檢測結(jié)果與實際活細(xì)胞含量具有較好的一一對應(yīng)關(guān)系，能夠反映

出樣品中的活細(xì)胞含量。