本發(fā)明涉及動物育種學(xué)、分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體涉及一種鑒定泰和烏骨雞特異性的分子標(biāo)記。

背景技術(shù)：

長期以來，主要是以常規(guī)形態(tài)學(xué)標(biāo)記分析手段進行動物品種分類和真?zhèn)舞b定。形態(tài)學(xué)標(biāo)記分析簡便、經(jīng)濟，但由于形態(tài)學(xué)特征常常受環(huán)境因素的影響，具有表型可塑性和遺傳可變性，容易導(dǎo)致不正確的分類與鑒定；并且形態(tài)學(xué)方法無法鑒定許多群體中普遍存在的隱存分類單元，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)將有利于品種鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定的局限性和不斷縮減的分類學(xué)家隊伍，使分類學(xué)的發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)。

本專利利用高通量測序手段對不同雞種進行測序，通過對不同雞種間的DNA序列進行篩查比對，發(fā)現(xiàn)在不同雞種間出現(xiàn)的特異性序列，并對這段序列設(shè)計引物進行PCR擴增和重測序驗證，以期通過分子生物學(xué)技術(shù)手段，找到一種分子標(biāo)記，可以對不同雞種進行更精確的分類。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)記對雞種進行鑒定的方法受環(huán)境因素影響較大，而且通過形態(tài)學(xué)進行的分類和鑒定出的結(jié)果容易出現(xiàn)錯誤的問題；本發(fā)明提供了一種鑒定泰和烏骨雞特異性的分子標(biāo)記，應(yīng)用分子標(biāo)記這種分子生物學(xué)手段可以根據(jù)不同雞種間的序列差異對雞種進行更精確的分類與鑒定。

本發(fā)明通過目標(biāo)區(qū)域捕獲測序篩查不同雞種的16號染色體，并利用MEGA軟件進行序列比對，根據(jù)比對結(jié)果利用Oligo等軟件設(shè)計引物，對不同雞種進行PCR擴增并進行測序驗證，根據(jù)分析結(jié)果可以得到鑒定泰和烏骨雞特異性的分子標(biāo)記。

本發(fā)明所述的鑒定泰和烏骨雞特異性的分子標(biāo)記，其序列如SEQ ID NO.4所示，共240bp。

所述分子標(biāo)記的引物序列如SEQ ID NO.2和3所示。其他雞種用引物序列如SEQ ID NO.2和3擴增，其擴增產(chǎn)物序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.4與SEQ ID NO.1相比，SEQ ID NO.4存在特異性的22個堿基的缺失(CATGCACTGAGGATGAGCTGCC)。

本發(fā)明還提供了一種鑒定泰和烏骨雞的方法，是利用上述引物，以待測樣本的DNA為模板進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的長度判定待鑒定樣本是否為泰和烏骨雞。進行測序驗證，如果擴增產(chǎn)物序列為240bp,即存在22bp的堿基缺失，則為泰和烏骨雞。其余雞種則無此特點。由于4％的瓊脂糖凝膠電泳，可以看出泰和烏骨雞的電泳條帶位于其它雞種條帶的下方，但由于分離效果不夠準(zhǔn)確，還需進行測序驗證。以測序結(jié)果中存在22bp的堿基缺失為判定標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)結(jié)果得到的這種分子標(biāo)記，為一段DNA序列。泰和烏骨雞與其他雞種在這段序列上存在特異性差異，根據(jù)這段序列差異，可以從不同雞種中鑒別出泰和烏骨雞。應(yīng)用此分子標(biāo)記鑒定雞種，操作相對簡單，特異性高而且重復(fù)性高，將為家禽品種資源的正確保存和合理利用增添新的科學(xué)依據(jù)。

附圖說明

圖1：是泰和烏骨雞與其他雞種序列示意圖。

圖2：泰和烏骨雞與其他雞種瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中條帶1，22為泰和烏骨雞，分子量240bp，條帶2-21分別為羅斯雞、黑狼山雞、斗雞、如皋黃雞、固始雞、藏雞、雪山草雞、紅色原雞、蕭山雞、隱性白羽肉雞、茶花雞、鹿苑雞、安卡雞、油雞、大骨雞、文昌雞、青腳麻雞、斗雞×羅斯雜交1代、太湖雞、溧陽雞；條帶23-28為綠殼蛋雞、AA雞、廣西黃雞、來航雞、仙居雞、白耳雞，分子量為262bp。

具體實施方式

實施例

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取羅斯雞、黑狼山雞、斗雞、如皋黃雞、固始雞、藏雞、泰和烏骨雞、雪山草雞、紅色原雞、蕭山雞、隱性白羽肉雞、茶花雞、鹿苑雞、安卡雞、油雞、大骨雞、文昌雞、青腳麻雞、斗雞×羅斯雜交1代、太湖雞、溧陽雞、綠殼蛋雞、AA雞、廣西黃雞、來航雞、仙居雞、白耳雞27種，其中仙居雞、茶花雞、鹿苑雞、白耳雞、藏雞、固始雞、大骨雞、河南斗雞、狼山雞、泰和烏骨雞、蕭山雞、北京油雞12個地方雞品種均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所國家地方禽種資源基因庫，紅色原雞亞種采自云南省野生動物救護中心。其余14個雞品種樣本來自揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳資源實驗室。

1.2 目標(biāo)捕獲測序

每個雞品種采集10個樣本，翅靜脈采血0.4mL，肝素鈉抗凝，加入裂解液后4℃保存?zhèn)溆?。利用苯酚抽提法提取DNA，送入華大基因公司(BGI)進行目標(biāo)捕獲測序，選取Gallus_gallus-4.0作為參考基因組。對目標(biāo)捕獲測序得出的初始數(shù)據(jù)，首先去除reads中的接頭污染，然后將reads中超過50％的低質(zhì)量堿基去除(quality value≤5(E))，確保分析數(shù)據(jù)的高質(zhì)量性。

1.3 序列比對

目標(biāo)捕獲測序得到不同雞種在16號染色體上的全序列，利用軟件MEGA5.1對不同雞種間進行序列比對，發(fā)現(xiàn)不同雞種在序列上的差異情況。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)序列比對結(jié)果，選取不同雞種間出現(xiàn)特異性差異的一段序列，此序列位于雞的16號染色體的TAP2基因上，基因登錄號為427728。具體序列SEQ ID NO.1，其中125-146的22bp為為泰和烏骨雞缺失的序列。

利用不同雞種DNA作為模板，利用Oligo6.0軟件設(shè)計引物進行PCR擴增，引物序列為：

1.5 PCR擴增和檢測

PCR擴增總體積為20μL：1μL DNA模板(100ng/μL)，2μL 10×PCR Buffer，1.5μL dNTP(10m mol/L)，上下游引物各1μL(10p mol/μL)，Taq酶為0.2μL(5U/μL)，ddH₂O 13.3μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，適宜退火溫度40s，72℃延伸40s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存?zhèn)溆?。把PCR產(chǎn)物送入上海生工生物工程股份有限公司進行測序并用4％濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電壓為100V，電泳40min。

2 結(jié)果

通過目標(biāo)捕獲測序，發(fā)現(xiàn)泰和烏骨雞與其他雞種存在差異的一段序列，設(shè)計引物PCR擴增并進行重測序驗證，泰和烏骨雞與其他雞種存在的特異性差異在于在這段序列上泰和烏骨雞存在特異性的22bp缺失(CATGCACTGAGGATGAGCTGCC)，其他雞種無此特點(見附圖1)。通過瓊脂糖凝膠電泳也可清晰鑒別(見附圖2)。因此，這段序列可以作為一種鑒定泰和烏骨雞特異性的分子標(biāo)記。應(yīng)用此分子標(biāo)記鑒定雞種，操作相對簡單，特異性高而且重復(fù)性高，將為家禽品種資源的保存和合理利用增添新的科學(xué)依據(jù)。