本發(fā)明涉及腫瘤診斷、治療、預(yù)測(cè)預(yù)后領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測(cè)ERC1異常為手段的腫瘤診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后方法；及激活ERC1基因或蛋白質(zhì)的腫瘤治療劑。
背景技術(shù)：
：下咽癌是嚴(yán)重危害人們生命和健康的常見(jiàn)頭頸部惡性腫瘤，病理類型多為鱗狀細(xì)胞癌。近年來(lái)，由于環(huán)境等多種不同致癌因素的共同作用，下咽癌的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì)。盡管以外科手術(shù)為主的綜合治療措施取得較大進(jìn)展，但是下咽癌患者綜合治療后的年生存率仍無(wú)明顯的提高。盡管如此，臨床大量數(shù)據(jù)表明，治療的早晚對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生重要的影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，早期下咽癌治療效果相對(duì)較好，晚期下咽癌由局部浸潤(rùn)和處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，治療效果較差，年生存率下降。由此，提高下咽癌療效的關(guān)鍵在于的早期診斷、早期治療。然而下咽癌早期診斷困難，目前尚沒(méi)有可靠的用于早期診斷的特異性指標(biāo)，因此，臨床上亟待尋找下咽癌相關(guān)的特異性腫瘤標(biāo)志物以輔助早期診斷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過(guò)檢測(cè)ERC1基因或蛋白表達(dá)差異來(lái)診斷下咽癌的方法。本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過(guò)檢測(cè)ERC1基因或蛋白表達(dá)差異來(lái)預(yù)測(cè)下咽癌預(yù)后的方法。本發(fā)明的目的之三在于提供一種通過(guò)激活ERC1基因或ERC1蛋白來(lái)治療下咽癌的方法。本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于篩選治療下咽癌的藥物的方法。本發(fā)明的目的之五在于提供一種用于治療下咽癌的藥物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了檢測(cè)ERC1基因或ERC1蛋白的產(chǎn)品在制備下咽癌診斷工具中的用途。本發(fā)明還提供了檢測(cè)ERC1基因或ERC1蛋白的產(chǎn)品在制備預(yù)測(cè)下咽癌預(yù)后工具中的用途。進(jìn)一步，所述檢測(cè)ERC1基因或ERC1蛋白的產(chǎn)品包括檢測(cè)ERC1基因或ERC1蛋白的表達(dá)水平的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合ERC1基因的核酸或者能夠結(jié)合ERC1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測(cè)ERC1基因的表達(dá)水平；所述物質(zhì)能夠檢測(cè)ERC1蛋白的表達(dá)水平。本發(fā)明的檢測(cè)ERC1基因的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來(lái)發(fā)揮其功能：如PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點(diǎn)雜交、熒光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、ASO法、高通量測(cè)序平臺(tái)等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實(shí)施分析。包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得，或通過(guò)從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸的引物擴(kuò)增它來(lái)獲得。進(jìn)一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS(AmplificationRefractoryMutationSystem，擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴(kuò)增的核酸可以通過(guò)使用點(diǎn)印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特異性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來(lái)檢測(cè)。上面所述的核酸包括擴(kuò)增ERC1基因的引物，產(chǎn)品中包括的引物可以通過(guò)通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來(lái)適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)，并通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述核酸為QPCR實(shí)驗(yàn)中使用的擴(kuò)增引物，所述引物的序列如SEQIDNO.1(正向序列)和SEQIDNO.2(反向序列)所示。上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來(lái)恰當(dāng)設(shè)計(jì)，并通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，或者可以通過(guò)從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸序列的引物擴(kuò)增它來(lái)制備。本發(fā)明的檢測(cè)ERC1蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來(lái)發(fā)揮其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫測(cè)定法、免疫組織化學(xué)法、Western印跡等。本發(fā)明的檢測(cè)ERC1蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合ERC1蛋白的抗體或其片段?？梢允褂萌魏谓Y(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗體對(duì)抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V區(qū)(雙抗體)、或含有CDR的肽。本發(fā)明的檢測(cè)ERC1蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細(xì)胞。抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)獲得。例如，制備保留整個(gè)或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體作為抗原。使用抗原免疫動(dòng)物后，從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物獲得免疫細(xì)胞并融合骨髓瘤細(xì)胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過(guò)使用被用作抗原的ERC1蛋白或其部分對(duì)獲得的抗體實(shí)施抗原特異性純化來(lái)獲得針對(duì)ERC1蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動(dòng)物，從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對(duì)血清實(shí)施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^(guò)用酶處理獲得的抗體或通過(guò)使用獲得的抗體的序列信息來(lái)獲得抗體片段。標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過(guò)本領(lǐng)域普遍知道的方法來(lái)實(shí)施。例如，可以如下熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用DMSO、緩沖劑、等準(zhǔn)備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-NH2、生物素標(biāo)記試劑盒-SH(DojindoLaboratories)；堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-NH2、堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-SH(DojindoLaboratories)；過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2、過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2(DojindoLaboratories)；藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2，B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒SH(DojindoLaboratories)；熒光標(biāo)記試劑盒諸如熒光素標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyteFluor(TM)555標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyteFluor(TM)647標(biāo)記試劑盒-NH2(DojindoLaboratories)；及DyLight547和DyLight647(TechnoChemicalCorp.)、Zenon(TM)、AlexaFluor(TM)抗體標(biāo)記試劑盒、Qdot(TM)抗體標(biāo)記試劑盒(InvitrogenCorporation)和EZ-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒(FunakoshiCorporation)。為了正確標(biāo)記，可以使用適宜的儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗體或其片段。作為依照本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測(cè)定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級(jí)分或經(jīng)過(guò)處理的材料。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣品來(lái)自受試者的組織。在本發(fā)明中，“預(yù)后”是指腫瘤患者在通過(guò)手術(shù)處理等抑制或緩解腫瘤生長(zhǎng)后的過(guò)程或結(jié)果。在本說(shuō)明書(shū)中，預(yù)后可以是通過(guò)手術(shù)處理抑制或緩解腫瘤生長(zhǎng)后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時(shí)的生機(jī)狀態(tài)。預(yù)后可以通過(guò)檢查生物標(biāo)志物即ERC1蛋白或編碼ERC1蛋白的基因來(lái)預(yù)測(cè)。預(yù)后預(yù)測(cè)可以這樣進(jìn)行：根據(jù)生物標(biāo)志物的有或無(wú)，或者升高或降低，確定患者的預(yù)后是良好還是不良，或者確定良好預(yù)后或不良預(yù)后的概率。在本發(fā)明中，“預(yù)后良好”是指在通過(guò)手術(shù)處理等為患者抑制或緩解腫瘤生長(zhǎng)之后，患者長(zhǎng)時(shí)期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長(zhǎng))沒(méi)有危急狀況?；蛘?，預(yù)后好可以意指在這樣長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)存活、無(wú)轉(zhuǎn)移、無(wú)復(fù)發(fā)、或無(wú)再發(fā)。例如，預(yù)后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，優(yōu)選沒(méi)有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。預(yù)后良好最優(yōu)選的狀態(tài)是長(zhǎng)期無(wú)疾病的存活。如本文中所使用的，“預(yù)后良好”還可以包括任何這樣的狀態(tài)，其中可以發(fā)現(xiàn)疾病如轉(zhuǎn)移，但是惡性低且不嚴(yán)重地影響生存能力。在本發(fā)明中，“預(yù)后不良”是指患者在通過(guò)手術(shù)處理等抑制或緩解腫瘤生長(zhǎng)后的短時(shí)期(例如1、2、3、4、5年或更短)內(nèi)發(fā)生致命狀況。或者，預(yù)后差是指在這樣的短時(shí)期里死亡、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、或再發(fā)。例如，預(yù)后差可以意指至少3年或尤其至少5年內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、或死亡。預(yù)測(cè)預(yù)后是指預(yù)測(cè)患者狀況的過(guò)程或結(jié)果，并不意味著能以100％的準(zhǔn)確度預(yù)測(cè)患者狀況的過(guò)程或結(jié)果。預(yù)測(cè)預(yù)后是指確定某些過(guò)程或結(jié)果的可能性是否增加，而并不意味著通過(guò)與某些過(guò)程或結(jié)果不發(fā)生的情況比較來(lái)確定發(fā)生某些過(guò)程或結(jié)果的可能性。如本發(fā)明而言，本發(fā)明中ERC1基因或ERC1蛋白的水平降低的患者中，與不顯示該特征的患者相比，更有可能觀察到特定過(guò)程或結(jié)果。進(jìn)一步，所述檢測(cè)ERC1基因或ERC1蛋白的產(chǎn)品可以是檢測(cè)ERC1基因或ERC1蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。本發(fā)明還提供了一種診斷下咽癌的工具，所述工具能夠檢測(cè)ERC1基因或ERC1蛋白的表達(dá)水平。所述工具包括能夠結(jié)合ERC1基因的核酸或者能夠結(jié)合ERC1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測(cè)ERC1基因的表達(dá)水平；所述物質(zhì)能夠檢測(cè)ERC1蛋白的表達(dá)水平。進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。進(jìn)一步，所述診斷下咽癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷下咽癌的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知ERC1基因的異常與下咽癌相關(guān)也屬于ERC1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明還提供了一種預(yù)測(cè)下咽癌預(yù)后的工具，所述預(yù)測(cè)下咽癌預(yù)后工具包括能夠結(jié)合ERC1基因的核酸或者能夠結(jié)合ERC1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測(cè)ERC1基因的mRNA水平；所述物質(zhì)能夠檢測(cè)ERC1蛋白的表達(dá)水平。進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。進(jìn)一步，所述預(yù)測(cè)下咽癌預(yù)后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷下咽癌的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知ERC1基因的異常與下咽癌相關(guān)也屬于ERC1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗ERC1抗體或其片段所識(shí)別的氨基酸的數(shù)目沒(méi)有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合ERC1即可。本發(fā)明還提供了一種診斷下咽癌或預(yù)測(cè)下咽癌預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：(1)獲取受試者的樣品；(2)檢測(cè)受試者樣品中ERC1基因或蛋白的表達(dá)水平；(3)將測(cè)得的ERC1基因或蛋白的表達(dá)水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來(lái)。(4)與對(duì)照相比，ERC1基因或蛋白的表達(dá)水平降低，則該受試者被診斷為下咽癌，或該受試者被確定為預(yù)后不良。本發(fā)明還提供了一種下咽癌的治療方法，所述方法包括激活ERC1基因或ERC1蛋白。進(jìn)一步，所述方法包括促進(jìn)ERC1基因的表達(dá)，或促進(jìn)ERC1蛋白的表達(dá)或增強(qiáng)ERC1蛋白的活性。本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過(guò)在對(duì)癌細(xì)胞添加測(cè)試藥物后或在對(duì)腫瘤模型動(dòng)物施用測(cè)試藥物后的某個(gè)時(shí)期測(cè)量ERC1基因或者ERC1蛋白的表達(dá)水平來(lái)測(cè)定腫瘤藥物改善腫瘤預(yù)后的效果。更具體地說(shuō)，當(dāng)ERC1基因或者ERC1蛋白的表達(dá)水平在添加或施用測(cè)試藥物后升高時(shí)或者恢復(fù)正常水平時(shí)，可選擇該藥物作為改善腫瘤預(yù)后的治療藥物。本發(fā)明還提供了一種含有ERC1基因或ERC1蛋白的激活劑的藥物。本發(fā)明還提供了上述激活劑在制備治療下咽癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的ERC1基因或ERC1蛋白的激活劑不受限制，只要是可以促進(jìn)或者增強(qiáng)ERC1或涉及ERC1上游或下游途徑的物質(zhì)的表達(dá)或活性，且對(duì)于治療腫瘤有效的藥物即可。進(jìn)一步，所述激活劑包括ERC1基因、ERC1蛋白、促進(jìn)型miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物。所述激活劑還包括包含攜帶ERC1基因的載體或者宿主細(xì)胞。本發(fā)明的激活劑一方面可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的ERC1蛋白的缺失或不足，通過(guò)提高ERC1蛋白的表達(dá)，從而治療因ERC1蛋白缺乏導(dǎo)致的下咽癌。另一方面可以用于增強(qiáng)ERC1蛋白的活性，從而治療下咽癌。本發(fā)明的藥物可以作為醫(yī)藥單獨(dú)施用或與其它藥物一起施用。可以與本發(fā)明的藥物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發(fā)明的治療性或預(yù)防性藥物的效果即可，優(yōu)選的是，用于治療或預(yù)防腫瘤的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法侖、和雷莫司?。豢勾x物，諸如依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽(cytarabineocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奧替拉西鉀、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達(dá)拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物堿，諸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春地辛、和長(zhǎng)春堿；抗癌抗生素，諸如放線菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊達(dá)比星、表柔比星、凈司他丁stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、吡柔比星、博來(lái)霉素、培洛霉素、絲裂霉素C、和米托蒽醌；基于鉑的藥物，諸如奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、和奈達(dá)鉑；激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來(lái)曲唑；生物反應(yīng)修飾劑，諸如干擾素α、干擾素β、干擾素γ、白介素、烏苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向藥物，諸如伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲妥單抗、維A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、鼻、口頰、舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預(yù)防效果即可，包括但不限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，肺內(nèi)，口服，小泡內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下的，通過(guò)皮膚，通過(guò)胸膜，局部的，吸入，通過(guò)粘膜，皮膚，腸胃，關(guān)節(jié)內(nèi)，心室內(nèi)，直腸，陰道，顱骨內(nèi)，尿道內(nèi)，肝內(nèi)，瘤內(nèi)。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預(yù)防效果即可，可以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來(lái)恰當(dāng)?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的劑量可以使用例如對(duì)疾病的治療效果或者預(yù)防效果作為指標(biāo)來(lái)確定。在本發(fā)明的上下文中，“診斷下咽癌”既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有下咽癌、也包括判斷受試者是否存在患有下咽癌的風(fēng)險(xiǎn)。本文所用的“治療”涵蓋患有相關(guān)疾病或病癥的哺乳動(dòng)物例如人類中治療相關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：(1)預(yù)防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動(dòng)物中發(fā)生，尤其是當(dāng)該哺乳動(dòng)物易感于所述疾病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時(shí)；(2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生；或者(3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。術(shù)語(yǔ)“治療”通常涉及治療人類或動(dòng)物(例如，被獸醫(yī)所應(yīng)用)，其中可達(dá)到某些預(yù)期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止)、改善病癥和治愈病癥。還包括作為預(yù)防措施(例如預(yù)防)的治療。對(duì)還沒(méi)有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危險(xiǎn)的患者的用途，也包括在術(shù)語(yǔ)“治療”中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷下咽癌的分子標(biāo)志物，使用該分子標(biāo)志物可以在下咽癌發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。另外，通過(guò)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來(lái)為患者決定治療方案策略。本發(fā)明的包括ERC1基因或蛋白的激活劑的治療藥物可用作新的下咽癌的治療藥物。附圖說(shuō)明圖1顯示利用QPCR在mRNA水平上研究ERC1基因的差異表達(dá)；圖2顯示利用免疫印跡在蛋白水平上檢測(cè)ERC1基因的差異表達(dá)；圖3顯示利用QPCR在mRNA水平上檢測(cè)ERC1基因過(guò)表達(dá)的情況；圖4顯示利用免疫印跡在蛋白水平上檢測(cè)ERC1基因過(guò)表達(dá)的情況；圖5顯示ERC1基因過(guò)表達(dá)對(duì)下咽癌細(xì)胞增殖的影響。具體的實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1基因芯片篩選差異表達(dá)基因1、取材：8例行同期頸部淋巴結(jié)清掃的原發(fā)下咽癌患者手術(shù)切除癌組織，另取9例非下咽癌疾病患者的下咽正常粘膜組織作為對(duì)照。所有癌組織均術(shù)后病理證實(shí)為下咽癌。全部原發(fā)下咽癌患者術(shù)前均未行放、化療，全部病例臨床資料完整。2、組織RNA的獲取使用Trizol一步法提取組織總RNA。3、RNA純度及濃度的測(cè)定取RNA溶液1μl，儀器測(cè)定OD260、OD280，RNA濃度為OD260值×稀釋倍數(shù)×40/1000，計(jì)算OD260/OD280，比值在1.7-2.0代表RNA溶液純度高，含蛋白質(zhì)等雜質(zhì)少，-20℃保存。4、RNA完整性檢測(cè)(1)取2μlRNA樣品行1.5％瓊脂糖凝膠電泳(80v，15min)；(2)分出區(qū)帶后，genefinder染色，藍(lán)光下觀察電泳區(qū)帶；(3)當(dāng)28s/18s約2:1時(shí)，說(shuō)明RNA穩(wěn)定無(wú)降解。5、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序5.1RNA-seq讀段定位首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用TopHatv1.3.1將清潔片段與UCSCH.sapiens參考基因組(hg19)進(jìn)行匹配，H.sapiensUCSChg19版的預(yù)先構(gòu)建的索引從TopHat主頁(yè)下載，并作為參考基因組，利用TopHat與基因組匹配時(shí)，允許每個(gè)讀段(默認(rèn)到20)有多個(gè)匹配位點(diǎn)，最多2次錯(cuò)配。TopHat根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號(hào)建立可能的剪切位點(diǎn)庫(kù)，根據(jù)這些剪切位點(diǎn)庫(kù)將沒(méi)有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用的TopHat方法的系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。5.2轉(zhuǎn)錄豐度評(píng)估匹配上的讀段文件通過(guò)Cufflinksv1.0.3處理，Cufflinksv1.0.3將RNA-seq片段數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度。FPKM值指的是每一百萬(wàn)測(cè)序片段中匹配到特定基因1kb長(zhǎng)的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過(guò)貝葉斯推理方法計(jì)算FPKM估計(jì)值的置信區(qū)間。Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)下載(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。5.3差異表達(dá)基因的檢測(cè)將下載的EnsemblGTF文件和通過(guò)TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度，檢測(cè)差異表達(dá)。在Cuffidff輸出中只有q值＜0.01，測(cè)試顯示成功的比較才被認(rèn)為是差異表達(dá)。6、結(jié)果RNA-Sep結(jié)果顯示，下咽癌組織與正常對(duì)照組織之間共篩選出211個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)水平上調(diào)的基因54個(gè)，表達(dá)水平下調(diào)的基因157個(gè)。實(shí)施例2大樣本驗(yàn)證篩選出的差異表達(dá)基因基于前期高通量轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序的結(jié)果，根據(jù)Pvalue的大小，我們選擇ERC1基因進(jìn)行驗(yàn)證。1、樣本收集按照實(shí)施例1的方法收集下咽癌組織45例，正常對(duì)照組織50例。2、在mRNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證2.1提取組織RNA步驟同實(shí)施例1。2.2逆轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄使用Primescript1ststrandcDNAsynthesiskit試劑盒，操作步驟如下進(jìn)行：(1)在微量離心管中加入以下反應(yīng)液體，如表1所示：表1反應(yīng)液體試劑劑量RNA2.0μgdNTP1.0μlOligo(dT)2.0μlRnasefreedH2O加至10.0μl(2)70℃孵育5min，迅速冷卻至4℃；在微量離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)試劑，制成反應(yīng)體系：表2反應(yīng)體系的配制輕輕震蕩，快速離心后，42℃反應(yīng)1h，70℃10min終止反應(yīng)，4℃冷卻，-20℃保存。采用SYBPPremixExTapTMII試劑盒，在EppendorfReal-timePCR分析儀進(jìn)行，具體操作如下：(1)在冰上配制以下PCR反應(yīng)液：表3PCR反應(yīng)液的配制試劑劑量SYBR10.0μl正向引物1.0μl反向引物1.0μlcDNA2.0μlddH2O6.0μl總量20.0μl引物序列設(shè)計(jì)如下：ERC1基因：5’-CTTCTTCTCTGGCATCCT-3’(SEQIDNO.1)；5’-ACACTCCTCCTTCTTCTG-3’(SEQIDNO.2)β-actin：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQIDNO.3)；5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQIDNO.4)(2)上機(jī)，執(zhí)行下述程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s。59℃退火20s，72℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果釆用相對(duì)定量法，運(yùn)用公式2-△△ct計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。△ct＝ct(A)-ct(β-actin)△△ct＝△ct(實(shí)驗(yàn)組)-△ct(對(duì)照組)結(jié)果如圖1所示，與正常對(duì)照組織相比，下咽癌組織中ERC1基因的mRNA水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3、在蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)證按照RIPA蛋白裂解液試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組蛋白，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品中蛋白濃度。以常規(guī)Western-blot方法檢測(cè)ERC1蛋白變化，各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參，做ERC1蛋白條帶吸光度定量分析，表達(dá)量以ERC1蛋白/β-actin吸光度的比值代表。結(jié)果如圖2所示，與正常對(duì)照組織相比，下咽癌組織中ERC1蛋白水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例3ERC1基因過(guò)表達(dá)1、質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)ERC1基因的編碼序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物的設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。從成人胎腦的cDNA文庫(kù)(clontech公司，貨號(hào)：638831)中擴(kuò)增全長(zhǎng)的ERC1基因的編碼序列，上述cDNA序列插入到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1中，連接獲得的重組載體pcDNA3.1-ERC1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、下咽癌細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染2.1細(xì)胞培養(yǎng)下咽癌FADU細(xì)胞采用含有10％胎牛血清(FBS)、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃，5％CO2，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染(1)轉(zhuǎn)染前一天將0.5-2*105個(gè)腫瘤細(xì)胞懸浮于500μl不含抗生素的培養(yǎng)基，接種至24孔培養(yǎng)板。(2)轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)80％-90％，準(zhǔn)備以下復(fù)合物A：將1μg質(zhì)粒DNA稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻；復(fù)合物B：取4μlLipofectamine2000稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基中，混勻。(3)將復(fù)合物A和B混合，輕輕混勻，室溫孵育。(4)將100μl脂質(zhì)體復(fù)合體加入腫瘤細(xì)胞中，上下左右輕輕混勻，將細(xì)胞放入37℃含5％CO2培養(yǎng)箱孵育5-7小時(shí)。(5)加1ml含有2倍正常血清和抗生素濃度的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞18-24小時(shí)。3、利用QPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pcDNA3.1-ERC1的過(guò)表達(dá)情況3.1提取細(xì)胞總RNA利用常規(guī)方法進(jìn)行操作。3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實(shí)施例2。3.3QPCR步驟同實(shí)施例2。3.4結(jié)果結(jié)果如圖3所示，pcDNA3.1-ERC1能夠成功過(guò)表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3、Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pcDNA3.1-ERC1過(guò)表達(dá)情況步驟同實(shí)施例2。結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERC1的細(xì)胞中ERC1蛋白的含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例4ERC1基因的表達(dá)對(duì)下咽癌細(xì)胞增殖能力的測(cè)定1、步驟：將轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的下咽癌細(xì)胞FADU接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2*103個(gè)細(xì)胞/孔/200μl，細(xì)胞分組如下：實(shí)驗(yàn)組1(對(duì)照組)：下咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1；實(shí)驗(yàn)組2：下咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERC1。將細(xì)胞在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱再次孵育24小時(shí)后，根據(jù)BrdU細(xì)胞增殖試劑盒(ChemiconInternational)的說(shuō)明書(shū)，測(cè)量細(xì)胞增殖速率。2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、結(jié)果結(jié)果如圖5所示，相比于實(shí)驗(yàn)組1，實(shí)驗(yàn)組2的細(xì)胞增殖減緩，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ERC1表達(dá)可以抑制下咽癌細(xì)胞增殖。實(shí)施例5檢測(cè)ERC1基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響1、遷移實(shí)驗(yàn)步驟(1)將轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞密度為105/ml；(2)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入600μL進(jìn)口胎牛血清(FBS)，將Transwell小室置入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板小孔，Transwell小室內(nèi)加入各100μLRPMI1640培養(yǎng)基細(xì)胞懸液；(3)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孵育24h，將Transwell小室從24孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出，棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗Transwell小室膜部附著細(xì)胞；(4)取新24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，小孔內(nèi)加入甲醇/PBS混合液((1:1)600μL，將Transwell小室放入小孔，使甲醇/PBS混合液從下室(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板小孔)浸入上室，室溫靜置15min；(5)棄掉Transwell小室上室及24孔細(xì)胞培養(yǎng)板小孔內(nèi)甲醇/PBS混合液，下室加入600μL甲醇，將Transwell小室置入小孔，使甲醇從下室(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板小孔)浸入上室，室溫靜置15min；(6)棄掉甲醇，室溫下干燥15-30min；(7)取0.1％結(jié)晶紫染液600μL滴入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板小孔，將Transwell小室置入小孔染色15min；(8)棄掉0.1％結(jié)晶紫染液，蒸餾水沖洗Transwell小室15min，晾干，顯微鏡下觀察，取不同視野拍照計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2、結(jié)果轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERC1組每個(gè)視野下平均遷移細(xì)胞數(shù)目分別為(166.32±15.41)個(gè)和(76.57土9.13)個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ERC1基因表達(dá)抑制了下咽癌細(xì)胞的遷移。實(shí)施例6檢測(cè)ERC1基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響1、侵襲實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)前從-20℃冰箱取出MatrigelTM基質(zhì)膠，冰盒上融化，取MatrigelTM基質(zhì)膠與RPMI1640培養(yǎng)基按1:6比例混合，制成混合液加入Transwell小室上室，每孔45μL，將Transwell小室置入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)移至37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育30min，后續(xù)細(xì)胞接種及培養(yǎng)操作同上述細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)24h后，棄掉培基，用棉簽輕輕拭去Transwell小室上室內(nèi)MatrigelTM基質(zhì)膠，勿損傷小室底膜，余操作同細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2、結(jié)果轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERC1組每個(gè)視野下平均侵襲細(xì)胞數(shù)目分別為(55.24±5.74)個(gè)和(26.01土3.45)個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ERC1基因表達(dá)抑制了下咽癌細(xì)胞的侵襲。實(shí)施例7體外克隆形成能力的檢測(cè)1、步驟(1)將轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；(2)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入2ml10％FBS-RPMI1640培養(yǎng)基，按500個(gè)/孔細(xì)胞密度接種細(xì)胞懸液，輕輕混勻；(3)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板移至37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育10天，每3天更換培養(yǎng)基1次，每次2ml/孔；(4)培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)基，PBS緩沖液小心清洗3次，每次5min，室溫干燥，甲醇固定15min，棄掉甲醇，室溫空氣干燥20min；(5)取0.1％結(jié)晶紫染液加入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入1ml，染色15min；(6)回收0.1％結(jié)晶紫染液，細(xì)胞培養(yǎng)板蒸餾水清洗15min；(7)拍照觀察計(jì)數(shù)，重復(fù)試驗(yàn)3次。2、結(jié)果轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組平均集落形成數(shù)目分別為(174.41±15.63)個(gè)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERC1組細(xì)胞平均集落形成數(shù)目為(77.15土4.73)個(gè)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ERC1基因表達(dá)抑制了下咽癌細(xì)胞的成瘤能力。上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3