專利名稱：一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸序列，尤其是涉及一種一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制備方法。
背景技術(shù)：
在養(yǎng)殖業(yè)中，每年約有10%的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物死于感染性病害，其中弧菌感染導致的疾病占了相當大的比重。雖然化學藥品和抗生素可控制其感染，但是藥物防治常會產(chǎn)生不良后果，如在水產(chǎn)動物體內(nèi)積累、殘留，容易產(chǎn)生耐藥菌株和易污染環(huán)境等問題，因此建立病原弧菌的快速檢測技術(shù)，以提早防治病害的發(fā)生和流行仍是目前的主要手段。目前，弧菌的檢測方法主要是根據(jù)伯杰氏細菌鑒定手冊，通過對微生物的生理生化特征檢測進行鑒定，由于需要測試的項目較多，因此該方法工作量較大、操作較繁瑣。 16SrRNA的分子生物學方法雖有較高的準確性，但需要提取病原菌的16SrRNA，專業(yè)技術(shù)水平要求較高，且對檢測設(shè)備有一定要求，難以實現(xiàn)現(xiàn)場的快速檢測需要；免疫學方法制備的抗血清雖能實現(xiàn)快速檢測，但由于制備的抗血清為多克隆抗體，實際應(yīng)用中可能會出現(xiàn)假陽性或假陰性，即使采用單克隆抗體，由于制備技術(shù)要求較高、周期較長，使其應(yīng)用也受到一定的限制。指數(shù)富集配體進化技術(shù)(SystemicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment),簡稱SELEX技術(shù),是近年來新發(fā)展起來的一種系統(tǒng)篩選技術(shù)。它利用寡核苷酸分子可在空間形成多種多樣的三維結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)建的隨機寡核苷酸庫，從中篩選出與目標靶分子有特異識別作用的高親和力的寡核苷酸分子一適配子，其分子識別能力可達到甚至超過了單克隆抗體的水平，而制備技術(shù)則比單克隆抗體簡單、快速。運用該技術(shù)目前已篩選出腫瘤細胞、炭疽桿菌等的適配子，可用于腫瘤細胞和炭疽桿菌的檢測、識別。哈維氏弧菌是一種革蘭氏陰性、發(fā)光的(并非所有菌株)海洋弧菌，菌體呈弧狀， 極生單鞭毛。它廣泛分布于近岸溫暖的海水、海洋沉積物、海洋動物的體表，也是許多海洋脊椎動物和無脊椎動物的正常菌群。但是在某些特定條件下，如水質(zhì)惡化或環(huán)境異常等條件下常會引起養(yǎng)殖動物發(fā)病，是近些年來才被認識到的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的重要致病菌。溶藻弧菌是一種廣泛分布于世界各地海水及河口處的一種病原微生物，其數(shù)量居海水類弧菌之首，存在于多種海洋動物中，是魚、蝦、貝等海水養(yǎng)殖動物的條件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部發(fā)炎等疾病，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成十分嚴重的威脅。因此，運用SELEX技術(shù)篩選哈維氏弧菌和溶藻弧菌的共同適配子，將能同時識別檢測哈維氏弧菌和溶藻弧菌，從而能大大提高哈維氏弧菌和溶藻弧菌檢測的效率。中國專利CN102199667A公開一類可用于溶藻弧菌識別檢測的寡核苷酸序列及其應(yīng)用，包括SEQIDNo. I、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4四條寡核苷酸序列，且采用其中一條就能完成溶藻弧菌識別檢測。中國專利CN102329862A公開一種三條可用于溶藻弧菌識別檢測的寡核苷酸序列及其制備方法與應(yīng)用，寡核苷酸序列包括SEQIDNo. I 3。將寡核苷酸文庫與溶藻弧菌混合后進行SELEX篩選；SELEX篩選完成后對適配子富集文庫進行克隆測序；對測序結(jié)果中出現(xiàn)的高拷貝ssDNA進行不同長度的截取，得到一系列新的序列，再構(gòu)建這些新序列的互補序列；對獲得的新序列及其互補序列進行親和特異性的驗證，獲得相應(yīng)適配子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供不僅具有檢測快速、操作簡單、穩(wěn)定性高于抗體等特點，而且制備方法容易、制備周期較短的一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制備方法。所述一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No. I (該序列又可記為“C7” )、SEQ ID No. 2 (該序列可記為“C8” )、SEQ ID No. 3 (該序列可記為“C14”)和SEQ ID No.4(該序列可記為“C22”)4條寡核苷酸序列，且采用其中的一條寡核苷酸序列就能完成對哈維氏弧菌和溶藻弧菌的識別檢測；所述SEQ ID No. I 為5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCAC AAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述SEQ ID No. 2 為5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAG GCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述SEQ ID No. 3 為5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCAC AAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述SEQ ID No. 4 為5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAA GGCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'。所述一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制備方法包括以下步驟I、合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC——N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 為 35 個隨機寡核苷酸；2、將寡核苷酸文庫分別與哈維氏弧菌、溶藻弧菌混合后進行SELEX篩選，獲得適配子富集文庫；3、SELEX篩選完成后，對獲得的適配子富集文庫進行克隆測序；4、選擇測序結(jié)果中出現(xiàn)的高拷貝ssDNA，進行親和特異性的驗證，篩選獲得能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列。在步驟2中，所述SELEX篩選的具體方法為2. I弧菌菌液的制備用生理鹽水將哈維氏弧菌和溶藻弧菌菌落從斜面上洗滌下來，6000rpm離心，棄上清液，用生理鹽水重懸并稀釋菌液到下列濃度范圍1 X IO8 9X IO8個/ml，于_20°C低溫保存?zhèn)溆茫?. 2適配子的SELEX篩選，具體方法如下2. 2. I ssDNA與哈維氏弧菌的結(jié)合、分離，具體方法如下取ΙΟΟμΜ的ssDNA寡核苷酸文庫4μ L，用2X結(jié)合緩沖液稀釋至100 μ 1，95 °C變性5min，冰浴IOmin后加入100 μ I自然室溫恢復的哈維氏弧菌菌液，搖床結(jié)合30min，再6000rpm離心5min,棄上清,然后用IX結(jié)合緩沖液洗沉淀,棄上清；在沉淀中再加入IX結(jié)合緩沖液100 μ L,96°C加熱5min,然后15000rpm離心IOmin,取上清液,對沉淀再次加熱并離心，合并上清液，則可分離得到與哈維氏弧菌有親和力的ssDNA次級文庫；所述2X結(jié)合緩沖液為20X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的溶液，所述IX 結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液；所述20 X結(jié)合緩沖液配方為 IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2、pH 7.4。2. 2. 2 ssDNA與溶藻弧菌的結(jié)合、分離，具體方法如下將步驟2. 2. I分離得到的能與哈維氏弧菌結(jié)合的ssDNA，再與100 μ I自然室溫恢復的溶藻弧菌菌液，搖床結(jié)合30min，后續(xù)步驟同步驟2. 2. 1，則可分離到與溶藻弧菌和哈維氏弧菌都有親和力的ssDNA次級文庫。2. 2. 3不對稱PCR擴增ssDNA，具體方法如下對步驟2. 2. 2分離獲得的ssDNA次級文庫進行不對稱PCR擴增，總體積為25 μ I 的不對稱PCR擴增體系為IOXPCR 緩沖液2 μ I (可購于 Fermentas 公司)；Pl (10 μ Μ) :1 μ I (可購于上海生物工程公司)；Ρ2 (O. 2 μ Μ) : I μ I (可購于上海生物工程公司);dNTP (各 2. 5mM) :0. 4 μ I (可購于 Takara 公司);MgCl2 (25mM) : I. 2 μ I (可購于 Fermentas 公司)；ssDNA 模板(O. 2 μ g/ μ I) 2μ I ；Taq DNA 聚合酶(5u/ μ I) 0. 2 μ I (可購于 Fermentas 公司)；ddH20 17. 2μ I ；PCR反應(yīng)參數(shù)94°C預變性4min，然后進行40個循環(huán)(94°C變性30s，58°C退火 30s，72。。延伸 20s)，最后 72°C延伸 7min ；2. 2. 4親和力的測定(操作流程如圖2)，具體方法如下2. 2. 4. I擴增用帶有地高辛標記的引物Pl不對稱PCR擴增篩選出來的ssDNA次級文庫，擴增條件和參數(shù)與步驟2. 2. 3的不對稱PCR擴增體系和參數(shù)相同；2.2.4.2與菌結(jié)合取步驟2.2.4.1擴增所得的？0 產(chǎn)物10(^1^，951變性 5min，冰浴IOmin后加入到室溫恢復的100 μ L菌液中，充分混合，在室溫下結(jié)合30min，然后6000rpm離心，分離細菌沉淀與上清液，細菌沉淀中包含有與菌結(jié)合的帶地高辛標記的 ssDNA，上清液中是未結(jié)合的ssDNA，同時做一不加ssDNA的空白，即用2 X結(jié)合緩沖液代替 PCR產(chǎn)物，同樣進行上述操作；2. 2. 4. 3洗滌將細菌沉淀用I X結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌I次，6000rpm離心，棄
上清，取菌沉淀；2. 2. 4. 4與酶標兔抗地高辛抗體結(jié)合在菌沉淀中加入100 μ L I 900TBS稀釋的過量的酶標兔抗地高辛抗體，充分混合后，反應(yīng)IOmin,使之與菌沉淀中的地高辛標記的 ssDNA結(jié)合；所述TBS為O. 5M Tris-NaCl溶液，配制方法為先水溶8. 5 9g NaCl,再加 Tris-HCKO. 5M, ρΗ7· 6)溶液 100ml，最后加水定容至 IL ；0. 5M Tris-HCl (ρΗ7· 6，IOOml) 溶液配制方法稱取Tris 6. 06g,加入雙蒸水40ml溶解，滴加濃HCl調(diào)pH至7. 6，定容至IOOmlo2. 2. 4. 5洗滌6000rpm離心，去上清，再用I X結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌3次，得
菌沉淀；2.2.4.6 TMB (四甲基聯(lián)苯胺)顯色加入400 μ L雙蒸水重懸菌沉淀，再加入 200 μ L TMB顯色液，避光顯色IOmin后，以2mol/L H2SO4 200 μ L終止反應(yīng)，測定450nm處的吸光值OD45tl,該值即反映與菌結(jié)合的ssDNA的親和力，即ODg纟，空白同樣進行上述步驟 2. 2. 4. 3，2. 2. 4. 4，2. 2. 4. 5和2. 2. 4. 6，得到空白相應(yīng)的吸光度OD空白；所述TMB顯色液的配制方法為lmg/ml TMB :底物緩沖液30%過氧化氫= 100 900 I (V/V)，現(xiàn)配現(xiàn)用，其中l(wèi)mg/ml TMB是將TMB用無水乙醇配成lmg/ml ;底物緩沖液的配制稱取O. 5103g檸檬酸、I. 84g Na2HPO4 ·12Η20與燒杯中，溶解后加入蒸餾水定容至IOOml02. 2. 4. 7測定PCR產(chǎn)物中DNA的摩爾濃度取步驟2. 2. 4. I擴增所得的PCR產(chǎn)物， 以已知濃度梯度的初始ssDNA文庫為標準品，用Bandscan軟件作為圖像分析軟件，采用溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳法定量測定PCR產(chǎn)物中的DNA含量，獲得相應(yīng)DNA的摩爾濃度，進而可以計算出IOOyL PCR產(chǎn)物中的DNA摩爾數(shù)。
— OZ)申白2. 2. 4. 8計算相應(yīng)文庫的親和力親和力=-^―-———
100μ PCi 廣物中ZWJ的摩爾數(shù)2. 3重復篩選，具體方法為以每一輪不對稱PCR的產(chǎn)物作為下一輪的篩選文庫，重復上述SELEX篩選步驟 2. 2，直到親和力不再上升為止，則最后一輪篩選得到的ssDNA次級文庫即為篩選獲得的適配子富集文庫。在步驟3中，所述克隆測序的具體方法如下將步驟2篩選出的適配子富集文庫進行不對稱PCR擴增，擴增條件同步驟 2. 2. 3，擴增產(chǎn)物送測序公司進行克隆，并隨機挑取5個以上克隆進行測序，可以得到一系列具有如下結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列或ssDNA :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT
TC-NNNN......NNN-GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3'(其中 N 為 ATCG 中四種核苷
酸中的任何一種)，選擇具有這種結(jié)構(gòu)的ssDNA。在步驟4中，所述“選擇測序結(jié)果中出現(xiàn)的高拷貝ssDNA，進行親和特異性的驗證， 篩選獲得能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列”的具體方法如下4. I高拷貝的ssDNA的選擇對步驟3)獲得的一系列ssDNA進行比較分析，若發(fā)現(xiàn)有2或2個以上的ssDNA的全部序列是完全相同的，或者說在測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有2個以上的拷貝數(shù)的ssDNA，則進入下一步驟；若沒有發(fā)現(xiàn)多拷貝ssDNA，則重復步驟3)，繼續(xù)克隆測序，直到獲得至少一個多拷貝的ssDNA，然后選擇拷貝數(shù)較多且至少有2個以上拷貝數(shù)的 ssDNA進行后續(xù)操作；4. 2對步驟4. I獲得的多拷貝ssDNA進行親和特異性驗證，最終獲得4條對哈維氏弧菌和溶藻弧菌都有較好親和特異性的寡核苷酸序列(適配子)，具體方法如下4. 2. I合成需要進行驗證的ssDNA序列(由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)，并在5’端標記地高辛；4. 2. 2微生物的準備
選取水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境常見的病原微生物——嗜水氣單胞菌(AeiOmonas hydrophila)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)作為對照菌，將哈維式弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和這兩種對照菌,在無菌條件下分別接種到胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中，30°C下IOOrpm搖床培養(yǎng)8 IOh ;然后取菌液離心，棄上清培養(yǎng)液，再用生理鹽水稀釋到1\108 9\108個/!^，-201低溫保存?zhèn)溆茫?.2.3親和特異性的驗證4.2.3.1與菌結(jié)合取合成出的ssDNA序列IOpmol用2X結(jié)合緩沖液稀釋到 100μ 1，95°C變性5min，冰浴IOmin后，分別與嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、哈維式弧菌、溶藻弧菌這4種菌液各100 μ I混合(菌數(shù)量約為3 X IO8個)，在30°C、IOOrpm搖床結(jié)合30min,然后6000rpm離心5min,分離細菌沉淀與上清液，同時做一不加ssDNA的空白(即用2 X結(jié)合緩沖液代替ssDNA，同樣進行步驟4. 2. 3. I的操作)；4. 2. 3. 2洗滌將上述細菌沉淀用IX結(jié)合緩沖液500 μ I洗滌，6000rpm離心 5min,棄上清,取細菌沉淀；4.2.3.3與辣根過氧化物酶標記兔抗地高辛抗體結(jié)合在空白及實驗組菌沉淀中加入100 μ I I 1000TBS稀釋的辣根過氧化物酶標記兔抗地高辛抗體(辣根過氧化物酶標記兔抗地高辛抗體購于北京博奧森生物技術(shù)公司，與TBS的體積比為I : 1000)，充分混合反應(yīng)IOmin ；所述TBS為0. 5Μ Tris-NaCl溶液，配制方法為先水溶8. 5_9g NaCl，再加 Tris-HCKO. 5M、ρΗ7· 6)溶液 100ml,最后加水定容至 IL ；0. 5M Tris-HCl (pH7. 6，100ml) 溶液配制方法稱取Tris 6. 06g,加入雙蒸水40ml溶解，滴加濃HCl調(diào)pH至7. 6，定容至 IOOml。4. 2. 3. 4洗漆6000rpm離心5min,再用I X結(jié)合緩沖液500 μ I洗漆,棄上清,取
細菌沉淀；4.2.3.5顯色加入400 μ I雙蒸水重懸細菌沉淀，再加入200 μ I TMB顯色液，避光顯色IOmin后，以2mol/L H2SO4 200 μ I終止反應(yīng)，測定450nm處的吸光值OD450,該值即反映結(jié)合的酶標抗地高辛的OD值，即為空白同樣進行上述步驟4. 2. 3. 2,4. 2. 3. 3、
4.2. 3. 4和4. 2. 3. 5，得到空白相應(yīng)的吸光度OD空白，相應(yīng)適配子的親和力=OD結(jié)合-OD空白；4. 2. 3. 6數(shù)據(jù)處理分析用EXCEL軟件中的統(tǒng)計函數(shù)進行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計指標采用T檢驗進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計概率P < 0. 05為顯著差異，P < 0. 01為極顯著的差異，統(tǒng)計分析后獲得ssDNA對嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、哈維式弧菌和溶藻弧菌等4種菌的識別效果。若ssDNA對哈維氏弧菌和溶藻弧菌的親和力均顯著高于對其它兩株菌(嗜水氣單胞菌、遲緩型愛德華氏菌) 的親和力(P < 0. 05)，則這個ssDNA就是能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，它對哈維氏弧菌和溶藻弧菌都有顯著的特異性識別能力，可同時應(yīng)用于哈維氏弧菌和溶藻弧菌的識別檢測；若經(jīng)過親和特異性驗證和統(tǒng)計分析后，沒有發(fā)現(xiàn)能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，則重復步驟3和4，進一步進行克隆測序，從中選擇新的高拷貝ssDNA進行親和特異性驗證，直到獲得對哈維氏弧菌和溶藻弧菌都有顯著親和特異性的ssDNA，則這個ssDNA序列就是能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，可同時應(yīng)用于哈維氏弧菌和溶藻弧菌的識別檢測。
本發(fā)明所述一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，具有識別檢測哈維氏弧菌和溶藻弧菌的功能，且采用所述一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列中的任意一條就能夠單獨應(yīng)用于哈維氏弧菌和溶藻弧菌的檢測。所述四條寡核苷酸序列的5'端均標記有地高辛。所述一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列可用于各類樣品中哈維氏弧菌及溶藻弧菌的識別檢測。具體檢測方法如下(I)待測菌液制備取樣品，蒸餾水溶解后接種到胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB) 培養(yǎng)基中，30°C下IOOrpm搖床培養(yǎng)8 10h。然后取菌液離心，棄上清培養(yǎng)液，再用生理鹽水稀釋到IX 108 9X 108個/mL，_20°C低溫保存?zhèn)溆谩?2)親和特異性檢測然后用5'端標記有地高辛的上述四條寡核苷酸序列中的任意一條按說明書制備步驟4. 3. 2的親和特異性驗證方法對待測菌液進行親和力的檢測； 同時分別用哈維氏弧菌和溶藻弧菌代替待測菌液，同樣按說明書制備步驟4. 3. 2的親和特異性驗證方法進行親和力檢測，得到陽性對照1、2 ;用無菌蒸餾水代替待測菌液，同樣按說明書制備步驟4. 3. 2的親和特異性驗證方法進行親和力檢測，得到陰性對照；結(jié)果顯示陽性對照組顏色為黃色，陰性對照組不顯色；若待測樣品檢測結(jié)果呈現(xiàn)黃色，則說明樣品中有哈維氏弧菌或溶藻弧菌，或兩株菌均有，為陽性；若待測樣品檢測結(jié)果不顯色，則說明樣品中既沒有哈維氏弧菌，也沒有溶藻弧菌。本發(fā)明具有檢測快速，操作簡單，適配子的穩(wěn)定性高于抗體的特點，而且合成制備容易，制備周期較短。


圖I為SELEX篩選流程圖。圖2為親和力的測定流程圖。圖3為本發(fā)明實施例I中SEQ ID No. I適配子對4種菌的識別效果圖。在圖3中， 橫坐標為微生物，縱坐標為親和力。圖4為本發(fā)明SEQ ID No. 2適配子對4種菌的識別效果圖。在圖4中，橫坐標為微生物，縱坐標為親和力。圖5為本發(fā)明SEQ ID No. 3適配子對4種菌的識別效果圖。在圖5中，橫坐標為微生物，縱坐標為親和力。圖6為本發(fā)明SEQ ID No. 4適配子對4種菌的識別效果圖。在圖6中，橫坐標為微生物，縱坐標為親和力。在圖3 6中，柱形上的標記分別代表與嗜水氣單胞菌組、遲鈍愛德華氏菌組比較達到極顯著水平(P < O. 01)。
具體實施例方式實施例I本實施例的一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制備步驟主要包括I、弧菌菌液的制備
用生理鹽水將哈維氏弧菌和溶藻弧菌菌落從斜面上洗滌下來，6000rpm離心，棄上清液，用生理鹽水重懸并稀釋菌液到下列濃度范圍1 X IO8 9X IO8個/ml，于_20°C低溫保存?zhèn)溆茫?、適配子的SELEX篩選2. I ssDNA與哈維氏弧菌的結(jié)合、分離取ΙΟΟμΜ的ssDNA寡核苷酸文庫4 μ L，用2X結(jié)合緩沖液稀釋至100 μ 1，95 °C變性5min，冰浴IOmin后加入100 μ I自然室溫恢復的哈維氏弧菌菌液，搖床結(jié)合30min，再 6000rpm離心5min,棄上清,然后用IX結(jié)合緩沖液洗沉淀,棄上清；在沉淀中再加入IX結(jié)合緩沖液100 μ L,96°C加熱5min,然后15000rpm離心IOmin,取上清液,對沉淀再次加熱并離心，合并上清液，則可分離得到與哈維氏弧菌有親和力的ssDNA次級文庫；所述2 X結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的溶液，所述IX 結(jié)合緩沖液為20X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液；所述20X結(jié)合緩沖液配方為 IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2、pH 7.4。2.2 ssDNA與溶藻弧菌的結(jié)合、分離將步驟2. 2. I分離得到的能與哈維氏弧菌結(jié)合的ssDNA，再與100 μ I自然室溫恢復的溶藻弧菌菌液，搖床結(jié)合30min，后續(xù)步驟同2. 1，則可分離到與溶藻弧菌和哈維氏弧菌都有親和力的ssDNA次級文庫。2. 3 不對稱 PCR 擴增 ssDNA對2. 2分離獲得的ssDNA次級文庫進行不對稱PCR擴增?？傮w積為25 μ I的不對稱PCR擴增體系為IOXPCR 緩沖液2 μ I (可購于 Fermentas 公司)；Pl (10 μ Μ) : I μ I (可購于上海生物工程公司);Ρ2 (O. 2 μ Μ) : I μ I (可購于上海生物工程公司);dNTP (各 2. 5mM) :0. 4 μ I (可購于 Takara 公司);MgCl2 (25mM) : I. 2 μ I (可購于 Fermentas 公司)；ssDNA 模板(O. 2 μ g/ μ I) 2 μ I ；Taq DNA 聚合酶(5u/ μ I) 0. 2 μ I (可購于 Fermentas 公司)；雙蒸水17.2μ I;PCR反應(yīng)參數(shù)94°C預變性4min，然后進行40個循環(huán)(94°C變性30s，58°C退火 30s，72。。延伸 20s)，最后 72°C延伸 7min ；2. 4親和力的測定(操作流程如圖2)2. 4. I擴增用帶有地高辛標記的引物Pl不對稱PCR擴增篩選出來的ssDNA次級文庫，擴增條件和參數(shù)與步驟2. 3的不對稱PCR擴增體系和參數(shù)相同；2. 4. 2與菌結(jié)合取步驟2. 2. 4. I擴增所得的PCR產(chǎn)物ΙΟΟμ L，95°C變性5min， 冰浴IOmin后加入到室溫恢復的100 μ L菌液中，充分混合，在室溫下結(jié)合30min,然后 6000rpm離心，分離細菌沉淀與上清液，細菌沉淀中包含有與菌結(jié)合的帶地高辛標記的 ssDNA，上清液中是未結(jié)合的ssDNA，同時做一不加ssDNA的空白，即用2 X結(jié)合緩沖液代替 PCR產(chǎn)物，同樣進行上述操作；2. 4. 3洗滌將上述細菌沉淀用I X結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌I次，6000rpm離心，棄上清，取菌沉淀；2.4.4與酶標兔抗地高辛抗體結(jié)合在菌沉淀中加入IOOyL I 900TBS稀釋的過量的酶標兔抗地高辛抗體，充分混合后，反應(yīng)IOmin,使之與菌沉淀中的地高辛標記的 ssDNA結(jié)合；TBS為O. 5M Tris-NaCl溶液，配制方法為先水溶8. 5_9g NaCl,再加 Tris-HCKO. 5M, ρΗ7· 6)溶液 100ml，最后加水定容至 IL ；0. 5M Tris-HCl (ρΗ7· 6，IOOml) 溶液配制方法稱取Tris 6. 06g,加入雙蒸水40ml溶解，滴加濃HCl調(diào)pH至7. 6，定容至 IOOmlo2. 4. 5洗滌6000rpm離心，去上清，再用I X結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌3次，得菌
沉淀；2.4.6 TMB (四甲基聯(lián)苯胺)顯色加入400 μ L雙蒸水重懸菌沉淀，再加入200 μ L TMB顯色液，避光顯色IOmin后，以2mol/L H2SO4 200 μ L終止反應(yīng)，測定450nm處的吸光值 OD450,該值即反映與菌結(jié)合的ssDNA的親和力，即ODg纟，空白同樣進行上述步驟2. 2. 4. 3， 2. 2. 4. 4,2. 2. 4. 5和2. 2. 4. 6，得到空白相應(yīng)的吸光度OD空白；TMB顯色液配制方法為lmg/ml TMB 底物緩沖液30 %過氧化氫= 100 900 1(V/V)，現(xiàn)配現(xiàn)用。其中l(wèi)mg/ml TMB是將TMB用無水乙醇配成lmg/ml ;底物緩沖液的配制稱取O. 5103g檸檬酸、I. 84g Na2HPO4 ·12Η20與燒杯中，溶解后加入蒸餾水定容至IOOml02. 4. 7測定PCR產(chǎn)物中DNA的摩爾濃度取步驟2. 2. 4. I擴增所得的PCR產(chǎn)物，以已知濃度梯度的初始ssDNA文庫為標準品，用Bandscan軟件作為圖像分析軟件，采用溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳法定量測定PCR產(chǎn)物中的DNA含量，獲得相應(yīng)DNA的摩爾濃度，進而可以計算出IOOyL PCR產(chǎn)物中的DNA摩爾數(shù)。
權(quán)利要求
1.一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，其特征在于包括SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4四條寡核苷酸序列，且采用其中的一條寡核苷酸序列就能完成對哈維氏弧菌和溶藻弧菌的識別檢測；所述 SEQ ID No. I 為5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGA GGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述 SEQ ID No. 2 為5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCAC AAGAGGGAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述 SEQ ID 吣.3為5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACMGA GGGAGGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述 SEQ ID No. 4 為5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCA CAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'。
2.如權(quán)利要求I所述的一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(5'-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC——N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 為 35 個隨機寡核苷酸；2)將寡核苷酸文庫分別與哈維氏弧菌、溶藻弧菌混合后進行SELEX篩選，獲得適配子富集文庫；3)SELEX篩選完成后，對獲得的適配子富集文庫進行克隆測序；4)選擇測序結(jié)果中出現(xiàn)的高拷貝ssDNA，進行親和特異性的驗證，篩選獲得能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述SELEX篩選的具體方法為·2. I弧菌菌液的制備用生理鹽水將哈維氏弧菌和溶藻弧菌菌落從斜面上洗滌下來，6000rpm離心，棄上清液，用生理鹽水重懸并稀釋菌液到下列濃度范圍1X IO8 9X IO8個/ml，于-20°C低溫保存?zhèn)溆?；?. 2適配子的SELEX篩選，具體方法如下·2. 2. I ssDNA與哈維氏弧菌的結(jié)合、分離，具體方法如下取IOOyM的ssDNA寡核苷酸文庫4yL，用2X結(jié)合緩沖液稀釋至100μ1，95 變性5min，冰浴IOmin后加入100 μ I自然室溫恢復的哈維氏弧菌菌液，搖床結(jié)合30min，再 6000rpm離心5min,棄上清,然后用IX結(jié)合緩沖液洗沉淀,棄上清；在沉淀中再加入IX結(jié)合緩沖液100 μ L,96°C加熱5min,然后15000rpm離心IOmin,取上清液,對沉淀再次加熱并離心，合并上清液，則可分離得到與哈維氏弧菌有親和力的ssDNA次級文庫；所述2X結(jié)合緩沖液為20X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的溶液，所述IX結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液；所述20 X結(jié)合緩沖液配方為IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2、pH 7. 4 ；·2.2.2 ssDNA與溶藻弧菌的結(jié)合、分離，具體方法如下將步驟2. 2. I分離得到的能與哈維氏弧菌結(jié)合的ssDNA，再與100 μ I自然室溫恢復的溶藻弧菌菌液，搖床結(jié)合30min，后續(xù)步驟同步驟2. 2. 1，則可分離到與溶藻弧菌和哈維氏弧菌都有親和力的ssDNA次級文庫；·2. 2. 3不對稱PCR擴增ssDNA，具體方法如下對步驟2. 2. 2分離獲得的ssDNA次級文庫進行不對稱PCR擴增，總體積為25 μ I的不對稱PCR擴增體系為·10 X PCR 緩沖液2μ I ；Ρ1,10μΜ1μ I ；Ρ2，0·2μΜ:1μ I ； dNTP，各 2. 5mM 0. 4μ I ；MgCl2,25mM 1. 2μ I ；ssDNA 模板，0.2yg/yl:2yl;Taq DNA 聚合酶，5u/ μ I :0. 2 μ I ; ddH20 17. 2μ I ；PCR反應(yīng)參數(shù)94°C預變性4min，然后進行40個循環(huán)，94°C變性30s，58 °C退火30s， 72°C延伸20s，最后72°C延伸7min ；·2.2.4親和力的測定，具體方法如下·2. 2. 4. I擴增用帶有地高辛標記的引物Pl不對稱PCR擴增篩選出來的ssDNA次級文庫，擴增條件和參數(shù)與步驟2. 2. 3的不對稱PCR擴增體系和參數(shù)相同；·2. 2. 4. 2與菌結(jié)合取步驟2. 2. 4. I擴增所得的PCR產(chǎn)物100 μ L，95°C變性5min，冰浴 IOmin后加入到室溫恢復的100 μ L菌液中，充分混合，在室溫下結(jié)合30min，然后6000rpm 離心，分離細菌沉淀與上清液，細菌沉淀中包含有與菌結(jié)合的帶地高辛標記的ssDNA，上清液中是未結(jié)合的ssDNA，同時做一不加ssDNA的空白，即用2 X結(jié)合緩沖液代替PCR產(chǎn)物，同樣進行上述操作；·2.2.4.3洗滌將細菌沉淀用IX結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌I次，6000rpm離心，棄上清， 取菌沉淀；·2.2.4.4與酶標兔抗地高辛抗體結(jié)合在菌沉淀中加入IOOyL I 900TBS稀釋的過量的酶標兔抗地高辛抗體，充分混合后，反應(yīng)IOmin,使之與菌沉淀中的地高辛標記的 ssDNA結(jié)合；所述TBS為O. 5M Tris-NaCl溶液，配制方法為:先水溶8. 5 9g NaCl，再加Tris-HCl， O. 5Μ，ρΗ7· 6，溶液100ml，最后加水定容至IL ；0. 5M Tris-HCl溶液，pH7. 6，100ml，溶液配制方法稱取Tris 6. 06g,加入雙蒸水40ml溶解，滴加濃HCl調(diào)pH至7. 6，定容至IOOml ；·2. 2. 4. 5洗滌6000rpm離心，去上清，再用I X結(jié)合緩沖液500 μ L洗滌3次，得菌沉淀；·2.2.4.6 TMB (四甲基聯(lián)苯胺)顯色加入400 μ L雙蒸水重懸菌沉淀，再加入200 μ L TMB顯色液，避光顯色IOmin后，以2mol/L H2SO4 200 μ L終止反應(yīng)，測定450nm處的吸光值 OD450,該值即反映與菌結(jié)合的ssDNA的親和力，即ODg纟，空白同樣進行上述步驟2. 2. 4. 3， 2. 2. 4. 4,2. 2. 4. 5和·2. 2. 4. 6，得到空白相應(yīng)的吸光度OD空白；所述TMB顯色液的配制方法為按體積比，lmg/ml TMB :底物緩沖液30%過氧化氫 =100 900 1，其中l(wèi)mg/ml TMB是將TMB用無水乙醇配成lmg/ml ;底物緩沖液的配制 稱取O. 5103g檸檬酸、I. 84g Na2HPO4 · 12H20與燒杯中，溶解后加入蒸餾水定容至IOOml ；·2. 2. 4. 7測定PCR產(chǎn)物中DNA的摩爾濃度取步驟2. 2. 4. I擴增所得的PCR產(chǎn)物，以已知濃度梯度的初始ssDNA文庫為標準品，用Bandscan軟件作為圖像分析軟件，采用溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳法定量測定PCR產(chǎn)物中的DNA含量，獲得相應(yīng)DNA的摩爾濃度，進而可以計算出100 μ L PCR產(chǎn)物中的DNA摩爾數(shù)； ·2.2.4.8計算相應(yīng)文庫的親和力
4.如權(quán)利要求2所述的一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述克隆測序的具體方法如下將步驟2篩選出的適配子富集文庫進行不對稱PCR擴增，擴增條件同步驟2. 2. 3， 擴增產(chǎn)物送測序公司進行克隆，并隨機挑取5個以上克隆進行測序，可以得到一系列具有如下結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列或ssDNA 5 ' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC-NNNN......NNN-GCACAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3'(其中 N 為 ATCG 中四種核苷酸中的任何一種)，選擇具有這種結(jié)構(gòu)的ssDNA。
5.如權(quán)利要求2所述的一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述“選擇測序結(jié)果中出現(xiàn)的高拷貝ssDNA，進行親和特異性的驗證，篩選獲得能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列”的具體方法如下·4.1高拷貝的ssDNA的選擇對步驟3)獲得的一系列ssDNA進行比較分析，若發(fā)現(xiàn)有2 或2個以上的ssDNA的全部序列是完全相同的，或者說在測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有2個以上的拷貝數(shù)的ssDNA，則進入下一步驟；若沒有發(fā)現(xiàn)多拷貝ssDNA，則重復步驟3)，繼續(xù)克隆測序， 直到獲得至少一個多拷貝的ssDNA，然后選擇拷貝數(shù)較多且至少有2個以上拷貝數(shù)的ssDNA 進行后續(xù)操作；·4. 2對步驟4. I獲得的多拷貝ssDNA進行親和特異性驗證，最終獲得4條對哈維氏弧菌和溶藻弧菌都有較好親和特異性的寡核苷酸序列，具體方法如下·4. 2. I合成需要進行驗證的ssDNA序列，并在5’端標記地高辛；·4. 2. 2微生物的準備選取水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境常見的病原微生物-嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)作為對照菌，將哈維式弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和這兩種對照菌，在無菌條件下分別接種到胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，30°C下IOOrpm搖床培養(yǎng)8 10h ;然后取菌液離心，棄上清培養(yǎng)液，再用生理鹽水稀釋至IJ IX IO8 9X IO8個/mL, _20°C低溫保存?zhèn)溆?；?. 2. 3親和特異性的驗證·4. 2. 3. I與菌結(jié)合取合成出的ssDNA序列IOpmol用2 X結(jié)合緩沖液稀釋到100 μ 1， 95°C變性5min，冰浴IOmin后，分別與嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、哈維式弧菌、溶藻弧菌這4種菌液各100 μ I混合，菌數(shù)量為3父108個，在301、100印111搖床結(jié)合301^11，然后.6000rpm離心5min，分離細菌沉淀與上清液，同時做一不加ssDNA的空白，即用2 X結(jié)合緩沖液代替ssDNA，同樣進行步驟4. 2. 3. I的操作；.4. 2. 3. 2洗滌將上述細菌沉淀用IX結(jié)合緩沖液50(^1洗滌，6000印111離心51^11，棄上清，取細菌沉淀；.4. 2. 3. 3與辣根過氧化物酶標記兔抗地高辛抗體結(jié)合在空白及實驗組菌沉淀中加入 100 μ I I 1000 TBS稀釋的辣根過氧化物酶標記兔抗地高辛抗體，充分混合反應(yīng)IOmin ;所述TBS為O. 5Μ Tris-NaCl溶液，配制方法為先水溶8. 5 9g NaCl，再加Tris-HCl 溶液100ml, O. 5Μ，ρΗ7· 6，最后加水定容至IL ；0. 5Μ Tris-HCl溶液100ml, ρΗ7· 6，溶液配制方法稱取Tris 6. 06g,加入雙蒸水40ml溶解，滴加濃HCl調(diào)pH至7. 6，定容至IOOml ；.4. 2. 3. 4洗滌6000rpm離心5min，再用I X結(jié)合緩沖液500 μ I洗滌，棄上清，取細菌沉淀；.4. 2. 3. 5顯色加入400 μ I雙蒸水重懸細菌沉淀，再加入200 μ I TMB顯色液，避光顯色IOmin后，以2mol/L H2SO4 200 μ I終止反應(yīng)，測定450nm處的吸光值OD45tl，該值即反映結(jié)合的酶標抗地高辛的OD值，即為空白同樣進行上述步驟4. 2. 3. 2,4. 2. 3. 3,4. 2. 3. 4 和4. 2. 3. 5，得到空白相應(yīng)的吸光度OD空白，相應(yīng)適配子的親和力=OD結(jié)合-OD空白；.4. 2. 3. 6數(shù)據(jù)處理分析用EXCEL軟件中的統(tǒng)計函數(shù)進行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計指標采用T檢驗進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計概率P < O. 05為顯著差異，P <0.01為極顯著的差異，統(tǒng)計分析后獲得ssDNA對嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、哈維式弧菌和溶藻弧菌等4種菌的識別效果；若ssDNA對哈維氏弧菌和溶藻弧菌的親和力均顯著高于對嗜水氣單胞菌和遲緩型愛德華氏菌的親和力，P<O. 05，則這個ssDNA就是能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，它對哈維氏弧菌和溶藻弧菌都有顯著的特異性識別能力，可同時應(yīng)用于哈維氏弧菌和溶藻弧菌的識別檢測；若經(jīng)過親和特異性驗證和統(tǒng)計分析后，沒有發(fā)現(xiàn)能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，則重復步驟3和4，進一步進行克隆測序，從中選擇新的高拷貝ssDNA進行親和特異性驗證，直到獲得對哈維氏弧菌和溶藻弧菌都有顯著親和特異性的ssDNA，則這個ssDNA序列就是能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，可同時應(yīng)用于哈維氏弧菌和溶藻弧菌的識別檢測。
全文摘要
一組能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制備方法，涉及哈維氏弧菌和溶藻弧菌的識別檢測。寡核苷酸序列包括SEQ ID No.1～4。合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)；將寡核苷酸文庫分別與哈維氏弧菌、溶藻弧菌混合后進行SELEX篩選；SELEX篩選完成后對適配子富集文庫進行克隆測序；選擇測序結(jié)果中出現(xiàn)的高拷貝ssDNA，進行親和特異性的驗證，獲得相應(yīng)適配子。
文檔編號C12Q1/68GK102605075SQ201210079530
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者鄭江, 郝聚敏 申請人:集美大學