專利名稱：克雷伯氏菌屬的細菌分離物以及從其中分離的異麥芽酮糖合酶基因的制作方法
背景技術：
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及細菌分子生物學和重組DNA技術。
2.相關現(xiàn)有技術描述異麥芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖)是一種具有物理特性的還原糖，味似蔗糖。它是蜂蜜中天然存在的蔗糖的結(jié)構(gòu)同分異構(gòu)體(Sporns et al.，1992)。把異麥芽酮糖當作蔗糖的替代品有以下幾點優(yōu)勢(1)它不被導致齲齒的口腔鏈球菌代謝，不腐蝕牙齒(Minami et al.，1990)；(2)它的攝入對血中糖和胰島素的濃度影響很小，說明它可以做為腸道外營養(yǎng)物，非糖尿病和糖尿病患者都可以接受(Kawai，et al.，1989)；(3)與蔗糖不同，它在絕大多數(shù)細菌和酵母菌中不發(fā)酵，在酸性溶液中更穩(wěn)定，異麥芽酮糖的這些特性便于保持它在發(fā)酵食物和飲料中的甜度和味道(Takazoe，1989；Schiweck etal.，1991)；(4)它不具有蔗糖和果糖的吸濕特性，含異麥芽酮糖的食物比含蔗糖的食物更穩(wěn)定(Takazoe，1989)；(5)在人腸的微生物群區(qū)中，它選擇性刺激雙歧菌的生長(Mizutani，T.1989)。越來越多的證據(jù)表明雙歧菌有助于保持人體的健康和減緩衰老的過程(Mitsuoka，T.1990)。在日本的食物中，異麥芽酮糖已廣泛用做糖的替代品(Takazoe，1989)。利用生化方法把蔗糖轉(zhuǎn)變成異麥芽酮糖，全世界每年的產(chǎn)量超過1萬噸(Kunz，1993)。
異麥芽酮糖還是合成表面活性劑和多聚物的原材料。因為每年的蔗糖產(chǎn)量達1億1千萬噸，所以它是世界上最高產(chǎn)的可再生產(chǎn)有機復合物。然而，因為它糖鏈間的不穩(wěn)定性和缺乏特異化學反應性，所以利用蔗糖做為化學工業(yè)的原材料大大受限(Kunz，1993)。另一方面，異麥芽酮糖是蔗糖的還原性異構(gòu)體，能被特異性氧化并衍生成不同的化學產(chǎn)品。異麥芽酮糖能成功制備聚酰胺和聚脲(Kunz，1993)。
已知有幾個菌種可以把蔗糖轉(zhuǎn)變成異麥芽酮糖。美國專利No.4,359,531描述了生產(chǎn)異麥芽酮糖的過程，包括固定Erwinia rhapontici菌的整個菌體或整個或斷裂菌體的溶劑抽提物。大約70-95％的蔗糖轉(zhuǎn)變成異麥芽酮糖。美國專利No.4,390,627描述了從Protaminobacterrubrum固定蔗糖變位酶生產(chǎn)異麥芽酮糖的方法。美國專利No.4,670,387描述了使用Erwinia rhapontici、Protaminobacter rubrum、Serratia plymuthica、Esevinia carotovora var atroseptica、Erwiniadissolvens和Serratia merscescens的固定化菌體生產(chǎn)異麥芽酮糖的發(fā)酵過程。大約可以轉(zhuǎn)化70-95％蔗糖。美國專利No.4,857,461公開了從Protaminobacter rubrum、Serratia plymuthica和Erwinia carotovora菌得到的固定化粗酶連續(xù)生產(chǎn)異麥芽酮糖的過程。美國專利No.5,229,276和No.5,336,617描述了用Pseudomonas mesoacidophila和Agrobacterium radiobacter菌的固定化菌體生產(chǎn)海藻糖和異麥芽酮糖的過程。
單個酶——異麥芽酮糖合酶(EC5.4.99.10)可以把蔗糖轉(zhuǎn)變成異麥芽酮糖。雖然幾種細菌能夠把蔗糖轉(zhuǎn)變成異麥芽酮糖，但產(chǎn)量很不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率為8-86％(Tsuyuki et al.，1992；Nagai et al.，1994；Huang etal.，1998)。而且，這些生產(chǎn)異麥芽酮糖的菌株不僅把蔗糖轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖和海藻糖還產(chǎn)生2-7％的葡萄糖做為副產(chǎn)品(McAllister et al.，1990；Tsuyuki et al.，1992；Huang et al.，1998)。這是一個值得考慮的工業(yè)問題，因為需要復雜的純化過程去除這些污染的復合物(Sugitani etal.，1993，U.S.Patent No.5,229,276)。一些菌株甚至能夠把異麥芽酮糖水解成葡萄糖和果糖。
最近，美國專利No.5,786,140公開了從幾種有生物體中分離了蔗糖異構(gòu)酶的基因。根據(jù)純化的蔗糖異構(gòu)酶N端的氨基酸序列，使用DNA探針從Protaminobacter rubrum和Enterobacter sp菌中克隆了蔗糖異構(gòu)酶的基因。利用PCR技術進一步從E.Rhapontici和P.Mesoacidphila菌中分離了蔗糖異構(gòu)酶的部分DNA序列。
發(fā)明簡述能夠高效生產(chǎn)異麥芽酮糖的細菌和酶對于生物技術的應用和進一步理解酶的機制具有重大的意義。
本發(fā)明涉及一個新細菌純培養(yǎng)株，分類學鑒定為新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis)。該菌株具有高效的酶活把蔗糖轉(zhuǎn)變成異麥芽酮糖。
本發(fā)明進一步還包括使用此新加坡克雷伯氏菌的固定化菌體生產(chǎn)異麥芽酮糖的過程。與那些以前公開的專利相比，蔗糖的轉(zhuǎn)化率超過99％，異麥芽酮糖的含量超過87％，葡萄糖的含量不到1％。利用功能性克隆方法從新加坡克雷伯氏菌克隆了編碼蔗糖異構(gòu)酶的新基因，與從Enterobacter sp菌分離得到的蔗糖異構(gòu)酶高度同源，但有幾個氨基酸的不同。
附圖簡述


圖1是蔗糖培養(yǎng)基上生長的新加坡克雷伯氏菌菌株的負染電子顯微鏡照片。
圖2是從16S rRNA序列資料分析得到的系統(tǒng)進化樹，顯示了新加坡克雷伯氏菌菌株的位置。用鄰域連接方法得到分枝模型。到下一個節(jié)點的數(shù)目顯示了從1000個數(shù)據(jù)集得到的引導值百分率。
圖3詳述了在所選的屬于Enterobacteriaceae家族細菌中，根據(jù)部分rpoB基因序列資料分析得到新加坡克雷伯氏菌的系統(tǒng)發(fā)生位置。
圖4顯示了在新加坡克雷伯氏菌培養(yǎng)物中異麥芽酮糖和KIS酶的活性。A是24小時細菌生長的詳細情況。B是相同時間內(nèi)KIS酶活性的詳細情況。C是相同時間內(nèi)培養(yǎng)基中檢測到的異麥芽酮糖。
圖5是從新加坡克雷伯氏菌克隆KIS基因的策略。優(yōu)選的克隆在LB肉湯培養(yǎng)基中，含5％蔗糖，37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)18小時。用DNS方法(Miller，1959)判定肉湯中的還原糖。pBluescript II SK(+)做為插入片段的克隆載體。
圖6A是新加坡克雷伯氏菌KIS基因的核苷酸序列。上游和終止子區(qū)的DNA序列用斜體字，開放讀碼框(ORF)的DNA序列使用正常字體。推測的潛在核糖體結(jié)合區(qū)(SD)用下橫線標示。上游推測的蔗糖可誘導區(qū)用雙橫線標出。螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)合位點的同源序列用框標示。粗體字體表示下游終止位點。圖6B是翻譯后KIS蛋白的氨基酸序列。推測的蔗糖結(jié)合位點用下橫線標示。
圖7是KIS基因中推測蔗糖可誘導啟動子的富AT區(qū)相關的同源序列。Kis是新加坡克雷伯氏菌LX3中異麥芽糖合酶的基因。數(shù)字表示從轉(zhuǎn)錄起始點的距離(bp)，而kis中的數(shù)字表示從翻譯起始點ATG的距離(bp)。
圖8詳細比較了kis蛋白與利用蔗糖做底物的其他酶之間推測的蔗糖結(jié)合位點間的氨基酸序列。數(shù)字表示距離酶N末端的位置。
發(fā)明詳述從新加坡的土壤樣品和甘蔗的根部分離了兩株純菌種LX3和LX21，它們能把蔗糖轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖。
根據(jù)以前發(fā)表的對克雷伯氏菌的描述(Orskov，1984)，此菌具有如下形態(tài)學特征革蘭氏染色和氧化酶反應陰性，兼性需氧，桿狀，不運動，V.P.實驗呈陽性和能夠產(chǎn)生芽孢。這些特征與本發(fā)明分離得到的菌株一致，說明LX3和LX21菌株應屬于克雷伯氏菌。
本發(fā)明分離到的菌株與那些已知的克雷伯氏菌株比較，表現(xiàn)型有顯著差別，包括產(chǎn)生吲哚，在10℃生長，利用乳糖產(chǎn)生氣體和甲基紅實驗(見表1)。
與從最相關的肺炎克雷伯氏菌分離出菌株的不同點是，肺炎克雷伯氏菌能在44.5℃利用乳糖產(chǎn)生氣體，而在10℃卻不能生長。表1.比較兩種新分離的菌株與相關菌種的表型特征
系統(tǒng)發(fā)生分析表明本發(fā)明的菌株屬于克雷伯氏菌屬。最相關的菌屬是K.pneumoniae、K.rhinoscleromatis、K.ozaenae和S.liquefaciens。已有人建議如果菌株的相似性不到97％，通常認為不屬于相同的菌屬。(Stackebrandt and Goebel，1994)。LX3和Klebsiellapneumoniae菌株間16s rRNA的相似性僅94.8％。
克雷伯氏菌屬間有許多相似的表型特征。為了解決這些分類問題，利用rpoB基因的序列進行系統(tǒng)進化分析。已發(fā)現(xiàn)在Enterobacteriaceae屬中不同菌株rpoB基因序列間的趨異進化程度高于它們16s rRNA基因間的趨異進化程度(Mollet et al.，1997)。
在腸菌株中，菌株內(nèi)比較具有98-100％相似性，而菌株間比較具有2-21.9％的差異。如圖3所示，分析rpoB基因的序列能夠估計本發(fā)明菌株在系統(tǒng)進化中的位置。雖然分析rpoB基因表明與16srRNA序列分析在系統(tǒng)進化中的位置相似，但值得注意的是本發(fā)明菌株與其它相關菌株間rpoB基因序列的趨異進化程度高于它們16srRNA基因的趨異進化程度。這些菌株間相似性的范圍從88.3％到94.9％。
根據(jù)LX3和LX21的生理和系統(tǒng)進化特征，很明顯這些菌株不是以前已鑒定的細菌種。所以，建議應把LX3和LX21命名為新的菌種Klebsiella singaporensis sp.Nov。這種新菌種類型命名為LX3T。
異麥芽糖合酶能夠催化蔗糖轉(zhuǎn)變成異麥芽酮糖和海藻糖(Cheetham et al.，1982)。新加坡克雷伯氏菌LX3T(菌屬)和LX21可以把蔗糖轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖(87.3％)、少量的海藻糖(11.6％)和痕量的葡萄糖(＜1％)。與其它產(chǎn)生異麥芽酮糖的菌株(McAllister et al.，1990；Tsuyuki et al.，1992；and Huang et al.，1998)相比，本發(fā)明分離到的菌株產(chǎn)生更多的異麥芽酮糖和較少的海藻糖，并且產(chǎn)生葡萄糖的量尤其少。
Erwinia rhapontici ATCC 29283和Serratia plymuthica ATCC15928(Bucke and Cheetham，1987，U.S.patent No.4,670,387；Egerer etal.，1989，U.S.patent No.4,857,461)是兩個可以生產(chǎn)異麥芽酮糖的菌株，新加坡克雷伯氏菌的異麥芽糖合酶酶活明顯高于它們的酶活。在相同的生長條件下，新加坡克雷伯氏菌的異麥芽糖合酶酶活分別比Erwinia rhapontici ATCC 29283和Serratia plymuthica ATCC 15928的酶活高43％和19％。這說明了新加坡克雷伯氏菌具有較高的蔗糖轉(zhuǎn)化率。新加坡克雷伯氏菌的固定化菌體幾乎可以完全轉(zhuǎn)化蔗糖(99.7％)，而其它已知菌株的蔗糖轉(zhuǎn)化率僅達95％(Bucke andCheetham，1987，U.S.patent No.4670387)。新加坡克雷伯氏菌這種新的細菌菌株具有很重要的工業(yè)化生產(chǎn)異麥芽酮糖的潛力。
有趣的是，新加坡克雷伯氏菌的異麥芽糖合酶(KIS)不是固有的表達。含有糖類的果糖可以顯著誘導異麥芽糖合酶的表達，包括果糖、蔗糖、棉子糖和異麥芽酮糖。在這些糖中，蔗糖是最有效的誘導劑，棉子糖和果糖次之。當使用其它糖做為碳源時，僅有很低的酶活或檢測不到酶活。這與以前報道的基本固有表達異麥芽糖合酶不同(Huang et al.，1998)。
已克隆和鑒定了新加坡克雷伯氏菌編碼異麥芽糖合酶的kis基因，其核苷酸序列如圖6A(SEQ ID NO.1)所示。本發(fā)明包括SEQ IDNO.1(SEQ ID NO.2)本來編碼相同氨基酸序列的遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)的核苷酸序列。此基因編碼598個氨基酸的多肽計算其分子量為69.94kDa。與Enterobacter sp.strain SZ62克隆的蔗糖異構(gòu)酶進行序列比較說明兩者高度同源但在C末端有三個氨基酸的差異。
用功能性克隆法分離編碼KIS蛋白DNA的說明如下(a)從供體生物體制備基因庫，在適當?shù)乃拗魃矬w中含有具有異麥芽酮糖生物合成活性的DNA編碼序列；(b)利用它們增加還原糖的含量從基因庫中篩選目的克??；(c)用異麥芽酮糖生物合成活性分離含有編碼蛋白DNA的克隆。在優(yōu)選的實施例中，用大腸桿菌做為步驟(a)中基因庫的宿主菌，最優(yōu)選的大腸桿菌在進行以上步驟(a)-(c)的時間內(nèi)不產(chǎn)生大量的還原糖。
在kis基因的上游已鑒定了推定的啟動子序列。在大腸桿菌中證實了此啟動子的活性，在蔗糖或果糖存在時，它可以誘導kis基因的表達。與其它蔗糖反應區(qū)(Yokoyama et al.，1994)比較，在-10區(qū)發(fā)現(xiàn)了推定的富AT蔗糖反應區(qū)(-54TTTTCTTTAATAACAATT-37)[SEQID NO.3]。
異麥芽糖合酶屬于葡糖基轉(zhuǎn)移酶家族。比較推測的kis基因氨基酸序列，說明存在潛在的蔗糖結(jié)合位點321F-D-L-I-R-L-D-R-D-S-N-E332[SEQ ID NO.4]。已確定天冬氨酸殘基對于結(jié)合蔗糖及其衍生物葡糖基至關重要。葡糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合位點中的天冬氨酸變成天冬酰胺，酶活降低或完全受到抑制，說明了催化位點中羧基基團的作用(Mooser et al.，1991；Kato et al.，1992；Monchois et al.，1996,1997)。通過比較，看起來KIS酶中327位的天冬氨酸似乎在異麥芽酮糖的生物合成中催化結(jié)合蔗糖。在底物結(jié)合和催化中，還沒有確定第二個高度保守氨基酸325位精氨酸的作用。
本發(fā)明的異麥芽糖合酶可以在任何類型細胞中表達，如細菌、植物、哺乳動物、昆蟲或真菌細胞，并且本發(fā)明包含轉(zhuǎn)化的原核和真核細胞表達KIS。在一個優(yōu)選的實施例中，利用常規(guī)的方法將kis基因轉(zhuǎn)移到細菌如大腸桿菌中，KIS酶在其中表達。在發(fā)酵的培養(yǎng)基中這種轉(zhuǎn)化的細菌細胞系可以生產(chǎn)異麥芽酮糖。在另一個優(yōu)選的實施例中，把kis基因轉(zhuǎn)移到植物細胞中。在培養(yǎng)基中，這種轉(zhuǎn)化的植物細胞能夠生產(chǎn)異麥芽酮糖，或者用常規(guī)的方法將kis基因?qū)朕D(zhuǎn)基因植物，使其通過轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖。這種植物將是異麥芽酮糖的豐富資源。在這個實施例中優(yōu)選的植物是甘蔗、玉米、西瓜和甜菜。
使用常規(guī)的方法完成細胞轉(zhuǎn)化，如使用在宿主細胞中繁殖的適宜表達載體(如質(zhì)粒)進行轉(zhuǎn)化，利用機械方法(如粒子轟擊、微注射)或本領域已知的其它方法如脂質(zhì)融合或電穿孔進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化植物和植物細胞優(yōu)選的實施例是土壤桿菌屬tumefaciens Ti質(zhì)粒載體，有大量文獻實例報道(如美國專利Nos.4,940,838,4,762,785 and5,068,193)。
用土壤桿菌屬介導的轉(zhuǎn)化可以得到Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化，還可以使用其它方法把Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入靶細胞中。在優(yōu)選的實施例中，kis基因插入到表達載體中在原核或真核細胞中擴增，并且本發(fā)明包括轉(zhuǎn)化后的原核和真核細胞含有這種載體。在宿主細胞中，適宜的表達載體含有kis編碼序列和啟動子活性使kis編碼序列表達，以及在宿主細胞中維持和/或擴增載體的必需序列。
另外，載體含有使kis基因穩(wěn)定插入到宿主細胞基因組中的序列，例如Ti質(zhì)粒的邊緣區(qū)(c.f.美國專利Nos.4,762,785和5,068,193)，或與宿主基因組交叉或插入的同源區(qū)。
在另一個實施例中，kis基因融合信號肽序列。信號肽靶向表達肽到特定的細胞位置，如液泡(Bednarek and Raikhel，1991；Matsuokaand Nakamura，1991)、葉綠體(Van den Broeck et al.，1985)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Borisjuk et al.，1999)或細胞膜(Okamoto et al.，1991)。在一個優(yōu)選的實施例中，kis基因與靶向液泡的信號肽序列融合。在另一個實施例中，kis基因與膜附著區(qū)編碼序列連接，這段序列對酶穩(wěn)定性很重要(Hsu et al.，1993；Okamoto et al.，1991)。實施例1生產(chǎn)異麥芽酮糖的新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis sp.Nov)的分離、純化和鑒定。
收集新加坡Clementi森林公園的土壤樣品、甘蔗根部和各種過熟的熱帶水果和甘蔗組織懸浮在滅菌鹽水中，再以不同稀釋度涂布在蔗糖瓊脂平板上。
用于篩選產(chǎn)生異麥芽酮糖的蔗糖瓊脂培養(yǎng)基包括(每1000ml)40g蔗糖、5g酵母抽提物、0.5g MgSO4H2O、0.7g KNO3、1gK2HPO4、0.5g NH4Cl、1g NaCl、20g瓊脂，用1N NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0。
分離和純化產(chǎn)生異麥芽酮糖的細菌所有的平板在30℃孵育24小時。蔗糖瓊脂板上的每個單克隆菌落一部分轉(zhuǎn)到新蔗糖瓊脂板上進一步純化，另一部分在SPY培養(yǎng)基上孵育過夜。SPY培養(yǎng)基的組成每1000ml中，40g蔗糖、10g蛋白胨和4g酵母抽提物(pH7.0)。
通過在SPY平板上重復劃線，從不同樣品得到的細菌分離物純化成均一的單菌落。利用蔗糖做為單一碳源，篩選能夠產(chǎn)生還原糖的純化后細菌分離物。
能夠高產(chǎn)還原糖的細菌分離物進一步檢測異麥芽酮糖和葡萄糖的產(chǎn)量。能夠有效生產(chǎn)異麥芽酮糖和痕量葡萄糖兩個細菌分離株LX3和LX21被選定進一步研究。這兩株細菌分別來自接近甘蔗根部的土壤樣品和新加坡Clementi森林公園的土壤樣品。
粗異麥芽糖酶的制備和酶的分析在SPY培養(yǎng)基中孵育過夜后，14000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分別收集沉淀和上清。
上清保存在4℃，用DNS法(Miller，1959)檢測還原糖，用薄層層析法(Schwimmer and Bevenue，1956)檢測異麥芽酮糖，分析描述如下。細菌沉淀用去離子水洗三次，用pH6.6，原體積的0.1M檸檬酸-磷酸緩沖液懸浮。重懸的菌體分成兩部分。一部分直接用于分析全細胞組分的酶活。另一部分超聲破碎，14000轉(zhuǎn)/分得到粗蛋白部分和菌體碎屑部分。菌體碎屑部分洗三次并重懸在相同的緩沖液中進行酶學分析。
酶活的檢測在0.1M檸檬酸-磷酸緩沖液(pH6.6)中，混合450μl4％的蔗糖與50μl的酶制劑或細菌懸液，37℃孵育15分鐘。
用DNS法測定形成的還原糖。一個單位異麥芽糖酶的定義是在以上指定的條件下，1分鐘內(nèi)把蔗糖轉(zhuǎn)變成1μmol還原糖的酶量。
測定大腸桿菌中的酶活的方法相同，只是在大腸桿菌生長LB培養(yǎng)基中補充不同濃度的蔗糖，細菌的懸浮培養(yǎng)基加倍到100pi，蔗糖溶液相應減少到400μl并且反應時間增加到30分鐘。
用薄層層析檢測細菌產(chǎn)生的異麥芽酮糖。0.5pi的培養(yǎng)基懸液，用DNS法檢測還原糖，在TLC平板(多用途聚酯上的硅膠，Aldrich)上點樣、顯像。溶劑系統(tǒng)是乙酸乙酯-乙酸-水，體積比為4∶3∶0.8。斑點用二苯胺-苯胺-磷酸試劑(Schwimmer and Bevenue，1956)80℃，5min顯色。Sigma公司生產(chǎn)的異麥芽酮糖形成典型的綠-黃顏色斑點做為標準對照指示異麥芽酮糖的存在。
超聲后上清液中未檢測到異麥芽糖合酶活性，僅在沉淀部分中檢測到酶活，延長超聲時間沒有變化。沉淀部分的異麥芽糖合酶活性是19.2U/ml，全細胞組分的酶活是20.1U/ml，二者幾乎相等。結(jié)果暗示異麥芽糖合酶是細胞壁結(jié)合酶。
形態(tài)學在蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上30℃，生長24小時后，用相差顯微鏡和透射電鏡(TEM)檢查。透射顯微鏡檢查時，離心后的細菌沉淀用5％(wt/vol)戊二醛和1％(wt/vol四氧化鋨固定。
樣品埋入環(huán)氧樹脂用超薄切片機制成超薄切片，用醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，用JEM-1200EX透射電鏡檢查。
革蘭氏染色后用光學顯微鏡檢測細胞形態(tài)學，并把固定的標本與活細胞進行形態(tài)學比較。
菌株LX3和LX21為革蘭氏陰性，不運動，直棒狀帶圓形末端，單個存在有時成對。菌體直徑為0.6-0.8μm，長0.9-2.0μm。沒有觀察到內(nèi)生孢子。蔗糖培養(yǎng)基上生長的菌體的大小和形狀如
圖1所示。這兩個菌株的克隆呈圓形、光滑、墊狀、完整、不透明、白色，用針檢測時有一定粘性。
生理和生化特性細菌分類學工作的生理和生化特性使用基礎培養(yǎng)基每1000ml含有0.5g MgSO4，H2O，0.7g Kan03，1g K2HPO4，0.5g NH4Cl，1g NaCl，pH7.0-7.2，加入的碳源見說明。細菌分離物的液體培養(yǎng)基在30℃往復振搖培養(yǎng)。
革蘭氏染色特性使用Hucker所述的方法(Doetsch，1981)。
氧化酶活性檢測濾紙上1％(wt/vol)的四甲基-p-亞苯二胺，過氧化氫酶活性檢測3％(wt/vol)過氧化氫在SPY培養(yǎng)基中孵育18-48小時后觀察形成的氣泡(Smibert and Krieg，1981)。在基礎培養(yǎng)基中加入0.2％(wt/vol)的各種底物，研究利用各種底物生長的情況。
使用以前的方法進行如下檢測明膠水解(方法1)，產(chǎn)生吲哚(方法2)，產(chǎn)生hydrogen uide(方法2)，硝酸鹽減少和淀粉、酪蛋白和瓊脂水解(Smibert and Krieg，1981)。在基礎培養(yǎng)基中補充所述的各種糖確定由糖產(chǎn)生的酸(Smibert and Krieg，1981)。
確定細菌分離物的生長條件從5℃到60℃，把分離的新培養(yǎng)物在蔗糖瓊脂平板上不同溫度分別孵育10天。
生理和生化特性見表2。這兩個菌株具有過氧化氫酶和脲酶活性，沒有氧化酶、硝酸還原酶和脂肪酶活性。這兩個菌株均不能水解明膠、淀粉和纖維素。菌株LX3不能水解酪蛋白，而LX21可以降解酪蛋白。
伏-波試驗陽性，但甲基紅反應陰性。LX3和LX21是兼性厭氧，有芽孢。它們都能利用檸檬酸和葡萄糖做為唯一碳源，并利用所有測試的碳源產(chǎn)酸產(chǎn)氣，碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖、果糖、甘油、肌糖、甘露糖、半乳糖和山梨醇。蛋白胨、胰蛋白胨、酵母抽提物、牛肉抽提物、酪蛋白水解產(chǎn)物、KNO3和(NH4)都可以做為氮源維持菌株生長，而尿素不能。菌株不需要特殊的生長因子。
表2.菌株LX3和LX21的特性分離株 LX3LX21直桿狀 + +圓形末端 + +直徑 0.6-0.80.6-0.8長度 0.9-2.00.9-2.0單個出現(xiàn) + +成對出現(xiàn) 有時 有時莢膜和粘液層 + +革蘭氏染色 - -胞囊和微胞囊 - -球體 - -內(nèi)生孢子 - -運動性 - -兼性厭氧 + +過氧化氫酶 + +氧化酶脲酶 + +卵磷脂酶 - -脂肪酶 - -利用檸檬酸 + +水解明膠 - -淀粉 - -纖維素 - -酪蛋白 - -葡萄糖做為碳源 + +分解代謝 發(fā)酵 發(fā)酵從以下物質(zhì)產(chǎn)生硫化氫半胱氨酸 + +硫代硫酸鹽 - -TSI - -M.R. - -V.P. + +硝酸鹽還原 - -吲哚產(chǎn)生 - -氣體產(chǎn)生 + +酸 + +
由于這些特征把LX3和LX21菌株歸為Klebsiella菌屬。最接近的菌株為K.oxytoca和K.pneumoniae。但LX3和LX21菌株與K.oxytoca菌株不同之處在于產(chǎn)生吲哚，與K.pneumoniae的不同之處在于可以在10℃生長和在44.5℃利用乳糖產(chǎn)氣(表1)。
在實施例3中檢查了生理學、生化特性和DNA序列的差異，說明分離的菌株為克雷伯氏菌屬新發(fā)現(xiàn)的菌種，即新加坡克雷伯氏菌。菌株的類型為LX3T。
Klebsiella singaporensis sp.nov.的說明Klebsiella singaporensis(sin.ga.po.ren′.Sis是新加坡發(fā)現(xiàn)，屬于新加坡，亞洲一個國家的名字)。
革蘭氏陰性兼性厭氧菌，圓形末端直桿菌。不運動，有芽孢。無內(nèi)生孢子。菌體直徑0.5-0.8μm，長度為0.9-2.0μm，單個分布，有時成對出現(xiàn)。在蔗糖瓊脂平板上生長時，菌落為圓形、光滑、墊狀、完整、不透明、白色，有粘性。產(chǎn)生過氧化氫酶和脲酶，不產(chǎn)生氧化酶和脂肪酶。
伏-波試驗陽性，但甲基紅反應陰性。硝酸鹽沒有減少。不發(fā)酵明膠、淀粉、纖維素和酪蛋白。不需要特殊的生長因子?？梢岳脵幟仕岷推咸烟亲鰹槲ㄒ坏奶荚础o硫化氫產(chǎn)生。利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖、果糖、甘油、肌糖、甘露糖、半乳糖和山梨醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣。最適溫度為30℃，最適pH為7.0。DNA中GC含量為56.5％。
菌株類型為LX3T。
實施例2在海藻鹽中固定新加坡克雷伯氏菌LX3T，利用固定化菌株LX3T生長在SPY培養(yǎng)基30℃，250轉(zhuǎn)/分振搖16小時生產(chǎn)異麥芽酮糖。每5ml細菌培養(yǎng)基與100ml藻酸混合(2％的培養(yǎng)基粘度)并用注射器滴加0.65％(w/v)CaCl2溶液。持續(xù)攪拌溶液，固定化菌體在0.65％(w/v)CaCl2溶液中4℃，4小時，逐漸變硬。
然后，在藻酸鹽顆粒中，固定化的菌體孵育在含0.2％(w/v)CaCl2的SPY培養(yǎng)基中，30℃過夜振搖增加菌體密度。
固定化菌體(100ml)填充在200ml柱反應器中。不同濃度的蔗糖溶液，不同保留時間留過柱子。收集洗脫液，用以上所述的方法確定不同條件下所有還原糖和異麥芽酮糖的產(chǎn)量。
固定化新加坡克雷伯氏菌生產(chǎn)異麥芽酮糖新鮮培養(yǎng)的新加坡克雷伯氏菌固定在藻酸鹽凝膠中。表3所示，填充在200ml柱反應器中的固定化菌體能夠有效生產(chǎn)異麥芽酮糖。當10％的蔗糖溶液以6ml/min的速度留經(jīng)柱反應器時，蔗糖的轉(zhuǎn)化率最高為99.7％。在這些條件下，異麥芽酮糖的產(chǎn)量為522.8mg/min或31kg/h。蔗糖濃度增加到20％時，可以進一步增加異麥芽酮糖的產(chǎn)量，但蔗糖的轉(zhuǎn)化率降低。增高蔗糖濃度沒有獲得增高的轉(zhuǎn)化率。
表3.固定化S.Singarporensis生產(chǎn)異麥芽酮糖*蔗糖濃度延遲時間(ml/min) 轉(zhuǎn)化率(％) 產(chǎn)量(mg/min)**2 ND ND10 4 99.7 348.56 99.7 522.82 98.2 343.320 4 96.4 674.06 72.1 756.21 71.8 188.330 2 65.4 342.93 32.7 357.21 67.2 234.940 2 65.1 455.23 34.3 359.7*數(shù)據(jù)是每次處理兩個樣品的平均值。**根據(jù)異麥芽酮糖在所有還原糖的比例為87.4％，換算異麥芽酮糖的產(chǎn)量。
確定產(chǎn)率洗滌后LX3菌株的菌體在0.1M檸檬酸-磷酸緩沖液中用4％蔗糖，37℃孵育10分鐘。沸水浴加熱5分鐘，立即終止反應。反應混合物的上清點樣于TLC平板并顯色。分別切下TLC平板中含有異麥芽酮糖和海藻糖的組分并用蒸餾水抽提。用DNS法確定糖濃度并計算這兩種糖的比率。
為了確定反應混合液中葡萄糖的含量，使用葡萄糖分析試劑盒(KitGAHK-20，Sigma)和DNS法分別分析上清中葡萄糖和總還原糖的濃度。用以上的定量資料確定異麥芽酮糖、海藻糖和葡萄糖的比率。
生產(chǎn)酶和異麥芽酮糖在有氧條件下30℃培養(yǎng)菌株LX3T，在基礎培養(yǎng)基中補充不同的糖做為唯一碳源，糖的起始濃度相同(1.5％，w/v)，間隔取樣測定異麥芽糖合酶、菌體質(zhì)量和異麥芽酮糖產(chǎn)量。如表4所示，蔗糖、棉子糖或果糖做為唯一碳源時，最高酶活分別是15.12、13.62或11.08U/ml。
麥芽糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、纖維二糖或蜜糖做為碳源時，酶活低于1.7U/ml。異麥芽酮糖還能夠誘導產(chǎn)生異麥芽糖合酶，但有蔗糖存在時活性僅有30％。除了果糖，幾乎所有測試的單糖，包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖不能誘導異麥芽糖合酶的活性。表4.新加坡克雷伯氏菌LX3利用碳源生產(chǎn)生產(chǎn)異麥芽糖合酶?；A培養(yǎng)基組成0.1％蛋白胨，0.2％酵母抽提物，0.05％MgSO4，0.2％NaCl。碳源(1.5％，w/v) 細菌生長(OD600) KIS活性(Umol-1)蔗糖 1.89 15.1葡萄糖1.94 0.0果糖 1.82 11.1棉子糖1.96 13.6異麥芽酮糖1.92 4.5蜜糖 1.88 1.6麥芽糖1.77 1.5甘露糖1.84 0.7乳糖 1.82 0.0木糖 1.97 0.0阿拉伯糖 1.73 0.0半乳糖1.71 0.0甘露醇1.77 1.7纖維二糖 1.83 0.0當分別使用無機化合物如KNO3、尿素或(NH4)2SO4做為唯一氮源時，菌株LX3T生長不好，并且在培養(yǎng)基中沒有檢測到異麥芽糖合酶活性(表5)。測試所有有機氮源，都能很好維持菌株LX3T的生長，但檢測到異麥芽糖合酶活性不同。其中，酵母抽提物和胰蛋白胨能最有效地誘導異麥芽糖合酶活性(表5)。表5.新加坡克雷伯氏菌LX3利用氮源生產(chǎn)異麥芽糖合酶?；A培養(yǎng)基包括1.5％蔗糖、0.02％MgSO4、0.5％NaCl、0.03％K2HPO4。數(shù)據(jù)是每次處理兩個樣品的平均值。氮源(1.5％，w/v) 菌生長(OD600) 相對KIS酶活性(％)蛋白胨 1.97 59.2胰蛋白胨 2.13 85.9酵母抽提物 2.33 100牛肉抽提物 2.23 54.4酪蛋白水解產(chǎn)物 2.34 53.9硝酸 0.60 0尿素 0.33 0硫酸銨 0.56 0圖4顯示了菌株LX3T生產(chǎn)異麥芽酮糖和異麥芽糖合酶的典型圖譜。
當蔗糖濃度為10％時，迅速產(chǎn)生異麥芽酮糖，培養(yǎng)7小時后達到最高濃度。從7到22小時，培養(yǎng)基中異麥芽酮糖的濃度基本維持在相同水平，說明菌株LX3T不分解代謝異麥芽酮糖。值得注意，在7小時培養(yǎng)基中細菌生長和異麥芽酮糖活性都沒有達到最高水平，而異麥芽酮糖的產(chǎn)生基本停止。一種可能是當培養(yǎng)基中蔗糖的濃度處于低水平時，剩余蔗糖活躍地泵入細胞維持細菌生長。
比較幾種菌株的異麥芽糖合酶活性在相同的生長條件下(SPY培養(yǎng)基)，K.singaporensis、Erwinia rhapontici ATCC 29283和Serratiaplymuthica ATCC 15928菌株的相對異麥芽糖合酶活性為100％，57％，和81％。實施例3kis基因的操作、克隆、定位和序列分析DNA操作純化全基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶消化，DNA連接，瓊脂糖凝膠電泳，用標準的操作轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Sambrook et al.，1989)或者如試劑制造商推薦。質(zhì)粒提取用Qiagen的試劑盒按照制造商的指導進行。DNA限制片段使用QIAEX II凝膠抽提試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中回收。
細菌菌株和質(zhì)粒列于表6。用大腸桿菌DH5α做為克隆的宿主菌。質(zhì)粒載體pLAFR3和pBluescript II SK(+)分別用于構(gòu)建基因組DNA文庫和亞克隆。大腸桿菌粘?？寺『蛠喛寺?7℃，需氧生長于Luria-Bertani-蔗糖培養(yǎng)基(每升含胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g和蔗糖50g，pH7.0)。根據(jù)需要在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素(12mg/l)或氨芐青霉素(100mg/l)。
表6.本研究中使用的細菌菌株和質(zhì)粒菌株基因型或表型標準/來源細菌K.singaporensis LX3T分離自土壤，產(chǎn)生異麥芽酮糖 本研究K.singaporensis LX21分離自土壤，產(chǎn)生異麥芽酮糖 本研究Erw.rhapontici ATCC 29282 產(chǎn)生異麥芽酮糖 ATCCS.plymuthica ATCC 15928 產(chǎn)生異麥芽酮糖 ATCCE.coli DH5αrecAl endAl hsdRl7supE4 gyrA96 Sambrook et al.1989relAlΔ(lac ZYA-argF)U169(80DLACzΔM15)質(zhì)粒pPLAFR3 克隆載體，四環(huán)素抗性實驗室保存pBluescript II sk(+)克隆載體，氨芐青霉素抗性StratagenepPLASI164 具有約6.1kb的BamHI/BamHI本研究片段的pLAFR3質(zhì)粒pSIBB pBluescript II SK(+)質(zhì)粒的約本研究6.1kb的BamHI/BamHI片段pSIBP pBluescript II SK(+)質(zhì)粒的約本研究4.8kb的BamHI/PstI片段pSICB pBluescript II SK(+)質(zhì)粒的約本研究3.6kb的ClaI/BamHI片段pSIBX pBluescript II SK(+)質(zhì)粒的約本研究3.5kb的BamHI/XhoI片段pSIEE pBluescript II SK(+)質(zhì)粒的約本研究2.5kb的EcoRV/EcoRI片段DNA的G+C含量使用熱變性法(Marmur & Doty，1962)測定基因組DNA中鳥嘌呤加胞嘧啶含量。與克雷伯氏菌株的G+C含量比，菌株LX3和LX21的G+C含量是56.5mol％。
16S rRNA基因序列菌株LX3T(T是菌株類型)和LX21的16SrRNA基因DNA片段對應于大腸桿菌16S rRNA的位置95到1395，使用純化的基因組DNA擴增，引物組成5′TGACGAGTGGCGGACGGGTG-3′(正向)[SEQ ID NO.5]，5′CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG-3′(反向)[SEQ ID NO.6]。用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Germany)純化擴增產(chǎn)物，并用dRhodamine terminator cycle測序試劑盒(PE Applied Biosystems)和2400型Perkin Elmer GeneAmp PCR System(PE Applied Biosystems)測定序列。用Perkin Elmer ABI PRISM 377 DNA測序儀從兩側(cè)測定序列。設計序列分析引物見于表7。至少重復測序兩次。利用序列數(shù)據(jù)庫搜索確定與新菌株已知最相關的菌種從GenBank和核糖體數(shù)據(jù)庫項目(RDP II)文庫檢索最相關菌株的序列。用PILEUP程序(Devereux et al.，1984)進行序列的同源性比較并人為校正比較結(jié)果。用PHYLIP程序包中的DNADIST程序(Felsenstein，1989)得到距離模型，并用PHYLIP程序包(V3.5c)(Felsenstein，1989)中的NEIGHBOR程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進化樹。使用SEQBOOT，DNADIST，NEIGHBOR和CONSENSE程序(Felsenstein，1989)利用引導(1000次重復)得到組間的統(tǒng)計顯著性。表7.用于PCR擴增和菌株LX3和LX21測序的寡核苷酸引物引物代碼 序列(5′-3′) 方向1 16sf95 TGACGAGTGGCGGACGGGTG[SEQ.ID NO.7] 正向2 16sr394 CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG[SEQ ID NO.8] 反向3 16sf342 TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA[SEQ ID NO.9] 正向4 16sr616 ATGCAGTTCCCAGGTTGAGC[SEQ ID NO.10] 反向5 16sf605 GAAATCCCCGGGCTCAACCTG[SEQ ID NO.11] 正向6 16SR798 ACATCGTTTACGGCGTGGACTACC[SEQ ID NO.12] 反向7 16sus93 GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATG[SEQ ID NO.13] 正向8 16sr119 CCGGACCGCTGGCAACAAAG[SEQ ID NO.14] 反向確定菌株LX3和LX21的16S rRNA基因序列。比較數(shù)據(jù)庫提供的16S rRNA序列，發(fā)現(xiàn)菌株LX3和LX21與Klebsiella屬的菌株最接近，其次為Serratia和Enterobacter屬的eO種。這兩個菌株的序列與Klebsiella pneumoniae的序列非常相近，在這些菌株間距離的范圍為91.0到94.8t。用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的資料包括每條序列中的1282個核苷酸，從95到1395位排除了序列間隙和模糊的核苷酸(相應于Escherichia coli序列)。如圖2所示，利用相鄰連接方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。菌株LX3和LX21與Klebsiella pneumoniae菌最相關。引導程序分析結(jié)果可信度100％證實了菌株LX3與LX21與菌株Klebsiella pneumoniae屬于同一類。
但這兩個菌株與K.pneumoniae菌不同；LX3與K.pneumoniae的16S rRNA基因序列的趨異值＞5％(表8)。表8.Klebsiella singaporensis sp.nov.與Enterobacteriaceae科其它代表菌株間16s rRNA和rpoB基因的DNA序列的相似性16s rRNA rpoB菌株 GenBank 與 GenBank號 與K.singaporensis號K.singaporensis的rpoB序列相似的16s rRNA序 性(％)列相似性(％)Klebsiella singaporensis 100 100Klebsiella pneumoniae Y17656 94.8 U7744495.0KlebsiellaY17657 94.7rhinoscleromatisKlebsiella terrigena Y17658 93.3Klebsiella planticola Y17659 92.8Klebsiella ozaenaeY17654 94.5Klebsiella ornithinolyticaU78182 93.1 U7744093.9Klebsiella oxytocaY17655 92.4 U7744293.6Serratia liquefaciens AB004752 94.7Serratia macescensM59160 92.2 U7744988.3Serratia rubidaea AB004751 91.5Salmonella typhimuriumU90316 91.2 X0464293.4Salmonella sofia X80677 91.5 U7745293.2Salmonella waycross U92194 91.0Citrobacter werkmanii AF025373 92.6Citrobacter farmeri AF025371 93.1Citrobacter amalonaticus AF025370 93.1Citrobacter rodentunm AF025363 91.8Enterobacter cloacae Y17665 92.9 U7743594.9Enterobacter Z96078 93.1cancerogenusEnterobacter aerogenesAB004750 93.5Enterobacter intermedius AB004747 92.6Enterobacter asburiae AB004744 93.6Enterobacter Z96077 92.4nimipressuralisErwinia wasabiae U80199Erwinia cypripediiU80201 91.5Escherichia coli Z80725 90.8 V00340 94.9Salmonelia typhi AF008577 92.8Citrobacter freundii U77434 95.5Salmonella arizonae U77447 92.0Salmonella paratyphi U77450 93.0Salmonella shomron U77451 92.4Yersinia enterocolitica U77453 85.5
菌株LX3和LX21的部分rpoB基因DNA，這部分基因代表了這個基因最易變的部分，通過測定序列確定這兩株菌在Enterobacteriaceae家族中系統(tǒng)進化的位置。菌株LX3和LX21的序列與數(shù)據(jù)庫提供的Enterobacteriaceae家族rpoB序列比較，得到相似的模型。如圖3所示，系統(tǒng)進化的位置與屬于Klebsiella屬的菌株非常相關。最接近的菌株是K.pneumoniae，但有5％的趨異值(表8)。RpoB的擴增及測序菌株LX3和LX21編碼RNA聚合酶beta亞單位(rpoB)基因的DNA，對應于大腸桿菌rpoB的第1468到2114位，根據(jù)已發(fā)表的大腸桿菌(GenBank V00340)、Salmonella typhimurium(X04642)、Pseudomonas putide(X15849)和Klebsiella pneumoniae(U77443)序列的同源區(qū)為參照設計配對引物進行PCR擴增，其正向引物為5′-CAGTTCCGCGTTGGCCTG-3′[SEQ ID NO.15]，反向引物為5′-CGGTTGGCGTCATCGTGTTC-3′[SEQ ID NO.16]。如上所述，進行PCR產(chǎn)物的純化和測序。使用與16S rRNA相同的處理和程序分析rpoB的系統(tǒng)進化。
Kis基因的克隆和測序用BamHI部分消化Klebsiellasingaporensis菌的基因組DNA，連接到粘粒載體pLAFR3的BamHI位點在體外用Gigapack II(Stratagene)包裝后轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建基因組DNA文庫。在含四環(huán)素的LB瓊脂平板上37℃孵育過夜篩選轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5a。粘?？寺》跤a充蔗糖的LB培養(yǎng)基，24小時后使用DNS法(Miller，1959)檢測肉湯培養(yǎng)基中形成的還原糖。用薄層層析鑒定細菌培養(yǎng)基中的異麥芽酮糖。選擇裝有kis基因的克隆，用BamHI消化后純化6.1kb的片段。使用ABI PRISMdRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction試劑盒(PEApplied Biosystem)，利用末端終止法從兩條鏈測序pSIEE克隆。測序引物列于表9。用DNAStar測序進行序列分析和比較。用BLAST計算程序(Altschul et al.，1997)搜索同源性。表9.kis基因DNA測序引物引物(方向) 序列SI-1(F)5′-CCCGCTGGCAATATTTCTGACT3′[SFQ ID NO.17]SI-2(R)5′-CACGACCACTACCCTTTCTCCTGA-3′[SEQ ID NO.18]SI-3(F)5′-CCTCGCCTCATTTAAAGACACCAA3′[SEQ ID NO.19]SI-4(R)5′-TAGGCGCCATATACCAGAGCAG-3′[SEQ ID NO.20]SI-5(F)5′-CGTGACTATTATTTCTGGCGTGAC-3′[SEQ ID NC.21]SI-6(R)5′-CGTCGCCCGCTGAGTGAGGTAA-3′[SEQ ID NO.22]SI-7(F)5′-TAGATAACCATGACAACC-3′[SEQ ID NO.23]SI-8(R)5′-GCGGTGGCCACATCATACC-3′[SEQ ID NO.24]SI-9(F)5′-CGCCGTTTATTTATCAAGGTTCAG-3′[SEQ ID NO.25]SI-10(R) 5′-GGAGCATTGCCGTAAAGAT-3′[SEQ ID NO.26]SI-11(F) 5′-CTATACTCTCCCGGCTAATGATGC-3′[SEQ ID NO.27]SI-12(R) 5′-CCACCATGCAGGATATTCACTTT-3′[SEQ ID NO.28]篩選Klebsiella singaporensis粘粒庫中的異麥芽酮糖生物合成活性。
得到兩個陽性粘?？寺。Q為pPLASI164和pPLASI169，通過它們能產(chǎn)生還原糖，用TLC分析證實異麥芽酮糖。這兩個克隆的限制性酶分析發(fā)現(xiàn)用BamHI消化得到相同大小1kb的片段。
進一步證實這兩個菌株pPLASI164和pPLASI169的限制性酶切圖譜相同。如圖5所示，這個6.1kb的片段含有一個PstI位點、一個ClaI位點、一個XhoI位點和兩個EcoRV位點。刪除分析限定編碼異麥芽酮糖生物合成的區(qū)域于克隆pSIEE EcoRV酶切得到的2.5kb片段。
從兩個DNA鏈確定克隆pSIEE的核苷酸序列(Fig.6A)。查找開放讀碼框架(ORF)發(fā)現(xiàn)存在一個1797bp核苷酸的ORF。刪除分析表明這是異麥芽糖合酶基因kis的編碼區(qū)。推測的ATG起始密碼子與潛在核糖體結(jié)合序列(AAGGA)間隔8個堿基。與-35啟動子元件(TTGACA)沒有明顯同源?？赡艿?10區(qū)啟動子序列(TTTAAT)與大腸桿菌o70的啟動子序列(TATAAT)同源，位于啟動子上游44bp處。推定的蔗糖反應區(qū)(-SqTTTTCTTTAATAACAATT-37)[SEQ ID NO.3]富含AT，也位于-10區(qū)，與幾種蔗糖誘導啟動子的保守蔗糖反應區(qū)同源(圖7；Yokoyama et al.，1994).證實存在蔗糖和果糖時kis基因的誘導表達，而當葡萄糖做為唯一碳源時沒有kis基因表達。推定的核心序列″CAACTG″，螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基元(Murre et al.，1989；Rocha and Gomes，1998)位于起始密碼子上游21bp(圖6A)。下游有三個TCTC盒、一個TCTT盒和一個TGTG盒，與因子獨立終止位點的TCTG同源序列極相似。在推定終止密碼子(TAA)下游也發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)重復序列。這會形成一個潛在的穩(wěn)定發(fā)夾結(jié)構(gòu)，阻止RNA聚合酶通過。(Brendel and Trifonov，1984).
從K.singaporensis克隆的kis基因編碼598氨基酸的蛋白，計算其分子量為69.94kDa，等電點為6.62(Fig.6B)。親水性氨基酸占所有氨基酸的68.4％。Enterobacter sp.strain SZ62(Mattes et al.，1998美國專利No.5786140)的異麥芽糖合酶與kis基因同源性最近，在ORF中有99.3％的同源性核苷酸，在預測的多肽序列中有99.7％的相同氨基酸。蛋白的C末端區(qū)不同。KIS有一個多余的氨基酸，577位的丙氨酸，和菌株SZ62的異麥芽糖合酶有兩個位點發(fā)生取代，Gly577和Ala593分別被Ala578和Val594取代。另外，KIS蛋白與Protaminobacter rubrum相同的酶有67％的同源(Mattes，et al.，1998美國專利No.5786140)。
與α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶鑒定的位點序列同源性比較后，確定潛在的蔗糖接觸反應結(jié)合位點F-D-L-I-R-L-D-R-D-S-N-E332″[SEQ ID NO.4](Fig.8)。
在這個基元中，兩個氨基酸精氨酸和天冬氨酸高度保守。天冬氨酸(D)在酶活中起關鍵作用，突變后完全抑制了蔗糖結(jié)合特性(Mooser et al.，1991；Kato et al.，1992；Monchois et al.，1997)。參考文獻Altschul SF，Madden TL，Schaffer AA，Zhang JH，Zhang Z，MillerW，Lipman DJ.1997.Gapped Blast和PSI-Blast新一代蛋白數(shù)據(jù)庫查找程 序核酸研究.253389-3402.
Bednarek S，and Raikhel NV.1991.大麥凝集素羧基端多肽前體在植物體內(nèi)決定液泡蛋白的分類 植物細胞，1195-1206.
Borisjuk NV，Borisjuk LG，Longendra S，Petersen F，Gleba Y，andRaskin I1999.自然生物技術17，466-469.
Bower R，and Birch RG.1992通過顯微注射轟擊獲得的轉(zhuǎn)基因蔗糖植株 植物雜志2.409-416.
Brendel V.and Trifonov EN.1984.一種檢測潛存的原核終止子的計算機計算方法 核酸研究12，4411-4427.
Bucke，et al.1982美國專利編號4,359,531.
Bucke，et al.1987美國專利編號4,670,387.
Cheetham PSJ.Imber CE.Isherwood J.1982通過固定化Erwiniarhapontici菌生產(chǎn)異麥芽酮糖。自然 299，628-631.
Cheetham PS.1984.從Erwinia rhapontici中異麥芽酮糖合酶的提取和機制。生物化學雜志 220，213-220.
Devereux J，Hacberli P and Smithies 0(1984)為VAX的一套綜合序列分析程序。核酸研究 12，387-395.
Doetsch，R.N.1981光學顯微鏡的判定方法。p.21-33.In r.Gerhard，R.G.E.Murray，R.N.Costilow，E.W.Nester，W.A.Wood，N.R.Krieg，and G.B.Phillips(ed.)普通細菌學的方法手冊。AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.
Egerer，et al.1989.美國專利No.4,857,461.
Felsenstein J(1989)PHYLIP-系統(tǒng)發(fā)生推理程序包(版本3.2)分支系統(tǒng)學5，164-166
Giffard PM.Simpson CL.Milward CP.and J acques NA.1991.Straptococcus salivarius中一簇至少兩個葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因的分子特征 ATCC 25975.J.Gen Microbiol 137.2577-2593.
Hattori T.Fukumoto H.Nakagawa S.Nakaruma K.1991.蔗糖誘導的編碼葉柄中塊狀根存儲蛋白、紅薯sporamin基因的表達。Plant CellPhysiol.32，79-86.
Helfert C.Gotsche S.and Dahl MK.1995.treA基因編碼的磷酸-alpha-1，1-糖苷酶催化枯草芽胞桿菌海藻糖磷酸鹽的切割。Mol.Microbiol.16，111-120.
Honda O.Kato C.Kuramitsu HK.1989.突變鏈球菌gtfD基因編碼的葡糖基轉(zhuǎn)移酶-S核苷酸序列的分析。J.Gen Microbiol 136，2099-2105.
Hsu LC，HU MC，Cheng HC，Lu JC，and Chung BC.1993.Ofw0C21氮端疏水區(qū)是膜自如和酶穩(wěn)定所必需的。J.BiologicalChemistry268，14682-14686.
Huang J.H.，Hsu L.H.and Su Y.C.1998.Klebsiella planticolaCCRC 19112把蔗糖轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖。J.Industrial Microbiol.Biotechnol.21，22-27.
Ishikawa，H.，Kudoh，S.，Mizutani.，T.And Sugitani，T.1994.靈驗的樹脂使用異麥芽酮糖(Palatinit).Food Industry Tokyo 37，81-87.
Kato C.Nakano Y.Lis M.Kuramitsu HK.1992.突變鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化位點的分子遺傳學分析。Biochem Biophys Res(1891184-1188)Kawai，K.，Yoshikawa，H.，Murayama，Y.，Okuda，Y.And Yamashita，K.1989.使用異麥芽酮糖做為糖尿病病人的熱量甜料。Hormoneand Metabolic Research 21，338-340.
Koes RE.Spelt LE.Mol JNM.1989.petunia hybrida(V30)的查耳酮合酶多基因家族在花發(fā)育和紫外線誘導過程中差異的光調(diào)控表達。Plant Mol.Biol.12.213-225.
Kunz M.1993.從蔗糖到半合成多聚物。InCarbohydrates asorganic Raw Materials II(G.Descotes，ed.)pp 135-161，VCH，Weinheim，New York.
Lantero，Jr.1983.美國專利MO a，390，627.
Marmur，J.and Doty P.1962.從它的熱變性溫度確定脫氧核苷酸的堿基組成。J.Mol.Biol.5109-118.
Matsuoka K，and Nakamura K.1991.液泡靶向需要植物液泡蛋白前體的前肽。Proc.Natl.Acad.Sci USA 88，834-838.
Mattes R.Klein K.Schiweck H.Kunz M.Munir M.1998.編碼異麥芽糖合酶和palatinose的DNA。美國專利5,786,140.
McAllister M.Kelly CT.Doyle E and Fogarty WM.1990.Serratiaplymuthica的異麥芽糖合酶。Biotechnol.Lett.12，667-672.
Mechold U.Steiner K.Vettermann S and Malke H.1993.Strepcoccus equisimilis H46A染色體鏈激酶區(qū)的的遺傳組織。Mol Gen.Gent.241.129-140.
Miller G.L.(1959)使用dinitroaslicylic酸試劑檢測還原糖。AnalChem 31，426-428.
Minami，T.，F(xiàn)ujiwara，T.，Ooshima，T.，Nakajima，Y.And Hamada，S.1990.鏈球菌突變體蔗糖與葡糖基轉(zhuǎn)移酶間反應中蔗糖結(jié)構(gòu)同分異構(gòu)體的相互作用。Oral Microbiology and Immunology 5，189-194.
Mitsuoka，T.1990.Bifidobacteria和它們在人類健康中的作用。J.Industri.Microbiol.6263-268.
Miyata Y，Sugitani Ｔ，Tsuyuki K，Ebashi T and Nakajima Y.1992產(chǎn)生海藻糖Pseudomonas mesoacidophila菌的分離和鑒定。BiosciBiotech Biochem 561680-1681.
Mizutani，T.1989.異麥芽酮糖的制造和應用。Food Chemicals 567-72.
Mollet C，Drancourt M and Raoult D(1997)rpoB序列分析做為細菌鑒定的新基礎。Molecular Microbiology26，1005-1011.
Monchois Y.Remaud-Simeon M.Russell RRB.Monsan PF.andWillemot RM.1997.腸膜樣明串珠菌NRRL B-512F葡聚糖蔗糖酶(DSRS)的描述和在酶活中起關鍵作用的氨基酸殘基的鑒定。ApplMicrobiol Biotechnol 48，465-72.
Monchois Y.Willemot RM.Remaud-Simeon M.Croux C.AndMonsan PF.1996.僅合成alpha(1，6)and alpha(1，3)鍵的腸膜樣明串珠菌NRRL B-1299編碼一種新葡聚糖蔗糖酶基因的克隆和測序。Gene182，23-32.
Mooser G.Hefta SA.Paxton RJ.Shively JE and Lee TD.1991.從兩株Streptococcus sobrinus的葡糖基轉(zhuǎn)移酶分離和測序一種含有接觸反應天冬氨酸活性位點肽。J.Biol.Chem 266，8916-8922.
Murre C.McCaw PS.′and Baltimore D.1989.在免疫球蛋白增強子結(jié)合、daughterless、MyD和myoC蛋白中一種新DNA結(jié)合和二聚化基元。細胞56，777-783.
Nagai Y.Sugitani T.and Tsuyuki K.1994.來自Pseudomonasmesoacidophila MX-45菌a-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的描述。Biosci BiotechBiochem 58，1789-1793.
Okamoto.S，Tyodayamamoto A，Ito K，Takebe I，Machida Y.1991.細胞膜中Agrobacterium tumefaciens菌VirD蛋白的定位和定向。Molecular and General Genetics 228，24-32.
Palm CJ.Costa MA，An G.Ryan CA.1990.創(chuàng)傷誘導核來自馬鈴薯的調(diào)控蛋白酶抑制劑II基因的蛋白結(jié)合DNA片段。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,603-607.
Park YK.Vegina RT.and Pupin AM.1992.利用微生物的葡糖基轉(zhuǎn)移酶把蔗糖轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖。Biotechnol.Lett.14，547-551.
Rocha CRC.，and Gomes SL.1998.編碼來自Blastocladiellaemersonii菌線粒體處理肽酶β亞單位的分離、描述和表達。J.Bacteriol.180，3867-3972.
Qrskov I(1984)Genus V Klebsiella In Krieg NR(ed.)系統(tǒng)細菌學的Bergey手冊。vol Ipp.461-465 Williams & Wilkins，Baltimore.
Sambrook J.，E.F.Fritsch and T.Maniatis.1989.分子克隆實驗手冊，第二版Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.
Schiweck H.Munir M.Rapp KM.Schneider B，and Vogel M.1991.使用蔗糖做為工業(yè)散裝化學藥品的新發(fā)展。InCarbohydrates asOrganic Raw Materials.EdLichtenthaler FW.Pp 57-94.VCH，NewYork.
Schwimmer，S.，and Bevenue，A.1956.鑒別1，4-和1，6-類糖淀粉的試劑?？茖W123，543-544.
Shiroza T.Ueda S.and Kuramitsu HK1987.突變鏈球菌gtfB基因的序列分析J.Bacteriol.169，4263-4270.
Smibert，R.M.，and N.R.Krieg.1981.常規(guī)描述，p.409-443.InGerhard，P.，R.G.E.Murray，R.N.Costilow，E.W.Nester，W.A.Wood，N.R.Krieg，and G.B.Philips(ed.)。通用細菌學方法手冊。AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.
Spoms，P.，Plhak，L.，and Friedrich，J.1992.艾伯特蜂蜜的組分。Food Research Intemational25，93-100.
Stackebrandt E and Goebel M(19940分類學注釋細菌學定義的當前菌種中DND-DNA重聚和1116s rRNA序列分析的位置。IntJSyst Bacteriol44，846-849.
Sugitani，et al.1993.美國專利No.5,229,276.
Sugitani，et al.1993.美國專利No.5,336,617.
Takazoe，1.1989.異麥芽酮糖——蔗糖的一種同分異構(gòu)體。InProgress in sweeteners，ed.Grenby，T.H.P143-167.Barking，ElsevierScience Publisher.
Topitsoglou V，N Sasaki，I Takazoe and G Frostell 1984在人的牙菌斑中經(jīng)常用異麥芽酮糖溶液浸泡對產(chǎn)酸的影響。Caries Res18，47-51。
Tsuyuki K.Sugitani T.Miyata Y.Ebashi T.and Yakajima Y.1992.泰國土壤產(chǎn)生異麥芽酮糖和海藻糖菌株的分離和鑒定。J.Gen.Appl.Microbiol.38，483-490.
Twell D.and Ooms G.1988馬鈴薯Desiree家族patatin基因結(jié)構(gòu)的多樣性。Mol.Gen Genet212，325-336.
Ueda S.Shiroza T.and Kuramitsu HK.1987-1988突變鏈球菌GS5gtfC基因的序列分析基因69，101-109.
Van den Broeck G，Timko MP，Kausch AP，Cashmore AR，VanMontagu M，Herrera-Estrella L.1995通過與轉(zhuǎn)運蛋白融合將外源蛋白從1，5二磷酸羧化酶的小亞基定位到葉綠體 自然313，358-363.
Wilke-Douglas M，Perchorowicz JT，Houck CM，and Thomas BR.1989改變水果和水果制品的物理性質(zhì)的方法和組成PCT Patent WO89 12386.
Yamamoto M.and Horikoshi K.1990.在alpha淀粉酶催化下由淀粉和糖原產(chǎn)生的異麥芽酮糖及糊精中的1，6-alpha-D-葡萄糖酸鍵的水解作用 Denpun Kagaku37，137-144.
Yokoyama R.Hirose T. Fujii N.Aspuria EJ，Kato A.，Uchimiya H.1994.轉(zhuǎn)基因西紅柿植株中假根土壤桿菌Ri質(zhì)粒rolC啟動子用蔗糖激活分子基因遺傳學244，15-22.
Zhang L，Xu J，and Birch RG.1999.賦予致病菌抗性的工程化解毒作用 自然生物技術17，1021-1024.
序列表<110>分子農(nóng)業(yè)生物學院<120>克雷伯氏菌屬的細菌分離物以及從其中分離的異麥芽酮糖合酶基因<130>細菌分離物[...]克雷伯氏菌屬<140>2577-134<141>2000-02-07<160>42<170>PatentIn Ver.2.1<210>2<211>598<212>PRT<213>Klebsiella singaporensis<400>2Met Ser Phe Val Thr Leu Arg Thr Gly Val Ala Val Ala Leu Ser Ser1 5 10 15Leu Ile Ile Ser Leu Ala Cys Pro Ala Val Ser Ala Ala Pro Ser Leu20 25 30Asn Gln Asp Ile His Val Gln Lys Glu Ser Glu Tyr Pro Ala Trp Trp35 40 45Lys Glu Ala Val Phe Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Thr50 55 60Asn Asp Asp Gly Ile Gly Asp Ile Arg Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp65 70 75 80Tyr Leu Lys Ser Leu Gly Ile Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr85 90 95Asp Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Asn Tyr Arg Gln100 105 110Ile Met Lys Glu Tyr Gly Thr Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu Val Ala115 120 125Glu Met Lys Lys Arg Asn Met Arg Leu Met Ile Asp Val Val Ile Asn
130 135 140His Thr Ser Asp Gln His Pro Trp Phe Ile Gln Ser Lys Ser Asp Lys145 150 155 160Asn Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Asp Asn165 170 175Gln Pro Pro Asn Asn Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln180 185 190Lys Asp Ala Lys Ser Gly Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Arg Gln195 200 205Gln Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu Asp Leu Tyr210 215 220Ala Met Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lys Gly Val Ser Gly Met Arg Phe225 230 235 240Asp Thr Val Ala Thr Tyr Ser Lys Ile Pro Gly Phe Pro Asn Leu Thr245 250 255Pro Glu Gln Gln Lys Asn Phe Ala Glu Gln Tyr Thr Met Gly Pro Asn260 265 270Ile His Arg Tyr Ile Gln Glu Met Asn Arg Lys Val Leu Ser Arg Tyr275 280 285Asp Val Ala Thr Ala Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Leu Asp Arg Ser290 295 300Ser Gln Phe Phe Asp Arg Arg Arg His Glu Leu Asn Met Ala Phe Met305 310 315 320Phe Asp Leu Ile Arg Leu Asp Arg Asp Ser Asn Glu Arg Trp Arg His325 330 335Lys Ser Trp Ser Leu Ser Gln Phe Arg Gln Ile Ile Ser Lys Met Asp340 345 350Val Thr Val Gly Lys Tyr Gly Trp Asn Thr Phe Phe Leu Asp Asn His355 360 365Asp Asn Pro Arg Ala Val Ser His Phe Gly Asp Asp Arg Pro Gln Trp370 375 380Arg Glu Ala Ser Ala Lys Ala Leu Ala Thr Ile Thr Leu Thr Gln Arg385 390 395 400Ala Thr Pro Phe Ile Tyr Gln Gly Ser Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr405 410 415Pro Phe Arg Gln Leu Asn Glu Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe420 425 430Trp Gln Asp Tyr Val Gln Ser Gly Lys Val Thr Ala Thr Glu Phe Leu435 440 445Asp Asn Val Arg Leu Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln450 455 460Trp Asn Asp Thr Leu Asn Ala Gly Phe Thr Arg Gly Lys Pro Trp Phe465 470 475 480His Ile Asn Pro Asn Tyr Val Glu Ile Asn Ala Glu Arg Glu Glu Thr485 490 495Arg Glu Asp Ser Val Leu Asn Tyr Tyr Lys Lys Met Ile Gln Leu Arg500 505 510His His Ile Pro Ala Leu Val Tyr Gly Ala Tyr Gln Asp Leu ASn Pro515 520 525Gln Asp Asn Thr Val Tyr Ala Tyr Thr Arg Thr Leu Gly Asn Glu Arg530 535 540Tyr Leu Val Val Val Asn Phe Lys Glu Tyr Pro Val Arg Tyr Thr Leu545 550 555 560Pro Ala Asn Asp Ala Ile Glu Glu Val Val Ile Asp Thr Gln Gln Gln565 570 575Ala Ala Ala Pro His Ser Thr Ser Leu Ser Leu Ser Pro Trp Gln Ala580 585 590Gly Val Tyr Lys Leu Arg595<210>3<211>18<212>DNA<213>Klebsiella singaporensis<400>3ttttctttaa taacaatt18<210>4<211>12<212>PRT<213>Klebsiella singaporernsis<400>4Phe Asp Leu Ile Arg Leu Asp Arg Asp Ser Asn Glu1 5 10<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>5tgacgagtgg cggacgggtg20<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>6ccatggtgtg acgggcggtg tg22<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>7tgacgagtgg cggacgggtg20<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>8ccatggtgtg acgggcggtg tg22<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>9tacgggaggc agcagtgggg aata24<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>10atgcagttcc caggttgagc20<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>11gaaatccccg ggctcaacct g21<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>12acatcgttta cggcgtggac tacc24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>13ggccgcaagg ttaaaactca aatg24<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>14ccggaccgct ggcaacaaag20<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>15cagttccgcg ttggcctg18<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>16cggttggcgt catcgtgttc20<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>17cccgctggca atatttctga ct22<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>18cacgaccact accctttctc ctga24<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>19cctcgcctca tttaaagaca ccaa24<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>20taggcgccat ataccagagc ag22<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>21cgtgactatt atttctggcg tgac24<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>22cgtcgcccgc tgagtgaggt aa22<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>23tagataacca tgacaacc18<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>24gcggtggcca catcatacc19<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>25cgccgtttat ttatcaaggt tcag24<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>26ggagcattgc cgtaaagat19<210>27<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>27ctatactctc ccggctaatg atgc24<210>28<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述kis基因測序用引物序列<400>28ccaccatgca ggatattcac ttt23<110>1<211>2463<212>DNA<213>Klebsiella singaporensis<400>1gatatcactg gtattatgga gtattatact ccccccttat ttactcatca aagccaggcg60ttccactctg cctccggtat ataactttcc gggaaacaat cccttcctga aaataattat120tgttaccgga gtcatactct ggctattgat gatttacgct tttctttaat aacaattcgt180ctcattcaca actgactttg caaggaaatt attatgtctt ttgttacgct acgtaccggg240gtggctgtcg cgctgtcatc tttgataata agtctggcct gcccggctgt cagtgctgca300ccatccttga atcaggatat tcacgttcaa aaggaaagtg aatatcctgc atggtggaaa360gaagctgttt tttatcagat ctatcctcgc tcatttaaag acaccaatga tgatggcatt420ggcgatattc gcggtattat tgaaaagctg gactatctga aatcgctcgg tattgacgct480atctggatca atccccatta cgactctccg aacaccgata acggctatga catcagtaat540tatcgtcaga taatgaaaga gtatggcaca atggaggatt ttgatagcct tgttgccgaa600atgaaaaaac gaaatatgcg cttaatgatc gacgtggtca ttaaccatac cagtgatcaa660cacccgtggt ttattcagag taaaagcgat aaaaacaacc cttatcgtga ctattatttc720tggcgtgacg gaaaagataa tcagccacct aataattacc cctcattttt cggcggctcg780gcatggcaaa aagatgcaaa gtcaggacag tactatttac actattttgc cagacagcaa840cctgatctca actgggataa cccgaaagta cgtgaggatc tttacgcaat gctccgcttc900tggctggata aaggcgtttc aggcatgcga tttgatacgg tggcaactta ttccaaaatc960ccgggatttc ccaatctgac acctgaacaa cagaaaaatt ttgctgaaca atacaccatg1020gggcctaata ttcatcgata cattcaggaa atgaaccgga aagttctgtc ccggtatgat1080gtggccaccg cgggtgaaat ttttggcgtc ccgctggatc gttcgtcgca gttttttgat1140cgccgccgac atgagctgaa tatggcgttt atgtttgacc tcattcgtct cgatcgcgac1200agcaatgaac gctggcgtca caagtcgtgg tcgctctctc agttccgcca gatcatcagc1260aaaatggatg tcacggtcgg aaagtatggc tggaacacgt tcttcttaga taaccatgac1320aacccccgtg cggtatctca cttcggggat gacaggccgc aatggcggga ggcgtcggct1380aaggcactgg cgacgattac cctcactcag cgggcgacgc cgtttattta tcagggttca1440gagctgggaa tgactaatta tcccttcagg caactcaacg aatttgacga catcgaggtc1500aaaggtttct ggcaggatta tgtccagagt ggaaaagtca cggccacaga gtttctcgat1560aatgtgcgcc tgacgagccg cgataacagc agaacacctt tccagtggaa tgacaccctg1620aatgctggtt ttactcgcgg aaagccgtgg tttcacatca acccaaacta tgtggagatc1680aacgccgaac gcgaagaaac ccgcgaagat tcagtgctga attactataa aaaaatgatt1740cagctacgcc accatatccc tgctctggta tatggcgcct atcaggatct taatccacag1800gacaataccg tttatgccta tacccgaacg ctgggtaacg agcgttatct ggtcgtggtg1860aactttaagg agtacccggt ccgctatact ctcccggcta atgatgctca ttgatactca1920gcagcaggcg gctgcgccgc acagcacatc cctgtcattg agcccctggc aggcaggtgt1980gtataagctg cggtaatcac ctgggggatt gatgacaagt tccccagaca atagagtttt2040ccaggtcttt agcactgctg tgctcagcga tagttgtgct ctcctgtgac ttcgtaagtg2100cctgtctcat ggcaggcatt gtcaggtcag aagccttctc aggcagcctc gagtaacagc2160gcccagttag catccccctg aaagatgggg ggtatgtata aattagcgtt aaagaacatg2220aaccagccac cgtcatctta tcaaccaaca ggcgagatga gctccgattc ctgattcttc2280acattgccgt tgatgcgcct gaagcctcgc cctttagggc cgggaaataa gcacagcatc2340tggcgatctc ttttgccact ttactgatca catccggcct catccatttc cgggcggctt2400cagccatcag gagaaagggt agtggtcgtg tatatgagcc aggccaaaaa aaggtgtgat2460atc2463<210>29<211>18<212>DNA<213>Ri質(zhì)粒<400>29attaattaat aaatttgt18<210>30<211>18<212>DNA<213>馬鈴薯<400>30attaattatt atttttcc18<210>31<211>18<212>DNA<213>馬鈴薯<400>31attatataat actaataa18<210>32<211>18<212>DNA<213>Petunia sp.<400>32attatgtcat aaattcta18<210>33<211>18<212>DNA<213>甘薯<400>33cttaatttac taatttgg18<210>34<211>12<212>PRT<213>Bacillus coagulans<400>34Val Asp Gly Trp Arg Met Asp Val Ile Gly Ser Ile1 5 10<210>35<211>12<212>PRT<213>Bacillus subtilis<400>35Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Val Ile Asn Leu Ile1 5 10<210>36<211>12<212>PRT<213>Streptococcus equisimilis<400>36Ile Gly Gly Phe Arg Met Asp Val Ile Asp Leu Ile1 5 10<210>37<211>12<212>PRT<213>L.mesenteroides NRRL B-512F<400>37Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val1 5 10<210>38<211>12<212>PRT<213>L.mesenteroides NRRL B-1299<400>38Phe Asp Gly Tyr Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val1 5 10<210>39<211>12<212>PRT<213>S.mutans GS5<400>39Phe Asp Ser Ile Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val1 5 10<210>40<211>12<212>PRT<213>S.mutans GS5<400>40Phe Asp Gly Val Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val1 5 10<210>41<211>12<212>PRT<213>Bacillus sp.<400>41Val Asp Gly Trp Arg Met Asp Val Ile Gly Ser Ile1 5 10<210>42<211>12<212>PRT<213>S.salivarius ATCC25975<400>42Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val1 5 10
權利要求
1.一種命名為LX3的克雷伯氏菌菌屬的菌株。
2.一種命名為LX21的克雷伯氏菌菌屬的菌株。
3.編碼KIS蛋白的核苷酸序列，包含SEQ ID No.1的序列。
4.由核苷酸序列SEQ ID No.1編碼的異麥芽糖合酶，包含SEQID No.2的序列。
5.在遺傳編碼簡并性范圍內(nèi)，相應于來自權利要求3的SEQ IDNo1的核苷酸序列。
6.與任何來源的信號肽編碼區(qū)融合的相應于來自權利要求3的SEQ ID No1的核苷酸序列。
7.含有權利要求3的核酸分子的表達載體，其中該表達載體在原核或真核細胞中增殖。
8.使用權利要求7的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核細胞。
9.在植物中生產(chǎn)異麥芽酮糖的方法，此方法包括向這種植物的細胞中導入編碼轉(zhuǎn)化蔗糖成異麥芽酮糖的酶的核酸序列，以此方式使細胞表達所述核酸序列。
10.權利要求9的方法，其中所述核酸序列包括來自權利要求3的SEQ ID No1，其融合或不融合任何來源的信號肽編碼區(qū)。
11.權利要求9的方法，其中所述核酸序列包括來自權利要求3的SEQ ID No1，其融合或不融合任何來源的靶向液泡的信號肽編碼區(qū)。
12.權利要求9的方法，其中所述核酸序列包括SEQ ID No1，其摻入或沒有摻入任何來源的膜附著區(qū)的編碼區(qū)。
13.權利要求9的方法，其中所述核酸序列包括在遺傳編碼簡并性范圍內(nèi)相應于來自權利要求3 SEQ ID No1的核苷酸序列，其摻入或沒有摻入任何來源的膜附著區(qū)的編碼區(qū)。
14.權利要求9的方法，其中所述核酸序列包括在遺傳編碼簡并性范圍內(nèi)相應于來自權利要求3的SEQ ID No1的核苷酸序列，其融合或不融合任何來源的信號肽編碼區(qū)。
15.權利要求9的方法，其中所述蛋白包含SEQ ID No2，其融合或不融合任何來源的信號肽。
16.權利要求9的方法，其中所述蛋白包含SEQ ID No2，其摻入或沒有摻入任何來源的膜附著區(qū)。
17.權利要求9的方法，其中的植物優(yōu)選自甘蔗、玉米、西瓜和甜菜。
18.分離權利要求3中DNA的功能克隆方法，其中該DNA編碼具有產(chǎn)生異麥芽酮糖活性的蛋白，所述方法包括如下步驟(a)從供體生物體制備基因庫，其含有編碼在適當?shù)乃拗魃矬w中的異麥芽酮糖生物合成活性的DNA序列；(b)利用它們的增加的還原糖含量從基因庫中篩選目的克隆，以及(c)分離含有編碼具有異麥芽酮糖生物合成活性的蛋白的DNA的克隆。
19.權利要求18的方法，其中使用大腸桿菌做為宿主生物體。
20.權利要求19的方法，其中制備基因庫、篩選克隆和分離克隆一種大腸桿菌菌株中進行，該菌株在規(guī)定時間段內(nèi)不產(chǎn)生大量的還原糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新菌種的兩個菌株，即新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis)LX3及LX21。本發(fā)明還涉及編碼一種新型異麥芽酮糖合酶KIS的核苷酸序列(kis)。還涉及在植物中產(chǎn)生異麥芽酮糖的方法，此方法包括在該植株細胞中引入一種編碼將蔗糖轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖的酶的核酸序列，從而使得轉(zhuǎn)化細胞表達所述的核酸序列。本發(fā)明還涉及用于分離編碼KIS蛋白的核苷酸序列的功能克隆方法，包括步驟(a)從供體生物體制備基因庫，其含有編碼在適當?shù)乃拗魃矬w中的異麥芽酮糖生物合成活性的DNA序列；(b)利用它們的增加的還原糖含量從基因庫中篩選目的克隆；(c)分離含有編碼具有異麥芽酮糖生物合成活性的蛋白的DNA的克隆。
文檔編號A01H1/00GK1434861SQ00819035
公開日2003年8月6日 申請日期2000年2月15日 優(yōu)先權日2000年2月15日
發(fā)明者張煉輝, 李憲臻, 張道海 申請人:分子農(nóng)業(yè)生物學院