本發(fā)明涉及一種基于粘性末端-介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)結(jié)合聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測UDG活性的方法。

背景技術(shù)：

尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)能對DNA中的尿嘧啶(U)損傷進(jìn)行特異地識別和移除，進(jìn)而引發(fā)U損傷的堿基移除修復(fù)過程(Stivers，J.T.；Jiang，Y.L.，A mechanistic perspective on the chemistry of DNA repair glycosylases.Chem.Rev.，2003，103，2729-2759；Parikh，S.S.；Walcher，G.；Jones，G.D.；Slupphaug，G.；Krokan，H.E.；Blackburn，G.M.；Tainer，J.A.，Uracil-DNA glycosylase-DNA substrate and product structures：conformational strain promotes catalytic efficiency by coupled stereoelectronic effects.PNAS.，2000，97，5083-5088.)。人體中，每天每個細(xì)胞的基因組中會出現(xiàn)數(shù)百個U損傷，它們一部分來自于胞嘧啶(C)的自發(fā)水解脫氨作用，另一部分來自于DNA復(fù)制過程中三磷酸脫氧尿苷酸(dUTP)的錯誤摻入(Sousa，M.M.；Krokan，H.E.；Slupphaug，G.，DNA-uracil and human pathology.Mol.Aspects Med.，2007，28，276-306；Kavli，B.；Sundheim,O.；Akbari，M.；Otterlei，M.；Nilsen，H.；Skorpen,F.；Aas，P.A.；Hagen，L.；Krokan，H.E.；Slupphaug，G.，hUNG2 is the major repair enzyme for removal of uracil from U：A matches，U：G mismatches，and U in single-stranded DNA，with hSMUG1 as a broad specificity backup.J.Biol.Chem.，2002，277,39926-39936.)。異?；钚缘腢DG將不能對這些U損傷進(jìn)行修復(fù)，從而引起基因突變，干擾基因組的完整性，導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生(Bulgar，A.D.；Weeks，L.D.；Miao，Y.；Yang，S.；Xu，Y.；Guo，C.；Markowitz,S.；Oleinick，N.；Gerson，S.L.；Liu,L.，Cell Death Dis.，2012，3，e252.)。因此，靈敏檢測UDG的活性能為功能研究和臨床診斷提供一種有價(jià)值的策略。

目前檢測UDG活性的常用方法需要放射性的標(biāo)記或耗時的電泳過程(Ischenko，A.A.；Saparbaev，M.K.，Alternative nucleotide incision repair pathway for oxidative DNA damage.Nature，2002，415，183-187.)。為了實(shí)現(xiàn)安全且快速地檢測UDG的活性，一些新型的生物傳感方法已被發(fā)展，包括電化學(xué)生物傳感法(McWilliams，M.A.；Anka，F(xiàn).H.；Balkus，K.J.；Slinker，J.D.，Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair.Biosens，Bioelectron.，2014，54，541-546.)、比色生物傳感法(Liu，X.J.；Chen，M.Q.；Hou，T.；Wang，X.Z.；Liu，S.F.；Li，F(xiàn).，Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification.Biosens，Bioelectron.，2014，54，598-602.；Nie，H.；Wang，W.；Li，W.；Nie，Z.；Yao，S.，A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex.Analyst，2015，140，2771-2777.)以及熒光生物傳感法(Liu，B.；Yang,X.；Wang，K.；Tan,W.；Li，H.；Tang，H.，Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes.Anal.Biochem.，2007，366，237-243.)。其中，熒光生物傳感法已被廣泛用于檢測UDG的活性。為了進(jìn)一步提高檢測的靈敏度，信號擴(kuò)增技術(shù)已被用于熒光生物傳感方法的構(gòu)建中。Yu課題組(Zhang，L.L.；Zhao，J.J.；Jiang，J.H.；Yu，R.Q.，A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity.Chem.Commun.，2012,48,8820-8822.)設(shè)計(jì)了一種含有多個U堿基的雙鏈DNA探針，當(dāng)UDG將該雙鏈DNA探針中的多個U堿基移除之后，雙鏈DNA發(fā)生解離并釋放出DNA酶序列，從而引發(fā)DNA酶的自催化信號擴(kuò)增過程。

申請?zhí)枮镃N201510061929.X的專利公開了一種基于DNA機(jī)器的熒光信號擴(kuò)增方法用于UDG的活性檢測，其中DNA機(jī)器的引發(fā)部分也是一種含有多個U堿基的雙鏈DNA探針，并且只有當(dāng)該雙鏈DNA探針中的多個U堿基都被UDG移除之后，它才能釋放出引物序列來引發(fā)DNA機(jī)器的運(yùn)行。在這些信號擴(kuò)增型的熒光生物傳感方法中，它們通過直接雜交模式將信號探針或引物序列封閉在雙鏈DNA中，并把這種含多個U堿基的雙鏈DNA作為UDG的識別探針。然而，當(dāng)?shù)突钚缘腢DG只能移除探針中的1個或2個U堿基而產(chǎn)生少量無嘌呤/無嘧啶位點(diǎn)(AP)位點(diǎn)時，由于AP位點(diǎn)也是一種錯配類型，而直接雜交模式難以辨別少量錯配，因此信號探針或引物序列此時仍被封閉在雙鏈DNA中，導(dǎo)致響應(yīng)減弱，限制了靈敏度的提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測UDG活性的探針，目的之二是提供一種基于粘性末端-介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)結(jié)合聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測UDG活性的方法，目的之三是提供一種檢測UDG活性的試劑盒。

具體技術(shù)方案如下：

一種檢測UDG活性的探針，包括單鏈DNA識別探針UP、發(fā)夾探針TP以及信號報(bào)道探針RP；

所述單鏈DNA識別探針包括：引物序列、1個或兩個連續(xù)的U堿基，所述兩個連續(xù)的U堿基在單鏈DNA的端部；

所述發(fā)夾探針TP包括，粘性末端、與識別探針UP完全互補(bǔ)的頸部堿基序列；

所述信號報(bào)道探針RP，是一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3’端含有懸垂的序列，所述懸垂序列能夠與識別探針UP序列雜交，頸部含有G4DNA的互補(bǔ)序列和切刻酶Nt.BstNBI的識別序列。

一種檢測UDG活性的方法，基于粘性末端-介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)結(jié)合聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，步驟如下：

(1)將發(fā)夾探針TP以及信號報(bào)道探針RP加熱變性降溫后備用；

(2)對UDG的識別反應(yīng)：將識別探針UP與待測的UDG加入到1×ThermoPol緩沖溶液中進(jìn)行孵育反應(yīng)，；

(3)TSDR對產(chǎn)物AP錯配的特異性識別：向步驟(2)的反應(yīng)產(chǎn)物中加入發(fā)夾探針TP和10×ThermoPol緩沖溶液進(jìn)行孵育反應(yīng)；

(4)聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：向步驟(3)反應(yīng)產(chǎn)物中加入1×ThermoPol緩沖溶液，NEB buffer 3，dNTPs，信號報(bào)道探針RP，Vent(exo-)DNA聚合酶以及Nt.BstNBI切刻酶混合反應(yīng)；

(5)向步驟(4)反應(yīng)產(chǎn)物中加入KCl溶液，NMM溶液，混合反應(yīng)，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光測定，構(gòu)建熒光強(qiáng)度與UDG濃度之間的線性曲線，對某一樣品通過測定樣品的熒光強(qiáng)度，代入線性曲線，計(jì)算UDG濃度；

所述識別探針UP、發(fā)夾探針TP、信號報(bào)道探針RP同上所述。

一種基于粘性末端-介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)結(jié)合聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測UDG活性的方法，步驟如下：

(1)將含有粘性末端的發(fā)夾探針TP以及信號報(bào)道探針RP加熱變性(優(yōu)選：置于90℃的條件下加熱變性5min)，待溫度緩慢降至室溫，將所得產(chǎn)物保存?zhèn)溆?優(yōu)選：置于4℃的條件下保存?zhèn)溆?；

(2)將100nM-500nM識別探針UP與待測的UDG加入到1×ThermoPol緩沖溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％TritonX-100)中，得到混合溶液，并將該溶液混勻后孵育反應(yīng)(優(yōu)選：37℃的條件下孵育20min-60min)，以完成對UDG的識別反應(yīng)；

(3)向步驟(2)的反應(yīng)產(chǎn)物中加入150nM-1.80μM發(fā)夾探針TP和10×ThermoPol緩沖溶液(200mM Tris-HCl，pH 8.8，100mM KCl，100mM(NH4)₂SO₄，20mM MgSO₄，1％TritonX-100)，得到混合溶液，并將該溶液下孵育反應(yīng)(優(yōu)選：37℃的條件下反應(yīng)30min-120min)，以完成TSDR對產(chǎn)物AP錯配的特異性識別；

(4)向步驟(3)反應(yīng)產(chǎn)物中加入1×ThermoPol緩沖溶液，NEB buffer 3，0.05mM-0.50mM的dNTPs，150nM-375nM的信號報(bào)道探針RP，0.02U/μL-0.20U/μL的Vent(exo-)DNA聚合酶以及0.05U/μL-0.50U/μL的Nt.BstNBI切刻酶，得到混合溶液，混勻后反應(yīng)(優(yōu)選：混勻后將其置于55℃的條件下反應(yīng)30min-100min)，以進(jìn)行聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；

(5)向步驟(4)反應(yīng)產(chǎn)物中加入160mM的KCl，1.00μM-10.0μM的NMM至終體積為60μL，并將該混合物反應(yīng)(優(yōu)選：37℃條件下孵育10min-60min)，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光測定，構(gòu)建熒光強(qiáng)度與UDG濃度之間的線性曲線，對某一樣品通過測定樣品的熒光強(qiáng)度，代入線性曲線，計(jì)算UDG濃度。

一種檢測UDG活性的試劑盒，包括上述的單鏈DNA識別探針UP、發(fā)夾探針TP以及信號報(bào)道探針RP。所述的試劑盒，還包括1×ThermoPol緩沖溶液、10×ThermoPol緩沖溶液、NEB buffer 3、Vent(exo-)DNA聚合酶、Nt.BstNBI切刻酶。

上述方法和探針在檢測HELA細(xì)胞裂解液中的UDG活性中的應(yīng)用。

基于粘性末端-介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)結(jié)合聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增方法對UDG活性進(jìn)行檢測的原理：

以TSDR來對少量U堿基的移除進(jìn)行響應(yīng)，并結(jié)合聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，發(fā)展了一種熒光信號擴(kuò)增方法用于靈敏檢測UDG的活性，具體的設(shè)計(jì)原理如圖1所示。識別探針UP是一條單鏈DNA，它含有引物序列和兩個U堿基。發(fā)夾探針TP的3’端含有粘性末端序列，并且該粘性末端以及與之相連的頸部的序列能與識別探針UP完全互補(bǔ)。另外，信號報(bào)道探針RP也是一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，它的3’端含有懸垂的序列，頸部含有G4 DNA的互補(bǔ)序列，并且環(huán)部還含有切刻酶Nt.BstNBI的識別序列。在UDG的作用下，識別探針UP中的兩個U堿基被移出，從而生成一條含有兩個AP位點(diǎn)的UP’探針。由于AP錯配能抑制UP’與TP中粘性末端的雜交，因此TSDR將不會發(fā)生，從而使得單鏈探針UP’中的引物序列仍能自由存在。隨后，該引物序列能與信號報(bào)道探針RP中的懸垂序列發(fā)生雜交，并在聚合酶Vent(exo-)的作用下引發(fā)鏈延伸反應(yīng)，得到DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。接著，Nt.BstNBI識別并切刻雙鏈DNA中完整的識別位點(diǎn)，產(chǎn)生的切口又能作為聚合酶作用的新位點(diǎn)，進(jìn)而繼續(xù)引發(fā)鏈延伸反應(yīng)。通過循環(huán)的聚合-切刻-置換反應(yīng)，系統(tǒng)釋放出大量的G4序列，它們在單價(jià)陽離子的存在下能折疊成G4結(jié)構(gòu)，并與NMM發(fā)生特異性地結(jié)合，產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光信號。然而，當(dāng)UDG不存在時，單鏈探針UP能與發(fā)夾探針TP中的粘性末端發(fā)生雜交，進(jìn)而引發(fā)TSDR，導(dǎo)致探針UP中的引物序列被封閉，從而不能引發(fā)后續(xù)的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。本方法能通過TSDR來對少量U堿基的移除進(jìn)行響應(yīng)，并結(jié)合聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)對UDG活性的靈敏檢測。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明以TSDR來對少量U堿基的移除進(jìn)行響應(yīng)，并結(jié)合聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，構(gòu)建了一種熒光信號擴(kuò)增方法用于靈敏檢測UDG的活性。在本方法中，分別設(shè)計(jì)了單鏈DNA識別探針、含有粘性末端的發(fā)夾探針以及信號報(bào)道探針。當(dāng)UDG存在時，單鏈DNA探針中的兩個U堿基被移除，得到含有AP錯配的單鏈DNA探針?；赥SDR對少量錯配的特異性識別能力，上述含AP錯配的單鏈DNA探針將不能與含粘性末端的發(fā)夾探針發(fā)生TSDR，從而使單鏈DNA探針中的引物序列仍能自由存在。隨后，該引物序列與信號報(bào)道探針發(fā)生雜交，進(jìn)而引發(fā)后續(xù)的聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對少量U堿基移除的靈敏響應(yīng)，提高了檢測UDG活性的靈敏度。然而，當(dāng)UDG不存在時，單鏈DNA探針能與含粘性末端的發(fā)夾探針發(fā)生TSDR，導(dǎo)致引物序列被封閉，從而不能引發(fā)后續(xù)的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，降低了陰性信號。本方法能檢測低至0.000027U/mL的UDG活性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明方法檢測UDG活性的原理圖；

圖2為在不同條件下，傳感系統(tǒng)的熒光發(fā)射光譜：a：UP+UDG+TP+RP，b：UP+TP+RP，c：UDG+TP+RP，d：UP+UDG+TP；

圖3ΔF相對于UDG濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)插圖為傳感系統(tǒng)對低濃度UDG活性的線性響應(yīng)，誤差棒為三次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

圖4在不同條件下，考察傳感系統(tǒng)的特異性：(1)不含UDG的對照實(shí)驗(yàn)，(2)UDG，(3)混合樣品(UDG，hOGG1，hAAG和DNase I)，(4)hOGG1，(5)hAAG，(6)DNase I，各酶的濃度均為1.0U/mL。誤差棒為三次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

圖5傳感系統(tǒng)對HeLa細(xì)胞裂解液的熒光光譜響應(yīng)以及UGI對HeLa細(xì)胞裂解液中UDG活性的抑制效果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

本發(fā)明實(shí)施例中所用到的實(shí)驗(yàn)試劑和儀器如下：

本發(fā)明使用的DNA寡核苷酸是由生工(中國，上海)合成和純化的，(TP探針：TGGCGGAGGCAGGAGTTTTTTTTTTTCTCCTGCCTCCGCCAAATTGT；UP探針：ACAAUUTGGCGGAGGCAGGAG；RP探針：CCCAACCCGCCCTACCCTTTTTGACTCGTAGGGCGGCTCCTGCCTCCGCCA)，其中斜體代表懸垂序列，標(biāo)灰字母代表尿嘧啶脫氧核糖核苷酸。UDG，8-氧化鳥嘌呤DNA糖化酶(hOGG1)，烷基化腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)，DNA酶I(DNase I)，尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)，Vent(exo-)DNA聚合酶，Nt.BstNBI切刻酶都是購于New England Biolabs(中國，北京)。一單位的UDG是指在1min內(nèi)催化水解雙鏈DNA中60pmol的U堿基所需要的酶量。一單位的UGI是指在體積為50μL的反應(yīng)體系中1h內(nèi)抑制一個單位的UDG所需要的蛋白量。三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)購于Fermentas(中國，北京)。NMM購于Frontier Scientific(美國，猶他州，羅根)。二甲基亞砜(DMSO)是從生工(中國，上海)購得的。所有其它的化學(xué)藥品都是分析純的。制備溶液時用到的超純水都是來自Millipore Milli-Q水凈化系統(tǒng)(>18.25MΩ·cm)。

所有的熒光測試都是在日立F-7000熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)上進(jìn)行的。激發(fā)波長為399nm，收集的發(fā)射波長的范圍是560nm-700nm。我們利用618nm處的熒光強(qiáng)度來評價(jià)本方法的分析性能。激發(fā)狹縫寬度和發(fā)射狹縫寬度都被設(shè)置為10nm，光電倍增管電壓被設(shè)置為700V。

實(shí)施例1檢測UDG的活性

為了得到相應(yīng)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，分別將含有粘性末端的發(fā)夾探針TP以及信號報(bào)道探針RP置于90℃的條件下加熱變性5min，待溫度緩慢降至室溫，將所得產(chǎn)物置于4℃的條件下保存?zhèn)溆?。?00nM-500nM識別探針UP與不同濃度的UDG加入到1×ThermoPol緩沖溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％TritonX-100)中，得到終體積為20μL的混合溶液，并將該溶液混勻后置于37℃的條件下孵育20min-60min，以完成對UDG的識別反應(yīng)。接著，向上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入150nM-1.80μM的發(fā)夾探針TP和1.0μL 10×ThermoPol緩沖溶液(200mM Tris-HCl，pH 8.8，100mM KCl，100mM(NH4)₂SO₄，20mM MgSO₄，1％TritonX-100)，得到終體積為30μL的混合溶液，并將該溶液置于37℃的條件下反應(yīng)30min-120min，以完成TSDR對產(chǎn)物AP錯配的特異性識別。隨后，向上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入1×ThermoPol緩沖溶液，NEB buffer 3，0.05mM-0.50mM的dNTPs，150nM-375nM的信號報(bào)道探針RP，0.02U/μL-0.20U/μL的Vent(exo-)DNA聚合酶以及0.05U/μL-0.50U/μL的Nt.BstNBI切刻酶，得到混合溶液的終體積為50μL，混勻后將其置于55℃的條件下反應(yīng)30min-100min，以進(jìn)行聚合切刻等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。最后，向上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入160mM的KCl，1.00μM-10.0μM的NMM至終體積為60μL，并將該混合物置于37℃條件下孵育10min-60min。

實(shí)施例2本發(fā)明方法檢測Hela細(xì)胞裂解液中的UDG活性

制備Hela細(xì)胞裂解液：Hela細(xì)胞樣品通過離心分離(5min，3000rpm，4℃)而被壓成丸狀，并在冰上通過超聲波儀而重新分散在裂解緩沖液(10mM Tris-Hcl,pH 7.0)中?；旌先芤弘S后在4℃下以12,000rpm的速度進(jìn)行離心分離30min以移除不可溶的物質(zhì)。收集上清液并通過0.45μm的濾膜過濾，產(chǎn)生粗制的Hela細(xì)胞裂解液。

將1.0μL的HeLa細(xì)胞裂解液作為待測樣品，其中該HeLa細(xì)胞裂解液的濃度為每1.0μL細(xì)胞裂解液中含1.0×10⁴個細(xì)胞。如圖5所示，緩沖溶液僅能引起非常低的熒光信號，而HeLa細(xì)胞裂解液則能引起明顯增強(qiáng)的熒光信號。另外，當(dāng)向含有HeLa細(xì)胞裂解液的系統(tǒng)中加入U(xiǎn)DG的抑制劑UGI之后，傳感系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度僅與緩沖溶液的相當(dāng)。這表明，傳感系統(tǒng)熒光信號的增強(qiáng)是由HeLa細(xì)胞裂解液中的UDG引起的。并且，本方法對細(xì)胞裂解液中其它組分的干擾具有耐受性。

實(shí)施例3對UDG活性進(jìn)行檢測的可行性驗(yàn)證

利用熒光發(fā)射光譜驗(yàn)證了本方法用于檢測UDG活性的可行性。如圖2中的曲線d所示，當(dāng)傳感系統(tǒng)中不含信號報(bào)道探針RP時，傳感系統(tǒng)表現(xiàn)出非常低的熒光信號。這表明熒光信號的產(chǎn)生離不開探針RP的存在。如圖2中的曲線c所示，當(dāng)系統(tǒng)中不含識別探針UP時，傳感系統(tǒng)的熒光信號也非常低。這表明在本方法中，傳感系統(tǒng)對UDG的識別離不開UP探針的參與。如圖2中的曲線b所示，當(dāng)UDG不存在時，傳感系統(tǒng)仍表現(xiàn)出非常低的熒光信號。這是由于探針UP能夠與發(fā)夾探針TP發(fā)生TSDR，使探針UP中的引物序列被封閉，導(dǎo)致后續(xù)的信號擴(kuò)增及產(chǎn)生過程不能進(jìn)行。如圖2中的曲線a所示，當(dāng)UDG存在時，傳感系統(tǒng)則表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的熒光信號。這表明當(dāng)UDG存在時，探針UP中的U堿基被移除而形成含有AP錯配的UP’探針，其中AP錯配將抑制UP’與TP探針之間發(fā)生TSDR，這使得UP’探針中的引物序列仍能自由存在，該引物序列能引發(fā)隨后的信號擴(kuò)增及產(chǎn)生過程。上述結(jié)果驗(yàn)證了本方法用于檢測UDG活性的可行性。

實(shí)施例4檢測UDG的活性

為了定量檢測UDG的活性，在最優(yōu)反應(yīng)條件下對不同濃度的UDG活性進(jìn)行了檢測。圖3展示了傳感系統(tǒng)的凈信號強(qiáng)度ΔF與UDG濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且內(nèi)插圖顯示出本方法對UDG活性的線性檢測范圍是從0.00020U/mL到0.0080U/mL，線性回歸方程為ΔF＝30.13+9.936×104CUDG，R2＝0.9993。根據(jù)3δ原則，本方法對UDG活性的檢測限為0.000027U/mL的，這低于目前文獻(xiàn)報(bào)道的檢測限。

實(shí)施例5本發(fā)明方法在檢測UDG的活性時的精密度和重現(xiàn)性

另外，研究了本方法檢測UDG活性的精密度和重現(xiàn)性。為了考察本方法的精密度，在同一天內(nèi)，對目標(biāo)樣品進(jìn)行了一系列的三次平行測定。對于UDG濃度分別為0.001U/mL，0.004U/mL和0.006U/mL的樣品，得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.1％，3.7％和3.1％。另外，為了考察本方法的重現(xiàn)性，在三個不同的日子里，對目標(biāo)樣品進(jìn)行了一系列的三次平行測定。對于含不同濃度(0.001U/mL，0.004U/mL和0.006U/mL)UDG的樣品，RSD值分別為5.8％，5.9％和5.5％。這些結(jié)果表明本方法在檢測UDG的活性時具有合格的精密度和重現(xiàn)性。

實(shí)施例6本發(fā)明本方法在檢測UDG的活性時的特異性

為了考察本方法的特異性，研究了傳感系統(tǒng)對UDG以及其他酶(包括hOGG1，hAAG和DNase I)的熒光響應(yīng)，結(jié)果見圖4。只有UDG能引起明顯增強(qiáng)的熒光信號，而hOGG1，hAAG和DNase I均不能引起熒光信號的增強(qiáng)。另外，當(dāng)UDG與hOGG1，hAAG和DNase I混合之后，混合物中的UDG仍能引起熒光信號的增強(qiáng)，并且此時的信號強(qiáng)度與UDG單獨(dú)存在時引起的信號強(qiáng)度相當(dāng)。這表明本方法能特異性地檢測UDG的活性。

上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。