專利名稱：一種大豆根特異的高效磷轉(zhuǎn)運蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種大豆轉(zhuǎn)運蛋白及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷是生物生長發(fā)育的重要營養(yǎng)元素之一，是蛋白質(zhì)、核酸、脂類以及各種重要的小分子(如能源供應(yīng)者ATP)的重要組成成分，是各種代謝(如糖降解)必須的中介物，是生長發(fā)育的調(diào)節(jié)物(如磷酸化)。因此，施加磷肥對提高農(nóng)產(chǎn)量起著關(guān)鍵作用。但是，磷是一種不可再生的資源，由于長期以來的過度利用，使得磷正在逐步成為一種地球上即將消失 的礦產(chǎn)資源，在不遠的將來，磷將制約各國的經(jīng)濟和政治命脈，磷也將成為許多國家的戰(zhàn)略物資(Steven Van Kauwenbergh)。然而，為了提高作物的產(chǎn)量，農(nóng)業(yè)上還在不斷增加磷的施用量。據(jù)報道，我國小麥產(chǎn)區(qū)的磷施用量是小麥生長發(fā)育所需的兩倍(Vitousek，等，2009);另外，人和動物糞中含有大量的磷也被直接釋放到環(huán)境中。結(jié)果導(dǎo)致土壤和水體中磷含量大量增加，引起環(huán)境污染。同時，在水體和土壤中的磷大多數(shù)是植物不可利用的有機磷。這樣，導(dǎo)致了土壤中的有效磷含量低。因此，提高植物對磷的利用率對于減少農(nóng)業(yè)磷的施用量，維護生態(tài)安全，提高作物的產(chǎn)量，保障國家磷的戰(zhàn)略安全等方面具有重要和關(guān)鍵的意義。大豆是重要的農(nóng)作物之一，是植物蛋白質(zhì)、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂等次生代謝產(chǎn)物的重要來源，其產(chǎn)量與土壤磷的供應(yīng)量和植株對磷的吸收能力直接相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06。本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06的基因。本發(fā)明的再一目的是提供上述編碼大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06的基因在提高植物對磷的利用率以及提高植物在磷脅迫下的抗逆能力中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06，其具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供含有編碼大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06基因的載體及含有該載體的宿主細胞。本發(fā)明還提供含有編碼大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHTOe基因的轉(zhuǎn)化植物細胞及轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明進一步提供編碼大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06的基因在提高植物對磷的利用率以及提高植物在磷脅迫下的抗逆能力中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述植物為擬南芥、大
Λ7. -rf* ο本發(fā)明提供的GmPHTO6 基因(全稱為 Glycine max phosphate transporter 06)是從大豆墾農(nóng)18(由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)中克隆到的基因，基因的開發(fā)閱讀框為1602bp，它編碼534個氨基酸；大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06具有12個跨膜域(圖I)和植物PHTl 特征域 GGDYPLSATIxSE (圖 2);用實時定量 PCR(quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)方法檢測到GmPHT06基因主要在大豆根器官中特異表達(圖3)，未檢測到GmPHT06基因在大豆葉、莖、花和種子等地上器官中的表達(圖3)，GmPHT06基因的表達顯著受低磷脅迫的誘導(dǎo)(圖3) ；GmPHT06蛋白在細胞中定位于細胞膜(圖4) ; GmPHT06基因能恢復(fù)酵母的磷轉(zhuǎn)運蛋白雙突變體PAM2(即APho84/APho89)的表現(xiàn)型，可以在低磷條件下正常生長(圖5);動力學(xué)分析顯示GmPHT06蛋白具有對磷高親和力的特點(圖5)。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果(I)本發(fā)明提供了大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06(氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示)及編碼該蛋白的基因(核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示)。(2)過表達GmPHT06基因可以提高酵母對磷的利用率。 (3)本發(fā)明提供的大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06可用于提高各種植物對磷的利用率，提高植物在磷脅迫下的抗逆能力，從而提高植物的產(chǎn)量。


圖I為本發(fā)明用TMHMM2. O軟件分析的結(jié)果顯示大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06具有12個跨膜域(上圖，詳細位置與下圖的氨基酸位置對應(yīng))以及各個跨膜域的具體位置(下圖)。圖2為本發(fā)明大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06與擬南芥AtPHTl ；4高度同源，PHTl特征域以箭頭指示的方框標(biāo)示。圖3為本發(fā)明大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06在不同組織中和磷脅迫條件下的表達水平，其中，R -M ；u :單葉；T1 :第一復(fù)葉；T2 :第二復(fù)葉；Τ3 :第三復(fù)葉；Τ4 :第四復(fù)葉；NI :莖從下往上的第一節(jié)間；S :莖；F :花；S-S1 :開花后7天的莢；S-S2 :開花后14天的莢；S-S3 :開花后21天的莢；S1 :開花后第7天的種子；S2 :開花后第14天的種子；S3 :開花后第21天種子；S4 :成熟種子。短線后的字母標(biāo)示器官名稱，短線前的字母標(biāo)示發(fā)育時期(即相應(yīng)字母標(biāo)示器官成熟的時期)。圖4為本發(fā)明大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06定位于細胞膜上(左圖為熒光信號圖，中圖為明場圖，右圖為左圖和中圖的疊加效果圖。熒光信號用箭頭指示)。洋蔥表皮細胞經(jīng)轉(zhuǎn)化GFP標(biāo)記的GmPHT06基因后，再經(jīng)質(zhì)壁分離后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。圖5為本發(fā)明GmPHT06基因在酵母磷轉(zhuǎn)運蛋白雙突變體PAM2(即Apho84/Apho89)中的異源表達的互補結(jié)果，其中，左圖控載體轉(zhuǎn)化的效果(對照)，中圖為轉(zhuǎn)化GmPHT06基因的互補圖(縱坐標(biāo)為培養(yǎng)基的磷濃度，橫坐標(biāo)為菌液的稀釋倍數(shù))。彩圖中紅褐色表示沒有活性，黃色表示有活性，黃色越淺，活性越強(在黑白圖中，顏色越淺表示活性越強)；右圖為轉(zhuǎn)化GmPHT06基因的酵母的動力學(xué)生長曲線，顯示親和常數(shù)為82. 7μΜ，表明為GmPHT06高親和磷轉(zhuǎn)運載體。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例I GmPHT06基因的克隆以大豆品種墾農(nóng)18(KN18)為試驗材料，在低磷脅迫(H2PO4, 100 μ Μ)下的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至真葉張開，取根、莖和葉，利用Trizol試劑盒提取總mRNA(Invitrogen公司)，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)對總mRNA進行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。液體培養(yǎng)基成份
H3BO350xl0'3mM
MnS04*H20IOxlO'3 mM
ZnSO4WH2O2xl0'3 mM
CuS04*5H201.5χ10'3 mM
Na2Mo04.2H20 0.58xl0'3 mM FeS04.7H200.1 mM
Na2EDTAGH2O0.1 mM
KH2PO4IOmM
KNO32.5 mM
MgS04.7H20IOmM
Ca(N03)2*4H202.5 mM以大豆品種墾農(nóng)18(KN18)為試驗材料，通過RT-PCR(其程序為95°C預(yù)變性3min ；94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 2min, 26 循環(huán)；72 °C 5min。反應(yīng)體系0. 3 μ L LA TaqDNA 聚合酶，I μ L 引物 F，I μ L 引物 R，5 μ L IOX 緩沖液，4 μ L dNTP mix, 2 μ L cDNA,36. 7 μ L H2O ;總體系為 50 μ L。其中，引物 F 5-ATGGCTGGAGAATTGGGAGTTT-3 ;引物 R :5’-GGAACAGGAACTGTCCTAGCAG-3’。擴增得到GmPHT06。將其重組到Gateway克隆體系的入門載體pGwC上。并送三博遠志生物公司測序，檢測GmPHT06的正確性。分析檢測正確的GmPHT06基因，基因的開發(fā)閱讀框為1602bp，它編碼534個氨基酸；大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06具有12個跨膜域(圖I)和植物PHTl特征域GGDYPLSATIxSE(圖 2)。實施例2 GmPHT06基因在酵母中的表達通過Gateway克隆體系將GmPHT06重組到pYES_DEST52載體(購自Invitrogen公司)上，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到缺失兩個高親和磷轉(zhuǎn)運基因(PH089和PH084)的酵母突變體 PAM2 ( Δ pho89: : TRPl Δ pho84: :HLS3 ade2 leu2 his3 trpl ura3。Martinez,P. , Zvyagilskaya, R. , Allard, P 和 Persson, B. 1998.Physiological regulationof the derepressible phosphate transporter in Saccharomyces cerevisiae.J. Bacteriol. 180, 2253-2256.)中。在GAL(半乳糖)啟動子的作用下，GmPHT06可以互補PH084和PH089的功能，即PAM2可以在低磷(< 50 μ M)條件下正常生長。實施例3 GmPHT06基因在大豆中的表達及其在提高大豆對磷的利用率中的應(yīng)用選用籽粒飽滿且一致的大豆KN18作為測試材料。將其播種于新的蛭石中保濕催芽，于各個生長時期對各器官取樣分析；磷脅迫實驗是將大豆萌發(fā)出土 2-3天后，移入H2PO4A 500μ M的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至真葉張開。移至H2PO4的濃度梯度為5μ M的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后取樣，同實施例I中的操作。利用qRT-PCR檢測GmPHT06受磷脅迫的調(diào)控影響。引物F:5，-TTGGTTGTGACGTGTTTACACC-3，；引物 R : 5，-ACAAAAGTAAGAACCAAAAGCAAAC-3，。PCR 程序ABI St印One進行，用SYBR Green I檢測熒光信號。采用15 μ I反應(yīng)體系，體系配
制如下
SYBR Primix Ex Taq( 2χ ) 7.5 ul
上游引物(10UM)0.3 ul
下游引物(10UM)0.3 ul
ROX Reference Dye ( 50x )0.3 ul
cDNA1.0 ul
ddH,0 (滅菌雙蒸水)4.6 ul
共計15 ulqRT-PCR 參數(shù)如下兩步法95°C10S，熱啟動；95°C 5S，60°C lmin,40 個循環(huán)。從檢查結(jié)果來看，GmPHT06在根中特異表達(圖3左。圖中橫坐標(biāo)器官 縮寫為 短橫線前的字母U表示單葉期大豆，F(xiàn)表示開花期大豆，S表示莢，seed表示種子；短橫線后的字母表示相應(yīng)的器官，R，根；A，地上部；H，下胚軸；C，子葉；E，上胚軸；U，單葉；T1 T4，第一至第四復(fù)葉，F(xiàn)，花；S，莢；，不同時期的莢；NI，第一節(jié)間)，并受低磷的強調(diào)控。磷濃度為5 μ M時基因的表達量超過對照500 μ M的5倍(圖3右)。但在有磷的條件下，GmPHT06的表達與磷的供給濃度成正相關(guān)。洋蔥表皮瞬時表達分析表明，GmPHT07蛋白在細胞中定位于細胞膜(圖4，左圖為YFP熒光信號圖，中間為白光圖，右圖為前二者的重疊圖)；GmPHT07基因能恢復(fù)酵母的磷轉(zhuǎn)運蛋白雙突變體PAM2(即APho84/APho89)的表現(xiàn)型，可以在磷脅迫的條件下正常生長(圖5，左和中間圖)；動力學(xué)分析顯示GmPHT07蛋白具有對磷高親和力的特點，Km值為82. 7 μ M，稀釋100倍的菌液在10 μ M低濃度磷條件下可以正常生長(圖5，右圖)。實施例4GmPHT06基因在擬南芥中的表達及其在提高擬南芥對磷的利用率中的應(yīng)用將GmPHT06基因構(gòu)建在由35S啟動子驅(qū)動的雙元載體pLeela(pLeela載體來自德國馬普 Drs. George Coupland 實驗室，已公開在文獻 I. Liu, Y. X.，Koornneef, M.，and Soppe, ff. J. (2007)The Absence of Histone H2B Monoubiquitination in theArabidopsis hubI (rdo4)Mutant Reveals a Role for Chromatin Remodeling in SeedDormancy. The Plant Cell. 19 :433-444 ；2. Hanano, S. , Stracke, R. , Jakoby, M. , Merkle,T. , Domagalska, M. A. , Weisshaar, B. , and Davis, S. J. (2008)Asystematic surveyin Arabidopsis thaliana of transcription factors that modulate circadianparameters. BMC genomics. 9 :182)上,過表達到擬南芥中檢測該基因的功能，已獲得轉(zhuǎn)基因植株。并用測定了 3棵獨立轉(zhuǎn)基因植株在低磷(濃度為10 μ M)脅迫的條件下植物體內(nèi)總磷含量的變化。取生長14天的幼苗，用超純水清洗干凈，放入60°C烘箱中過夜烘干，將稱量后的樣品(100 300mg)直接放入消化罐中，加入7ml 68%的HNO3和2ml 30%的H2O2 (優(yōu)級純)，用 Microwave laboratory system (Milestone, Italy)在 18CTC,lKPa 條件下消化15min。冷卻后,將消化液轉(zhuǎn)入25ml用超純水洗凈并烘干的容量瓶中，用超純水定容至 25ml ο 用 Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer (ICP-0ES,Perkin Elmer, USA),以磷的標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線測定磷含量,每個樣品重復(fù)測量3次。從測定結(jié)果來看，轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型的總磷含量提高了 4.2%。由此可見，基因GmPHT06過表達于植物中，增強了轉(zhuǎn)基因植物在低磷脅迫條件下吸收磷的能力，進而有效地提高了植物抗低磷脅迫的能力。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06，其特征在于，其具有 1)由SEQID No. 2所示的氨基酸序列；或 2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. I所示的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的宿主細胞。
6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)化植物細胞。
7.權(quán)利要求2或3所述的基因在提高植物對磷的利用率以及提高植物在磷脅迫下的抗逆能力中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物為擬南芥。
9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物為大豆。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，以及編碼該蛋白的基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的大豆根特異的磷轉(zhuǎn)運蛋白GmPHT06可用于提高各種植物對磷的利用率，提高植物在磷脅迫下的抗逆能力，從而提高植物的產(chǎn)量。
文檔編號C12N15/63GK102702336SQ201210078440
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者傅永福, 張曉玫, 范成明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所