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鑒定細(xì)菌的多重PCR引物對(duì)組合及鑒定方法與流程

文檔序號(hào):12457534閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種鑒定細(xì)菌的多重PCR引物對(duì)組合,所述組合包括用于擴(kuò)增16SrDNA的V1-V8可變區(qū)的引物對(duì)P1、P3、P5和P6,其中,引物對(duì)P1的擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋可變區(qū)V1和V2,引物對(duì)P3的擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋可變區(qū)V3和V4,引物對(duì)P5的擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋可變區(qū)V5和V6,引物對(duì)P6的擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋可變區(qū)V7和V8,其中引物對(duì)P1與P5組合使用,P3與P6組合使用;每個(gè)引物對(duì)均包含正向引物和反向引物,每條正向引物和反向引物的序列分別由以下部分組成:從5’端到3’端依次為:與測(cè)序通用引物互補(bǔ)的序列、標(biāo)簽序列和與16S rDNA保守區(qū)結(jié)合的序列;優(yōu)選地,所述與測(cè)序通用引物互補(bǔ)的序列的長(zhǎng)度為16~22個(gè)核苷酸,所述與16S rDNA保守區(qū)結(jié)合的序列的長(zhǎng)度為14~24個(gè)核苷酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR引物對(duì)組合,其中各引物對(duì)中正向引物和反向引物的序列分別為:

P1:

正向引物:

ACACGACGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+AGAGTTTGATCCTGGCTNAG;

反向引物:

GACGTGTGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+CTGCTGCCTYNCGTA;

P3:

正向引物:

ACACGACGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+CCTACGGGNGGCWGCAG;

反向引物:

GACGTGTGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+GACTACHVGGGTATCTAATCC;

P5:

正向引物:

ACACGACGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+RGGATTANATACCC;

反向引物:

GACGTGTGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+CGACRRCCATNCANCACCT;

P6:

正向引物:

ACACGACGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+GYAACGAGCNCAACCC;

反向引物:

GACGTGTGCTCTTCCGATCT+標(biāo)簽序列+GACGNGCGGTGWGTRC。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的PCR引物對(duì)組合,其中各引物對(duì)中正向引物和反向引物的序列分別為:

P1:正向引物:SEQ ID NO:1,反向引物:SEQ ID NO:2;

P3:正向引物:SEQ ID NO:3,反向引物:SEQ ID NO:4;

P5:正向引物:SEQ ID NO:5,反向引物:SEQ ID NO:6;

P6:正向引物:SEQ ID NO:7,反向引物:SEQ ID NO:8。

4.一種鑒定細(xì)菌的試劑盒,包括如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的PCR引物對(duì)組合。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒,其中,所述試劑盒還包括PCR緩沖液、DNA聚合酶。

6.一種鑒定細(xì)菌的系統(tǒng),包括如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的PCR引物對(duì)組合或權(quán)利要求4或5所述的試劑盒。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng),還包括用于高通量測(cè)序的儀器和/或系統(tǒng)。

8.一種鑒定細(xì)菌的方法,包括使用如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的PCR引物對(duì)組合擴(kuò)增細(xì)菌DNA;優(yōu)選地,各PCR引物對(duì)中的各正向引物和反向引物在反應(yīng)體系中的濃度分別為1~5μM。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其中,所述細(xì)菌DNA為細(xì)菌基因組DNA。

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法,其中,所述方法包括利用引物對(duì)P1和P5將細(xì)菌16S rDNA的V1~V2可變區(qū)聯(lián)合V5~V6可變區(qū)同時(shí)擴(kuò)增,利用引物對(duì)P3和P6將V3~V4可變區(qū)聯(lián)合V7~V8可變區(qū)同時(shí)擴(kuò)增,然后將兩種擴(kuò)增得到的核酸混合到一起,構(gòu)建文庫(kù),進(jìn)行下一代測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,從而鑒定細(xì)菌種類(lèi)。

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