本發(fā)明為分子生物學技術領域，涉及一種分子生物學技術領域的質粒分子，具體涉及一種用于轉基因小麥檢測的標準質粒分子及其構建方法。

背景技術：

轉基因作物又稱基因改造作物或基因改良作物。通過對基因的改良，人為地給某一作物植入另一種生物的遺傳基因，從而達到提高產量、增加營養(yǎng)、抗病、抗旱、抗蟲等目的。自1983年全球第一例轉基因煙草在美國問世以來，轉基因作物在農業(yè)領域的作用越來越重要。

小麥作為世界主要糧食來源，其種植面積、總產量和總貿易額均居各類作物之首，其轉基因遺傳改良受到廣泛關注。在糧食作物中，小麥屬于遺傳轉化最為困難的作物，轉基因研究起步較晚。1993年Weeks等(Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat(Triticum aestivum L).Plant Physiol，1993，102(4)：1077-1084)利用基因槍介導法將bar等基因導入了小麥，建立了基因槍轉化小麥的技術體系。1997年Cheng等(Genetic transformat of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens，Plant Physiol，1997，115(3)：971-980)首次利用農桿菌介導法轉化小麥獲得了攜帶NPTII等基因的轉基因植株。同年，由Barro F等(Transformation of wheat with high molecular weight subunit genes results in improved functional properties.Nature Biotechnology，1997，15：1295-1299)使用基因槍將pIDx5、pAHC25兩個質粒通過共轉化轉入小麥品種中得到了轉基因小麥B73-6-1。該轉基因小麥品系可改變其面包制品的烘烤品質，同時具有抗除草劑基因Bar，具有抗草丁膦特性。

進行轉基因檢測目前主要有兩類技術：一類為核酸檢測方法，例如PCR和基因芯片等，另一類為蛋白檢測方法，例如ELISA等，其中PCR檢測方法應用最為廣泛。通過PCR法進行轉基因檢測按策略可分為四種：通用原件篩選檢測、基因特異性檢測、結構特異性檢測和品系特異性檢測。通用原件篩選檢測主要是檢測轉基因常見的啟動子和終止子；基因特異性檢測主要是檢測插入的外源基因片段；結構特異性檢測主要是檢測插入外源DNA序列之間連接處的核酸序列；品系特異性檢測主要檢測外源DNA與植物基因組的連接處的核酸序列。

在進行PCR檢測時，除了設置必要的陰性對照對檢測進行監(jiān)控外，還應設置陽性對照來排除PCR體系可能存在的抑制因子和驗證體系的正確性。一般來說，PCR檢測應以從陽性標準品種提取的基因組DNA作為陽性對照，但是由于轉基因生物安全性等種種限制，轉基因作物陽性標準品難以獲得，因此需要研發(fā)一種容易獲得的陽性對照材料以滿足轉基因檢測的需要。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種轉基因小麥檢測用標準質粒分子及構建方法，使其可以代替各種轉基因小麥陽性標準物質用于轉基因小麥的定性、定量PCR檢測。根據目前小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列和內參WaXY-D1基因序列片段，進行人工序列合成，然后利用重疊PCR反應的原理設計特異PCR引物，經過PCR擴增獲得轉基因小麥常見元件和內參基因WaXY-D一段序列的重組DNA片段。利用分子克隆技術將重組DNA片段克隆到pMD-19T載體中，獲得新的質粒分子(命名為pPONY-TEST01。本發(fā)明構建的標準質粒分子可代替遺轉基因小麥原有的陽性標準物質，用于定性和定量PCR檢測，徹底解決轉基因小麥檢測中標準物質缺乏的難題。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現的，本發(fā)明所述標準質粒分子，以替代轉基因小麥的陽性標準物質，用于定性和定量PCR檢測。該標準質粒分子同時含有小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列和內參WaXY-D1基因序列。

本發(fā)明所述標準質粒分子pPONY-TEST01構建方法，包括如下步驟：

1)利用GenBank數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進行生物信息學分析，獲得小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列。

所述的小麥內參基因WaXY-D1，指的是小麥顆粒結合淀粉合成酶基因，其在小麥基因組中高度保守，具有種間特異性、種內非特異性和單拷貝數的特點。

所述的常見小麥轉基因元件Ubiquitin，是指玉米泛素蛋白基因啟動子，常用于轉基因單子葉植物外源基因的啟動子。

所述的常見小麥轉基因元件NPTII，是指新霉素-3’-磷酸轉移酶基因，常用于轉基因植物的抗生素篩選。

所述的常見小麥轉基因元件Bar，是指草丁膦乙酰轉移酶基因，常用于增強轉基因植物對除草劑草丁膦抗性。

所述的常見小麥轉基因元件T-NOS，是指胭脂堿合成酶終止子，常用于轉基因植物外源基因的終止子。

所述的小麥品系B73-6-1特異性序列，指的是小麥轉基因品系B73-6-1外源插入載體與小麥基因組鄰接區(qū)的DNA序列。

2)設計PCR特異性引物。

所述的PCR特異性引物，一般是指長度不大于50bp的寡核苷酸鏈，其與小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列完全相同或者互補。

3)特異性擴增小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列。

所述的特異性擴增，指的是利用設計的PCR引物特異性擴增小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列。

上述涉及的PCR擴增使用的引物如下：

4)小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列的拼接。

所述的拼接，指的是利用重疊PCR技術將小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列幾個獨立的DNA片段連接融合成一個重組的新DNA片段。

5)含有新的重組DNA片段的質粒分子克隆。

所述的分子克隆，指的是將上述得到的重組特異性DNA片段連接到質粒載體pMD-19T上，獲得標準質粒分子pPONY-TEST01，其質粒圖譜如附圖1所示，序列如SEQ ID No：1所示。此標準分子還留有Pst I和HindIII酶切位點，方便后續(xù)轉基因元件的加入，并且將pPONY-TEST01導入大腸桿菌EH5α即可長期保存使用。

6)標準質粒分子pPONY-TEST01的定性和定量PCR檢測方法驗證。

所述的定性PCR檢測方法驗證，是指標準質粒分子pPONY-TEST01包含的轉基因元件和品系特異性片段只能在轉基因小麥基因組DNA中擴增獲得，而不能在其他小麥品系，和其他轉基因作物基因組中擴增得到。

所述的定量PCR檢測方法驗證，是指檢測標準質粒分子pPONY-TEST01在進行定量PCR分析時的靈敏度，以鑒定該標準分子替代轉基因小麥陽性標準物質的能力。

7)本發(fā)明同時提供一種檢測轉基因小麥的方法，包括以上述構建的標準質粒分子為陽性標準物質，測定待測小麥樣品中是否存在待測轉基因元件及品系，以及轉基因品系的含量。

所述檢測方法，指的是采用熒光定量PCR的方法對標準質粒中包含的轉基因元件和品系按提供的檢測引物進行定量分析并繪制標準曲線，將待測樣品按提供的檢測引物進行熒光定量PCR，通過Ct值判斷是否含有待測轉基因元件及品系，如果B73-6-1轉基因品系檢測結果為陽性，還通過標準曲線可獲得轉基因品系的含量。

上述涉及的PCR檢測使用的引物和探針如下：

本發(fā)明的有益效果在于，利用重疊PCR和分子克隆的方法構建了含有小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列的標準質粒分子pPONY-TEST01，并通過驗證實驗證明此標準分子可作為陽性標準物質用于轉基因小麥的PCR檢測，很好的解決了轉基因小麥檢測過程中陽性標準物質缺乏的問題。

附圖說明

圖1為發(fā)明構建的標準質粒分子pPONY-TEST01的示意圖譜。

圖2為小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列的定性檢測。

圖3為標準質粒分子pPONY-TEST01檢出限和重復性的檢測。

具體實施方式

下面以實施例為例對本發(fā)明作詳細的說明：本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件操作，可參照Sambrook等編著的分子克隆實驗指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1：標準質粒分子的構建

在GenBank中搜索小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列信息。

1)構建標準質粒分子pPONY-TEST01的PCR引物序列設計

根據獲得的小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列，利用軟件Primer 5.0設計定性PCR引物，用于擴增小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列。具體的引物序列見下表。

2)小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列的擴增

根據上述引物，以含有Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS序列和B73-6-1品系的轉基因小麥為模板，對小麥內參基因WaXY-D1、轉基因小麥常見轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列進行PCR擴增，最后得到各元件的擴增片段。對擴增得到的條帶進行回收純化，通過測序分析表明獲得的序列與目的擴增片段序列一致。

上述PCR反應體系為：

所述PCR反應條件為95℃10min，1個循環(huán)；95℃30s、58℃30s、72℃60s，40個循環(huán)，72℃ 10min。

3)利用重疊PCR方法對上述六個片段進行連接

用上述PCR得到的六個片段序列為模板，以WaXY-D1基因的正向引物和B73-6-1品系特異性序列的反向引物作為重疊PCR的引物對，進行PCR擴增，

實現六個片段的重組拼接。

具體PCR反應體系為兩步，第一步PCR反應以回收的六個片段序列為模板，不添加引物進行PCR擴增，具體為：

所述PCR反應條件為95℃10min，1個循環(huán)；95℃30s、42℃50s、72℃4min，10個循環(huán)，72℃ 10min。

第二步PCR反應以第一步PCR反應混合液為模板，添加引物進行PCR擴增，具體為：

所述PCR反應條件為95℃ 10min，1個循環(huán)；95℃30s、56℃30S、72℃2min，35個循環(huán)，72℃ 10min。對擴增得到的條帶進行回收純化。

4)重組DNA片段克隆進入pMD-19T載體

利用分子克隆的方法將上述連接獲得的重組片段連接到質粒載體pMD-19T上，連接反應體系如下：

上述混合液42℃ 90秒，經熱激轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選后取陽性菌落進行PCR鑒定，鑒定正確的陽性克隆進行測序，最終得到標準質粒分子pPONY-TEST01。

構建的標準質粒分子pPONY-TEST01的簡要圖譜如附圖1所示。圖pPONY-TEST01表示構建標準質粒分子的載體，插入基因元件依次為：小麥內參基因WaXY-D1、轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS、品系B73-6-1特異性序列；品系B73-6-1特異性序列后還有Pst I和HindIII酶切位點，方便后續(xù)轉基因元件的加入。

實施例2：構建的質粒標準分子在實際檢測中的應用

1)標準質粒分子pPONY-TEST01的定性檢測

根據構建的標準質粒分子pPONY-TEST01各元件序列，設計熒光PCR檢測引物和探針，具體如下：

將標準質粒分子稀釋至2x10⁹copies/μl，以此為模板，使用上述元件檢測引物，進行熒光定量PCR。

所述的實時熒光PCR反應體系為：

所述的實時熒光PCR反應條件為95℃ 10min，1個循環(huán)；95℃，15s，58℃30s，40個循環(huán)，在每次循環(huán)的58℃/30s時收集熒光。

檢測結果顯示小麥內參基因WaXY-D1、轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS、品系B73-6-1特異性序列均得到有效擴增，見附圖2。

2)標準質粒分子pPONY-TEST01的檢出限和重復性測定

將準質粒分子pPONY-TEST01依次稀釋為2x10⁴copies/μl、2x10³copies/μl、2x10²copies/μl、2x10¹copies/μl和2x10⁰copies/μl進行重復性和可復現性的測試，每個濃度使用品系B73-6-1檢測引物進行3個平行反應并重復3次，結果表明標準質粒分子濃度為2x10⁰copies/μl時，Ct值平均為35.80，為有效擴增，表明標準質粒分子pPONY-TEST01的檢出限可達2個拷貝，具有很好的靈敏性。3個平行反應間和3次不同重復實驗間獲得的Ct值標準偏差基本上都小于0.2，說明根據構建的pPONY-TEST01標準質粒分子具有良好的重復性，見附圖3。

本發(fā)明構建的標準質粒分子pPONY-TEST01對小麥內參基因WaXY-D1、轉基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS、品系B73-6-1特異性序列的檢測引物均具可得到良好的擴增效果，且具有良好的重復性，完全可作為小麥轉基因成分檢測的陽性標準物質使用。