本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及細菌的鑒定方法。

背景技術(shù)：

16S rRNA為核糖體RNA的一個亞基，16S rDNA為編碼該亞基的基因。由于16S rDNA序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的穩(wěn)定性，序列分析的重現(xiàn)性極高^[1]。根據(jù)這些保守區(qū)可以設(shè)計出細菌通用引物，從而能夠擴增出所有細菌的16S rDNA片段，并且這些引物僅對細菌是特異性的，也就是說這些引物不會與非細菌的DNA互補。而細菌的16S rDNA可變區(qū)的差異可以用來區(qū)分不同的菌。因此，16S rDNA被認(rèn)為是細菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。

細菌16S rDNA含有9個可變區(qū)^[2]，命名為V1～V9區(qū)。除V2、V3、V4區(qū)稍長外，其他各可變區(qū)的序列都很短。Schmalenberger等人^[3]通過SSCP PCR技術(shù)研究16S rRNA V4～V5可變區(qū)可以區(qū)分13種細菌。Claesson等人^[4]指出在使用羅氏454測序儀或者Illumina測序儀時，測定細菌16S rDNA的V3～V4和V4～V5可變區(qū)能夠得到最為精確的細菌種屬的鑒定結(jié)果。Chakravorty等^[5]對113份完整的病原菌16S rDNA的V1～V8區(qū)序列進行詳細研究。結(jié)果顯示，V1區(qū)能區(qū)分金黃色葡萄球菌與血漿凝固酶陰性葡萄球菌；V2和V3區(qū)能將除腸桿菌科以外的細菌鑒別至屬的水平，V2區(qū)尤其適合于鑒別分枝桿菌屬內(nèi)的菌種，V3區(qū)能很好區(qū)別嗜血桿菌屬內(nèi)各種細菌；V6區(qū)也能區(qū)分除腸桿菌科以外的大多數(shù)菌種，特別是通過單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析可將炭疽芽胞桿菌從與其生物學(xué)性狀非常相似的蠟樣芽胞桿菌群細菌中區(qū)分開來。上述說明，確定某個可變區(qū)內(nèi)具有細菌種特異性的序列就可能獲得細菌實驗室診斷的有用靶點。但是Baker等^[6]指出目前的研究并不能通過單一可變區(qū)來區(qū)分所有的細菌。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是利用多重PCR的方式，對細菌16S rDNA的可變區(qū)進行擴增、測序，從而實現(xiàn)快速區(qū)分、鑒定細菌種類的目的。

在第一個方面，本發(fā)明提供一種鑒定細菌的多重PCR引物對組合，所述組合包括用于擴增16S rDNA的V1-V8可變區(qū)的引物對P1、P3、P5和P6，其中，引物對P1的擴增產(chǎn)物覆蓋可變區(qū)V1和V2，引物對P3的擴增產(chǎn)物覆蓋可變區(qū)V3和V4，引物對P5的擴增產(chǎn)物覆蓋可變區(qū)V5和V6，引物對P6的擴增產(chǎn)物覆蓋可變區(qū)V7和V8，其中引物對P1與P5組合使用，P3與P6組合使用；每個引物對均包含正向引物和反向引物，每條正向引物和反向引物的序列分別由以下部分組成：從5’端到3’端依次為：與測序通用引物互補的序列、標(biāo)簽序列和與16S rDNA保守區(qū)結(jié)合的序列；其中，所述測序通用引物和標(biāo)簽序列根據(jù)不同的測序公司所提供的測序系統(tǒng)而不同，這些都屬于公知技術(shù)。

優(yōu)選地，所述與測序通用引物互補的序列的長度為16～22個核苷酸，所述與16S rDNA保守區(qū)結(jié)合的序列的長度為14～24個核苷酸。

在一種優(yōu)選的實施方式中，所述各引物對中正向引物和反向引物的序列分別為：

P1：

正向引物：

ACACGACGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+AGAGTTTGATCCTGGCTNAG；

反向引物：

GACGTGTGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+CTGCTGCCTYNCGTA；

P3：

正向引物：

ACACGACGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+CCTACGGGNGGCWGCAG；

反向引物：

GACGTGTGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+GACTACHVGGGTATCTAATCC；

P5：

正向引物：

ACACGACGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+RGGATTANATACCC；

反向引物：

GACGTGTGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+CGACRRCCATNCANCACCT；

P6：

正向引物：

ACACGACGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+GYAACGAGCNCAACCC；

反向引物：

GACGTGTGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+GACGNGCGGTGWGTRC。

在一種優(yōu)選的實施方式中，各引物對中正向引物和反向引物的序列分別為：

P1：正向引物：SEQ ID NO:1，反向引物：SEQ ID NO:2；

P3：正向引物：SEQ ID NO:3，反向引物：SEQ ID NO:4；

P5：正向引物：SEQ ID NO:5，反向引物：SEQ ID NO:6；

P6：正向引物：SEQ ID NO:7，反向引物：SEQ ID NO:8。

在第二個方面，本發(fā)明提供一種鑒定細菌的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的PCR引物對組合。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括PCR緩沖液、DNA聚合酶。

在第三個方面，本發(fā)明提供一種鑒定細菌的系統(tǒng)，包括本發(fā)明的PCR引物對或試劑盒；優(yōu)選地，所述系統(tǒng)還包括用于高通量測序的儀器和/或系統(tǒng)。

在第四個方面，本發(fā)明提供一種鑒定細菌的方法，包括用本發(fā)明的PCR引物對組合擴增細菌DNA。優(yōu)選地，所述細菌DNA為細菌基因組DNA。

在一種優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括利用引物對P1和P5將細菌16S rDNA的V1～V2可變區(qū)聯(lián)合V5～V6可變區(qū)同時擴增，利用引物對P3和P6將V3～V4可變區(qū)聯(lián)合V7～V8可變區(qū)同時擴增，然后將兩種擴增得到的核酸混合到一起，構(gòu)建文庫，進行下一代測序(Next Generation Sequencing)，對測序結(jié)果進行分析，從而鑒定細菌種類。

優(yōu)選地，各PCR引物對中的各正向引物和反向引物在反應(yīng)體系中的濃度分別為1～5μM。

在本發(fā)明中，所述引物對的擴增產(chǎn)物覆蓋可變區(qū)，其實質(zhì)上是指引物對的擴增產(chǎn)物覆蓋了所述引物對兩條引物5’端位置之間的可變區(qū)和保守區(qū)。例如，引物對P1的擴增產(chǎn)物覆蓋可變區(qū)V1和V2，其實質(zhì)上覆蓋了P1正向引物5’位置與V1之間的保守區(qū)、V1、V1和V2之間的保守區(qū)、V2以及V2與P1反向引物5’位置之間的保守區(qū)。通過本發(fā)明的4個引物對，實質(zhì)上擴增了細菌16S rDNA除V9以外的所有序列。以此進行比對，提高了比對效率和成功率。

本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過無數(shù)次試驗，設(shè)計了能夠有效擴增16S rDNA的8個可變區(qū)(含兩側(cè)及其中的保守區(qū))的引物，對8個可變區(qū)進行了組合，利用引物對組合對可變區(qū)組合進行擴增，有效得到可變區(qū)序列；結(jié)合下一代測序和分析，能夠靈敏、高效地鑒定細菌種屬。

附圖說明

圖1：通過PE touch檢測引物對P1+P5組合的擴增嗜肺軍團菌基因組DNA結(jié)果圖。

圖2：通過PE touch檢測引物對P1+P6組合的擴增嗜肺軍團菌基因組DNA結(jié)果圖。

圖3：通過PE touch檢測引物對P3+P6組合的擴增嗜肺軍團菌基因組DNA結(jié)果圖。

圖4：通過PE touch檢測引物對P5+P6組合的擴增嗜肺軍團菌基因組DNA結(jié)果圖。

圖5：通過PE touch檢測引物對P1+P5+P6組合的擴增嗜肺軍團菌基因組DNA結(jié)果圖。

圖6：6種模擬菌株測序結(jié)果圖(P1+P5；P3+P6)。

圖7：6種模擬菌株測序優(yōu)勢情況圖(P1+P5；P3+P6)。

圖8：第1例臨床血液樣本菌株測序結(jié)果圖(P1+P5；P3+P6)。

圖9：第1例臨床血液樣本菌株測序優(yōu)勢情況圖(P1+P5；P3+P6)。

圖10：第2例臨床血液樣本菌株測序結(jié)果圖(P1+P5；P3+P6)。

圖11：第2例臨床血液樣本菌株測序優(yōu)勢情況圖(P1+P5；P3+P6)。

具體實施方式

以下將通過具體實施例描述本發(fā)明，但本發(fā)明內(nèi)容不限于此。如沒有特殊說明，以下實施例中所使用的試劑、儀器均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑、儀器，可以從商購?fù)緩将@得；本發(fā)明中所使用的方法為本領(lǐng)域常規(guī)實驗方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常識完全可以實現(xiàn)所述方法。

實施例一：引物對組合的設(shè)計

1、引物對的設(shè)計

根據(jù)16S rDNA的保守區(qū)序列設(shè)計擴增8個可變區(qū)的引物對，其中，V1和V2區(qū)使用P1引物對擴增，V3和V4區(qū)使用P3引物對擴增，V5和V6區(qū)使用P5引物對擴增，V7和V8區(qū)使用P6引物對擴增(表1a，1b)。

表1a和1b中，下劃線標(biāo)記引物序列為與16S rDNA保守區(qū)結(jié)合的序列，未用下劃線標(biāo)記引物序列為與Illumina Miseq V1-V2試劑盒測序通用引物互補的序列。在與測序引物互補的序列和與16S rDNA保守區(qū)結(jié)合的序列之間，可根據(jù)最終文庫樣本數(shù)加入不同的標(biāo)簽序列，如index序列或者barcode序列，通過不同的index(或者barcode)序列將不同樣本的測序數(shù)據(jù)分開。Index序列(或barcode序列)可根據(jù)使用的測序平臺和測序試劑盒不同，按照測序商提供的index(或barcode)序列信息選擇。例如，可以選擇Illumina測序平臺提供的index表中的序列或ROCHE測序平臺提供的barcode表中的序列作為標(biāo)簽序列。這樣的index(或barcode)序列是本領(lǐng)域的公知技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全知道如何獲得和選擇這樣的序列并實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。也可根據(jù)“4種堿基達到平衡”的原則自己設(shè)計，最終滿足標(biāo)簽序列測序質(zhì)量要求，能夠把下機測序數(shù)據(jù)按樣本分類即可。

表1a：正向引物序列

表1b：反向引物序列

表1a和表1b的引物序列中的N、W、Y、R、H、V為簡并堿基，分別表示：

N＝A/T/C/G，W＝A/T，Y＝C/T，R＝A/G，H＝A/T/C，V＝G/A/C。

2、引物對組合的設(shè)計

根據(jù)PCR實驗要求和引物序列特點(引物對P3與引物對P1、P5有序列重疊部分，需要避免擴增時出現(xiàn)引物自連)，設(shè)計表2所示的引物對組合。

表2：引物對組合

實施例二：引物對組合的篩選

1、提取細菌核酸

1)使用DNA Purification from Blood or Body Fluids(Spin Protocol)(Qiagen Cat.NO.51306)試劑盒提取嗜肺軍團菌(購買自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)基因組DNA。

2)用分光光度計對收集管內(nèi)的DNA定量。用于通量檢測的DNA的要求為：濃度：≥10ng/μl；純度：OD260/280為1.8-2.0；核酸總量：≥1μg。-20℃可短期保存；-80℃可長期保存。

2、PCR擴增

1)合成P1、P3、P5、P6引物對中各引物并分別稀釋成5μM使用液；

本實施例中僅有一個樣本，因此標(biāo)簽序列選擇一個，為Illumina測序平臺提供的index序列“TGAACCTT”；即，P1、P3、P5、P6引物對中各引物的序列為：

P1F：5’-ACACGACGCTCTTCCGATCTTGAACCTTAGAGTTTGATCCTGGCTNAG-3’(SEQ ID NO:1)；

P1R：5’-GACGTGTGCTCTTCCGATCTTGAACCTT CTGCTGCCTYNCGTA-3’(SEQ ID NO:2)；

P3F：5’-ACACGACGCTCTTCCGATCTTGAACCTTCCTACGGGNGGCWGCAG-3’(SEQ ID NO:3)；

P3R：5’-GACGTGTGCTCTTCCGATCTTGAACCTTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’(SEQ IDNO:4)；

P5F：5’-ACACGACGCTCTTCCGATCTTGAACCTTRGGATTANATACCC-3’(SEQ ID NO:5)；

P5R：5’-GACGTGTGCTCTTCCGATCTTGAACCTTCGACRRCCATNCANCACCT-3’(SEQ ID NO:6)；

P6F：5’-ACACGACGCTCTTCCGATCTTGAACCTTGYAACGAGCNCAACCC-3’(SEQ ID NO:7)；

P6R：5’-GACGTGTGCTCTTCCGATCT TGAACCTTGACGNGCGGTGWGTRC-3’(SEQ ID NO:8)。

2)定量嗜肺軍團菌基因組DNA樣本，保證每個引物對組合的PCR模板DNA濃度一致；

3)以嗜肺軍團菌基因組DNA為模板，按照表2中的引物對組合1～5在PCR管中添加引物，以下述PCR反應(yīng)體系和擴增程序進行擴增(2×Q5Master Mix：Q5熱啟動超保真PCR預(yù)混液，貨號：#M0494S)：

表3：PCR反應(yīng)體系

擴增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，25個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

3、PCR產(chǎn)物檢測

使用PerkinElmer生產(chǎn)的LabChip GX Touch微流控毛細管電泳系統(tǒng)對純化后的PCR產(chǎn)物進行檢測。

1)芯片準(zhǔn)備

使用儀器配套試劑盒(HT DNA Sensitivity Reagent Kit，PN CLS760672)，嚴(yán)格按照說明書進行芯片清洗。

2)將PCR產(chǎn)物和Ladder加入樣品板

使用儀器配套試劑盒(PN CLS960008)，嚴(yán)格按照說明書操作步驟，向樣品板中加入20μl PCR產(chǎn)物，記錄加樣順序。

3)上機檢測

a.打開軟件(LabChip GX Touch)，將芯片放入儀器內(nèi)，軟件自動識別芯片；

b.依次放入試劑盒提供的DNA Ladder管和樣品板；

c.在軟件中編輯樣品名稱后開始檢測；

d.檢測結(jié)束后，保存峰圖結(jié)果。

4、檢測結(jié)果與分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)LabChip GX Touch微流控毛細管電泳系統(tǒng)檢測，得到的峰圖如圖1-5所示。

最優(yōu)引物組合的篩選原則為：每個組合的引物在進行PCR時，盡量保證組合中的每對引物所得的峰圖的峰面積(即圖中最高的兩個峰)是一致的或者相差較小，并且避免出現(xiàn)雜峰。如圖4和5所示，引物P5+P6組合以及引物P1+P5+P6組合雜峰較多，首先舍棄這兩種組合。最終確定的引物組合方案為，P1(5μM)+P5(5μM)；P3(5μM)+P6(5μM)。

實施例三：利用引物對組合鑒定細菌

1、菌種

選取6種菌株(艱難梭菌、屎腸球菌、大腸桿菌、糞腸球菌、鮑氏不動桿菌、金黃色葡萄球菌，購買自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)作為模擬實驗菌株，使用已經(jīng)確定的最優(yōu)引物組合和最合適的引物濃度進行兩步PCR，通過高通量測序分析鑒定菌種。

2、第一步PCR擴增

選用引物對組合P1(5μM)+P5(5μM)；P3(5μM)+P6(5μM)，各引物的序列同實施例二的步驟2。實驗步驟參照實施例二中的步驟2進行第一步PCR擴增。

3、第一步PCR產(chǎn)物純化

a.配置80％乙醇溶液；

b.向本實施例步驟2的每管PCR產(chǎn)物中加入50μl Ampμre Beads(Beckman AMPure XP Beads，Lot：15622200)中，吹吸混勻，輕微震蕩，室溫靜置5min；

c.離心，將樣本置于磁力架(Life tech,Lot:3615)上，吸附5min至液體清澈；

d.棄去上清；

e.加200μl 80％乙醇溶液于樣本中，吹吸沖洗磁珠，將樣本在磁力架上靜置2min，棄去上清；

f.重復(fù)步驟e兩次后，吸出殘余的乙醇，開蓋放置5min；

g.將樣本從磁力架上取出，向樣本中加入30μl ddH₂O，輕微震蕩混勻，室溫放置2min，短暫離心；

h.將樣本重新置于磁力架上，吸附2min，將上清液吸出到新的1.5ml EP管中；

i.用Nanodrop超微量紫外分光光度計(Thermo Fisher，貨號：ND-ONE-W)對收集管內(nèi)的核酸進行定量。

4、第二步PCR擴增

調(diào)整每管純化后的第一步PCR產(chǎn)物濃度為15ng/μl，作為模板。

第二步PCR目的是加入與Illumina Miseq測序儀flow cell上固相結(jié)合物互補的序列P5/P7，以及用于區(qū)分實驗樣本的index序列，用于后續(xù)的高通量測序。序列如下表4所示，其中下劃線標(biāo)注序列為與第一輪PCR產(chǎn)物結(jié)合的illumina通用測序引物序列，正向引物(PCR 2F)中未用下劃線標(biāo)注序列為P5序列，反向引物(PCR 2R)中未用下劃線標(biāo)注序列為P7序列。可根據(jù)文庫容量需要在P5/P7序列與通用測序引物序列間加標(biāo)簽序列index，其中index的序列為“TGAACCTT”。

表4：第二輪PCR中的引物序列

表5：第二次PCR體系

5、第二步PCR產(chǎn)物純化

PCR產(chǎn)物純化的操作步驟詳見本實施例步驟3。

6、qPCR文庫質(zhì)檢

將步驟5得到的純化產(chǎn)物混勻在同一管中，稱之為文庫。

a.向1.5ml EP管中加入198μl 0.05％吐溫ddH₂O；

b.向步驟a的EP管中加入2μl文庫樣本進行第一次稀釋，漩渦混勻40s；

c.從第一次稀釋文庫樣本中取2μl按照步驟a和步驟b進行第二次稀釋；第二次稀釋所得稀釋液待用；

d.制備標(biāo)準(zhǔn)品(Illumina DNA Standards and Primer Premin Kit，貨號：KK4808)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度設(shè)置20pM、2pM、0.2pM、0.02pM、0.002pM、0.0002pM，渦旋混勻，設(shè)置水作為陰性對照，繪制1條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并做一個重復(fù)；

e.分別將4μl的標(biāo)準(zhǔn)品，4μl第二次稀釋所得樣本和4μl水，與16μl反應(yīng)混合物(KAPA SYBR FAST Universal qPCR Kit，貨號：KK4601)混合均勻，加入PCR管中，每孔設(shè)置三個重復(fù)；

f.預(yù)熱qPCR儀，打開qPCR軟件，按照儀器說明設(shè)置程序：95℃預(yù)變性10min；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)；設(shè)置溶解曲線；

g.濃度換算：文庫濃度＝qPCR讀數(shù)×452/文庫片段大小×10000(稀釋倍數(shù))/1000；qPCR質(zhì)控要求為：濃度≥1μM；總量≥10μl；

h.瓊脂糖凝膠電泳確定文庫片段大小。

質(zhì)控要求為：文庫條帶大小位于300-500bp之間，無小于120bp左右條帶的污染。

7、文庫Miseq上機測序

1)實驗前準(zhǔn)備

a.提前16小時將Illumina Miseq V2/V3試劑盒(貨號：MS-102-2001)試劑置于4℃冰箱中。

b.試劑融化后，顛倒混勻10次。

2)稀釋NaOH

取100μl 2N NaOH和900μl H₂O混勻，得到0.2N NaOH。

3)文庫變性、稀釋

a.5μl 4nM文庫與5μl 0.2N NaOH室溫變性5分鐘；

b.10μl 2nM文庫與990μl HT1緩沖液混勻得到20pM文庫；

c.360μl 20pM文庫與240μl HT1緩沖液混勻得到12pM文庫；

d.將600μl 12pM文庫加入Load Sample孔中。

4)上機操作步驟按《系統(tǒng)用戶指南》完成。

8、高通量測序數(shù)據(jù)分析

Miseq測序結(jié)束后，經(jīng)生物信息學(xué)分析，結(jié)果如圖6和7所示：

序列比對結(jié)果顯示：測序得到的reads與細菌數(shù)據(jù)庫比對，完全并唯一比對上的reads分別與艱難梭菌、屎腸球菌、大腸桿菌、糞腸球菌、鮑氏不動桿菌、金黃色葡萄球菌的序列一致，并且代表序列符合“至少有兩個不同可變區(qū)唯一覆蓋，唯一識別reads數(shù)>5條”的生物信息分析判斷標(biāo)準(zhǔn)。通過最佳引物組合進行兩步PCR擴增建庫，高通量測序分析檢測鑒定得到的細菌種類與模擬實驗中預(yù)設(shè)菌種類完全一致。圖7中柱形圖的高低代表細菌的拷貝數(shù)優(yōu)勢。柱形圖Y值>0，表明測序數(shù)據(jù)結(jié)果分析可以鑒定到樣本中拷貝數(shù)具有差異的混合細菌的不同種類。

實施例四：血流感染測序鑒定及臨床血培實驗

實驗所用的2例臨床血液樣本由醫(yī)院提供。按照實施例三的實驗方法，對2例血液樣本進行兩步PCR建庫，文庫質(zhì)檢，上機測序。同時將這2例血液樣本按照臨床血培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行培養(yǎng)。

本實施例檢測了2個樣本，第一例樣本選用的標(biāo)簽序列為Illumina測序平臺提供的index序列表(表4)中的A502序列“TGCTAAGT”；第二例樣本選用的是A503序列“TGTTCTCT”。

結(jié)果與分析：

兩例臨床血液樣本的高通量測序檢測分析結(jié)果如圖8-11所示：

第1例血液樣本檢測分析結(jié)果顯示，測序得到的reads，能夠與庫序列中肺炎克雷伯氏菌與溶血性葡萄球菌完全比對上，唯一識別reads數(shù)均>5。

第2例血液測序結(jié)果顯示，測序得到的reads，能夠與庫序列中鮑曼不動桿菌完全比對上，唯一識別reads數(shù)均>5。

兩例臨床血培檢測結(jié)果見表6，第1例臨床血培結(jié)果顯示能檢測到肺炎克雷伯氏菌與溶血性葡萄球菌，第2例臨床血陪結(jié)果顯示能檢測到鮑曼不動桿菌，臨床血培與測序結(jié)果作比對，結(jié)果一致。

表6：臨床血培檢測結(jié)果

從鑒定的準(zhǔn)確率來看，本研究采用16S rDNA靶向擴增的下一代測序技術(shù)，對擴增引物組合進行優(yōu)化，可以得到滿意的擴增結(jié)果；將兩種擴增產(chǎn)物混合后得到的文庫進行下一代測序，分析測序結(jié)果，可以達到快速準(zhǔn)確鑒定細菌種屬的目的。

參考文獻

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