本發(fā)明屬于醫(yī)療技術領域，涉及一種新的冬蟲夏草及相關產品鑒別檢測方法，尤其涉及同時應用兩種限制性內切酶實現(xiàn)真菌鑒別的方法。

背景技術：

冬蟲夏草(Cordyceps sinensis，即Ophiocordyceps sinensis)是寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體，主要見于海拔3200-5000米、氣候較為寒冷的高山草甸和峽谷，目前發(fā)現(xiàn)僅分布在我國青藏高原地區(qū)的西藏、青海、四川、云南、甘肅五省區(qū)，以及不丹、印度、尼泊爾的喜馬拉雅山南麓的部分地區(qū)，野生資源有限，是一種珍貴稀有的傳統(tǒng)中藥材，在我國的藥用歷史已有500多年。現(xiàn)代科學研究證明，冬蟲夏草的主要化學成分為核苷類、氨基酸類、多糖類、醇類以及一些無機元素等，具有免疫調節(jié)，抗炎，抗氧化，抗腫瘤等生物學效應。冬蟲夏草不僅作為一種中藥材被收錄到中國藥典，也同樣作為一種日常保健品被亞健康人群和慢性病病人所青睞，市場需求日益增長。由于近年來過度采挖，野生資源急劇減少，價格畸高，優(yōu)質冬蟲夏草的市場價高達400元/克；另一方面，廣大民眾對于“冬蟲夏草”和“蟲草”的概念混淆不清，在利益驅使下，一些不法商家借機以假亂真、欺騙消費者的現(xiàn)象屢見不鮮。CCTV焦點訪談欄目曾以“冬蟲夏草，亂象叢生”為題報道了這一混亂的市場狀況，一時引起社會廣泛關注，迫切要求我們加強市場監(jiān)管。而現(xiàn)行《中國藥典》(2015年版)關于“冬蟲夏草”的標準規(guī)定只有“性狀”和“含量測定”兩項，缺乏客觀、準確、專屬性強的鑒別標準。

技術實現(xiàn)要素：

為了提供更為客觀、準確、專屬性強的冬蟲夏草及相關產品鑒別檢測手段，本發(fā)明提供了一種同時應用兩種限制性內切酶實現(xiàn)真菌鑒別的方法。

冬蟲夏草近緣種是原藥材混偽品的主要來源。常見的近緣種有古尼蟲草、亞香棒蟲草、新疆蟲草、戴氏蟲草、涼山蟲草、蛹蟲草6個品種。鑒于從基因角度進行真?zhèn)舞b別最為準確，本發(fā)明人根據(jù)冬蟲夏草和近緣蟲草真菌種類不同，采用基于ITS的PCR-RFLP方法對其進行鑒別。

聚合酶鏈式反應-限制性內切酶長多態(tài)性法(PCR-RFLP)是在PCR的基礎上，利用限制性內切酶的特性，即識別特定雙鏈DNA序列并在特定位點進行切割，如果酶切位點發(fā)生了突變，便不能被切割；片段是否被切割可以通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測。該方法客觀，靈敏，重現(xiàn)性好，專屬性強，已被用于《中國藥典》川貝母的檢測。本發(fā)明人通過對樣品測序獲得的ITS序列以及GenBank數(shù)據(jù)庫中多種蟲草真菌的ITS序列進行分析，確定了用于鑒別的兩個限制性內切酶位點；之后對不同產地的冬蟲夏草和近緣蟲草樣品進行PCR-RFLP法檢測，證明方法可行。此外，本發(fā)明人分析了GenBank數(shù)據(jù)庫中一些真菌的ITS序列，發(fā)現(xiàn)該方法能夠鑒別冬蟲夏草菌與至少17種真菌。

本發(fā)明提供了一種同時應用兩種限制性內切酶實現(xiàn)真菌鑒別的方法，其中所述兩種限制性內切酶為Xho I和Sac II。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述真菌為冬蟲夏草和其近緣蟲草及其他真菌。

例如，所述真菌為冬蟲夏草(包括其無性型——中華被毛孢)和古尼蟲草、亞香棒蟲草、蛹蟲草、戴氏蟲草、涼山蟲草、新疆蟲草，以及其它真菌，包括Cordyceps sobolifera、Cordyceps brittlebankisoides、Cordyceps brongniartii、Cordyceps nutans、Cordyceps cicadae、Tolypocladium caledonica、Ligularia hodgsonii、Paecilomyces sinensis、Mortierella SP、Gliocladium roseum、Cephalosporium sinensis等。

根據(jù)具體實施方式，所述方法涉及PCR-RFLP法。

所述方法包括在DNA序列分析的基礎上，找到兩個限制性內切酶位點以便進行真菌的鑒別。

所述真菌鑒別適用于冬蟲夏草、其近緣蟲草的原藥材和產品。所述產品為粉末制劑、片劑、液態(tài)制劑、人工發(fā)酵菌粉制劑。

根據(jù)發(fā)明的具體實施方式，所述方法包括植物基因組DNA提取、聚合酶鏈式反應法(PCR)、DNA測序、序列比對及限制性內切酶位點分析、限制性內切酶長度多態(tài)性方法(RFLP)、瓊脂糖凝膠電泳法。

本發(fā)明的方法較以往傳統(tǒng)的鑒別方法，判斷客觀，結果準確，重復性好，適合作為一種真?zhèn)舞b別手段，用于冬蟲夏草質量控制，具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1描述冬蟲夏草與其它蟲草ITS區(qū)序列分析。

圖2為根據(jù)本發(fā)明的一種具體實施方式的瓊脂糖凝膠電泳結果，其中：(a)示各種蟲草PCR結果；(b)示各種蟲草PCR產物的Xho I酶切結果，1-3：冬蟲夏草；4：戴氏蟲草；5:涼山蟲草；6-9：古尼蟲草；10-13：新疆蟲草；14-15：蛹蟲草；16-18：亞香棒蟲草；B:空白對照；M:DL2000DNA分子量標記。

圖3為根據(jù)本發(fā)明的一種具體實施方式的瓊脂糖凝膠電泳結果，其中：(a)冬蟲夏草和新疆蟲草Sac II酶切位點示意圖；(b)瓊脂糖凝膠電泳圖，示冬蟲夏草與新疆蟲草PCR產物的Sac II酶切結果，1-12:冬蟲夏草；13-14：新疆蟲草；B:空白對照；M:DL2000DNA分子量標記。

具體實施方式

下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，這些實施例僅僅是說明性的，因此不應將其解釋為對本發(fā)明范圍的限制。

一、樣品及序列信息

共收集到正品冬蟲夏草37批。收集冬蟲夏草6個近緣種21批，包括戴氏蟲草、古尼蟲草、新疆蟲草、亞香棒蟲草、蛹蟲草、涼山蟲草，詳見表1。另從GenBank數(shù)據(jù)庫下載以上各種蟲草的ITS序列，詳見表2。

表1、樣品信息

表2、從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的ITS序列信息

二、儀器與試劑

1.1.1儀器：PCR儀(ABI VERITI)，分析天平(Mettler AB135-S)，純水儀(Millipore公司)，電泳儀(EPS-301，Amersham)，全自動凝膠成像系統(tǒng)(SyngeneGeneGenius)，球磨儀(M400，Retsch)，微量紫外分光光度計，水浴鍋。

1.2.1試劑：快捷型植物基因組提取試劑盒(DP321，天根生化科技有限公司)，Ex Taq(DRR100B，TaKaRa)，dNTP Mixture 10mM(N0447，New England Biolabs)，SacII(R0157,New England Biolabs)GelRed(41003，Biotium)，瓊脂糖(BLOWEST)，GelRed(Biotium)，Tris堿，冰醋酸，EDTANa₂·2H₂O(國藥集團化學試劑有限公司)，引物(華大基因)ITS上游：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，下游：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

1.2.2樣品處理：分別取樣品的子座和蟲體部分，用酒精棉球將表面擦拭干凈，晾干；用球磨儀磨成極細粉，稱取30mg備用。

1.2.3DNA提取和定量分析：按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作。用微量紫外分光光度計對提到的DNA進行定量。

1.2.4聚合酶鏈式反應及測序：

PCR反應條件：預變性94℃5min；反應循環(huán)(35輪)94℃30s，52℃30s，72℃30s；最后延伸72℃5min。PCR反應體系25μL：DNA模板1μL，上下游引物各0.2μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，dNTP(10mM)0.6μL，反應緩沖液2.5μL，高壓蒸汽滅菌的去離子水(ddH₂O)補齊體系。

PCR樣品送測序公司完成測序。

1.2.5序列分析：Codon Code Aligner 4.0進行序列拼接，剪切和圖譜分析；MEGA 5.0進行多序列比對分析。

1.2.6酶切反應：反應體系20μL——取PCR產物10μL，加入限制性內切酶0.5μL，反應緩沖液2μL，高壓蒸汽滅菌的去離子水(ddH₂O)7.5μL。反應條件為37℃15min。

1.2.7瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像：使用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓5V/cm，20～40min；之后使用紫外凝膠成像儀拍照并保存結果。

三、PCR-RFLP鑒別方法的建立

通過對冬蟲夏草和蟲草屬其它種的ITS序列進行分析，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草具有Xho I限制性內切酶位點，其它蟲草(新疆蟲草除外)不具有這一位點(圖1)。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示(圖2)，在Xho I作用后，冬蟲夏草ITS區(qū)PCR產物被切割成兩個片段,位于100-500bp之間；其它蟲草(新疆蟲草除外)則不能被切割。新疆蟲草ITS區(qū)的PCR產物被切割成兩個片段,大小與冬蟲夏草相近，因此二者不宜用此種限制性內切酶進行鑒別。

通過分析冬蟲夏草和新疆蟲草的ITS區(qū)，發(fā)現(xiàn)二者具有不同的Sac II酶切位點數(shù)目，分別為1個和3個，這樣理論上兩種蟲草分別可以被切割成2個片段和4個片段。在瓊脂糖凝膠電泳圖中，冬蟲夏草組出現(xiàn)2個條帶，大小位于100bp-500bp之間；而新疆蟲草由于兩個片段大小相同，在凝膠圖上幾乎重合，以及一個片段過小(約為50bp)而沒有在圖中顯示，故也表現(xiàn)為2個條帶，但其大小與冬蟲夏草組差別較大，憑肉眼可以明確辨別(圖3)。

所以，本發(fā)明人選擇同時應用Xho I和Sac II兩種限制性內切酶，用來鑒別冬蟲夏草和其近緣蟲草。

四、冬蟲夏草PCR-RFLP鑒別方法的適用范圍

除了以上6種近緣蟲草，本發(fā)明人考察了其他一些常見真菌，分析他們ITS區(qū)上，兩種限制性內切酶Xho I和Sac II酶切位點的分布情況。由于這些真菌的ITS區(qū)不會兼具上述兩種限制性內切酶的位點，故本發(fā)明人建立的雙酶切方法，可以用來區(qū)別冬蟲夏草和至少17種常見的真菌(表3)。

表3、冬蟲夏草和其他17種真菌ITS序列上兩種限制性內切酶的分布情況

本文對一些具體的實施例進行了詳細的描述，然而這只是作為對發(fā)明目的實例說明，而不限制下述權利要求書的范圍。應當理解，對本文所述具體方案的不同取代、改變和修飾都不偏離本發(fā)明權利要求所定義的內涵和外延，從而應當屬于本申請所要求保護的發(fā)明范圍。