本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中，辣椒分子標(biāo)記及其多態(tài)性在鑒定辣椒花粉育性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

辣椒(capsicumannuuml.)屬于常異花授粉植物，具有明顯的雜種優(yōu)勢。雜交辣椒品種已大量應(yīng)用于生產(chǎn)。利用辣椒雄性不育性培育一代雜種，可以降低生產(chǎn)成本，顯著提高一代雜種的種子純度。根據(jù)調(diào)控機(jī)理的不同，辣椒雄性不育主要分為細(xì)胞核雄性不育型(genicmalesterility,gms)、細(xì)胞質(zhì)雄性不育型(cytoplasmicmalesterility,cms)，其中細(xì)胞核雄性不育僅由核基因控制，而細(xì)胞質(zhì)雄性不育是由細(xì)胞核基因與細(xì)胞質(zhì)基因共同調(diào)控，相比于gms，cms可獲得100％的不育株，可以通過三系配套實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢育種，擁有廣泛的應(yīng)用前景。辣椒雄性不育的利用是迄今為止降低辣椒制種成本的最有效途徑之一。

辣椒cms是由線粒體中的不育基因?qū)е碌牟荒墚a(chǎn)生正常功能花粉的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可以被細(xì)胞核中的恢復(fù)基因(restorer-of-fertility,rf)抑制或消除。利用辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育實(shí)現(xiàn)三系配套育種的關(guān)鍵之一就是找到具有恢復(fù)基因rf的恢復(fù)系材料。為此，國內(nèi)外學(xué)者在rf基因的定位及連鎖標(biāo)記開發(fā)方面做了大量研究。在rf基因的定位方面，目前普遍將其作為單基因控制的質(zhì)量性狀來研究，目前已普遍認(rèn)為，rf基因位于辣椒的第6號染色體上。在連鎖標(biāo)記開發(fā)方面，國內(nèi)外學(xué)者開發(fā)了許多與rf基因連鎖的分子標(biāo)記，但在緊密連鎖程度及適用性上還有待提高。

分子標(biāo)記輔助育種作為當(dāng)前育種工作的重要輔助手段，其關(guān)鍵就是開發(fā)出高效的分子標(biāo)記。與目標(biāo)性狀緊密連鎖并且穩(wěn)定、檢測方便快捷的分子標(biāo)記直接對基因型進(jìn)行選擇,極大的提高育種中選擇的準(zhǔn)確性和效率，顯著縮短育種周期。因此，開發(fā)高效的分子標(biāo)記對于品種改良及新品種選育具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何鑒定辣椒花粉育性。

本發(fā)明首先提供了辣椒分子標(biāo)記或其多態(tài)性在鑒定或輔助鑒定辣椒花粉育性中的應(yīng)用；

所述辣椒分子標(biāo)記為以辣椒基因組dna為模板，采用引物對pw6-126進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到的dna分子；

所述引物對pw6-126由名稱分別為pw6-126f和pw6-126r的單鏈dna組成，所述pw6-126f為辣椒基因組dna中與序列表中序列3的第85位的上游特異結(jié)合的單鏈dna，所述pw6-126r為辣椒基因組dna中與序列表中序列3的第108位的下游特異結(jié)合的單鏈dna。

所述pw6-126f具體可為序列表中序列1所示的單鏈dna，所述pw6-126r具體可為序列表中序列2所示的單鏈dna。

本發(fā)明還提供了鑒定辣椒基因型的方法，所述基因型為rfrf基因型、rfrf基因型和rfrf基因型；所述方法為下述o或p：

o、包括：檢測待測辣椒基因組中對應(yīng)于序列表中序列3的第85-108位的序列，如所述待測辣椒基因組中兩條染色體均為下述g1)的染色體，所述待測辣椒為rfrf基因型辣椒；如所述待測辣椒基因組中兩條染色體均為下述g2)的染色體，所述待測辣椒為rfrf基因型辣椒；如所述待測辣椒基因組中兩條染色體一條為下述g1)的染色體、另一條為下述g2)的染色體，所述待測辣椒為rfrf基因型辣椒；

g1)對應(yīng)于序列3的第85-108位為序列3的第85-108位；

g2)對應(yīng)于序列3的第85-108位為序列4的第85-114位；

p、包括如下p1)和p2)：

p1)以待測辣椒基因組dna為模板，利用所述引物對pw6-126進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到pcr產(chǎn)物；

p2)p2a)或p2b)：

p2a)檢測步驟p1)得到的pcr產(chǎn)物的序列，如果所述pcr產(chǎn)物的序列為序列4，所述待測辣椒為rfrf基因型辣椒；如果所述pcr產(chǎn)物的序列為序列3和序列4，所述待測辣椒為rfrf基因型辣椒；如果所述pcr產(chǎn)物的序列為序列3，所述待測辣椒為rfrf基因型辣椒；

p2b)檢測步驟p1)得到的pcr產(chǎn)物的大小，如果所述pcr產(chǎn)物含有153bp的dna片段且不含有147bp的dna片段，所述待測辣椒為rfrf基因型辣椒；如果所述pcr產(chǎn)物含有153bp和147bp的dna片段，所述待測辣椒為rfrf基因型辣椒；如果所述pcr產(chǎn)物含有147bp的dna片段且不含有153bp的dna片段，所述待測辣椒為rfrf基因型辣椒。

上述方法中，利用所述引物對pw6-126進(jìn)行pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系中所述pw6-126f和所述pw6-126r的濃度均可為0.1μm。所述反應(yīng)體系具體可含有待測辣椒基因組dna、含有datp、dttp、dctp和dgtp的dntps混合物、pcr反應(yīng)緩沖液、dna聚合酶、所述pw6-126f、所述pw6-126r和水。所述dna聚合酶和所述pcr反應(yīng)緩沖液(10×buffer緩沖液)均可為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

所述pcr擴(kuò)增的退火溫度可為52℃。所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件具體可為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

本發(fā)明還提供了鑒定辣椒花粉育性的方法，所述方法包括包括下述m1或m2：

m1、利用所述鑒定辣椒基因型的方法鑒定待測辣椒的基因型，rfrf基因型待測辣椒的花粉可育或候選可育，rfrf基因型待測辣椒的花粉可育或候選可育，rfrf基因型待測辣椒的花粉不育或候選不育；

m2、利用所述鑒定辣椒基因型的方法鑒定待測辣椒的基因型，rfrf基因型待測辣椒可育花粉比例大于或候選大于rfrf基因型待測辣椒；rfrf基因型待測辣椒可育花粉比例大于或候選大于rfrf基因型待測辣椒。

本發(fā)明還提供了所述辣椒分子標(biāo)記。

本發(fā)明還提供了所述引物對pw6-126。

本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定花粉育性的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)含有所述引物對pw6-126。

所述系統(tǒng)可僅由所述引物對pw6-126組成，也可由所述引物對pw6-126與進(jìn)行pcr擴(kuò)增所需的試劑和/或儀器組成。

上述系統(tǒng)中，所述進(jìn)行pcr擴(kuò)增所需的試劑可為含有datp、dttp、dctp和dgtp的dntps混合物、dna聚合酶和/或pcr反應(yīng)緩沖液；所述進(jìn)行pcr擴(kuò)增所需的儀器可為pcr儀。所述dna聚合酶和所述pcr反應(yīng)緩沖液(10×buffer緩沖液)均可為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

上述系統(tǒng)中的各試劑均可獨(dú)立包裝。

上述系統(tǒng)也可為僅含有試劑的試劑盒。

本發(fā)明還提供了所述引物對pw6-126的下述任一應(yīng)用：

x1、在鑒定或輔助鑒定辣椒花粉育性中的應(yīng)用；

x2、在制備鑒定或輔助鑒定辣椒花粉育性產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述鑒定辣椒基因型的方法在鑒定或輔助鑒定辣椒花粉育性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了辣椒育種方法，所述方法包括：按照所述鑒定辣椒基因型的方法檢測辣椒的基因型，選擇rfrf或rfrf基因型的辣椒作為親本進(jìn)行育種。

本發(fā)明中，所述引物對pw6-126中的兩條單鏈dna的摩爾比可為1:1。

本發(fā)明中，在檢測pcr產(chǎn)物的大小時(shí)，可通過電泳與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，也可通過測序進(jìn)行檢測。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明中的辣椒分子標(biāo)記與辣椒花粉育性相關(guān)：含有序列3不含有序列4的dna片段的rfrf基因型辣椒花粉可育，含有序列3和序列4的dna片段的rfrf基因型辣椒花粉可育，含有序列4不含有序列3的dna片段的rfrf基因型辣椒花粉不育。利用本發(fā)明的辣椒分子標(biāo)記檢測花粉育新的準(zhǔn)確性可達(dá)91.11％，表明，本發(fā)明的辣椒分子標(biāo)記適用性較強(qiáng)，在育種實(shí)際應(yīng)用中可以利用該標(biāo)記對辣椒花粉育性進(jìn)行快速鑒定。

附圖說明

圖1為上海圓b/426、上海圓c/427和f1的pcr產(chǎn)物的電泳結(jié)果。其中，a為上海圓b/426，c為上海圓c/427。

圖2為45份辣椒的pcr產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的甜椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系上海圓b/426和恢復(fù)系上海圓c/427(米志波等，辣椒恢復(fù)基因連鎖標(biāo)記的適用性評價(jià)與應(yīng)用，中國蔬菜，2015(2)：25-29)公眾可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

實(shí)施例1、利用辣椒分子標(biāo)記鑒定辣椒花粉育性

1、辣椒分子標(biāo)記

本實(shí)施例提供的辣椒分子標(biāo)記為以辣椒的基因組dna為模板、采用引物對pw6-126進(jìn)行擴(kuò)增得到的dna分子。本發(fā)明的申請人發(fā)現(xiàn)該辣椒分子標(biāo)記有兩種序列：序列3和序列4。

其中，pw6-126由名稱為pw6-126f和pw6-126r的單鏈dna組成，brch_f為序列表中序列1所示的單鏈dna，pw6-126r為序列表中序列2所示的單鏈dna。

將引物對pw6-126的pcr產(chǎn)物含有序列4所示的dna片段且不含有序列3所示的dna片段的辣椒的基因型記為rfrf基因型，將pcr產(chǎn)物含有序列3所示的dna片段且不含有序列4所示的dna片段的辣椒的基因型記為rfrf基因型，將pcr產(chǎn)物含有序列3和序列4所示的dna片段的辣椒的基因型記為rfrf基因型。

2、辣椒分子標(biāo)記與辣椒花粉育性

利用甜椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系上海圓b/426及其恢復(fù)系上海圓c/427為試驗(yàn)材料，進(jìn)行雜交，得到f1，f1自交構(gòu)建f2群體。其中上海圓b/426與上海圓c/427為近等基因系。獲得包含500個(gè)單株的f2群體，鑒定各個(gè)f2單株以及親本上海圓b/426、上海圓c/427和f1的基因型，并單株統(tǒng)計(jì)花粉育性?；蛐丸b定方法如下：

提取各單株的基因組dna，利用引物對pw6-126進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系(20μl)為：基因組dna2μl、10×buffer緩沖液2μl、dntps0.8μl、dna聚合酶0.4μl、pw6-126f和pw6-126r(10μm各0.2μl，用14.4μlddh2o將總體積補(bǔ)齊至20μl。其中，10×buffer緩沖液和dna聚合酶均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用7％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色后觀察照相。并對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。部分植株電泳結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，所有植株的pcr產(chǎn)物在140-160bp間共有三種類型，第一種類型為含有序列4所示的dna片段且不含有序列3所示的dna片段(即含有153bp的dna片段不含有147bp的dna片段)，第二種類型為含有序列3和序列4的所示的dna片段(即含有153bp和147bp的dna片段)，第三種類型為含有序列3所示的dna片段且不含有序列4所示的dna片段(即含有147bp的dna片段不含有153bp的dna片段)。pcr產(chǎn)物為第一種類型的植株即為步驟1的rfrf基因型植株，pcr產(chǎn)物為第二種類型的植株即為步驟1的rfrf基因型植株，pcr產(chǎn)物為第三種類型的植株即為步驟1的rfrf基因型植株。

花粉育性統(tǒng)計(jì)方法如下：

在盛花期對每個(gè)單株的育性進(jìn)行調(diào)查，為避免對表型的錯(cuò)判，每株均進(jìn)行3次以上的育性調(diào)查(可育植株花未開裂的雄蕊十分飽滿，盛開后花藥開裂充分；而不育植株花的雄蕊干癟，盛開后也沒有花粉或花粉量極少)，同時(shí)結(jié)合植株的坐果情況進(jìn)一步佐證其育性(不育植株表現(xiàn)為不結(jié)實(shí)或單性結(jié)實(shí)，與可育植株的果實(shí)相比，單性結(jié)實(shí)的果實(shí)顯著小于正常果實(shí)，并存在畸形，而且內(nèi)無種子)。

結(jié)果顯示，上海圓b/426花粉不育，其基因型為rfrf基因型；上海圓c/427花粉可育，其基因型為rfrf基因型；子代(即f1代)花粉可育，基因型為rfrf基因型；f2群體中rfrf基因型植株花粉均可育，rfrf基因型植株花粉也均可育，rfrf基因型植株花粉均不育。表明，本實(shí)施例的辣椒分子標(biāo)記與辣椒的花粉育性相關(guān)。

實(shí)施例2、利用實(shí)施例1的辣椒分子標(biāo)記鑒定辣椒花粉育性

1、試驗(yàn)材料

45份辣椒自交系和品種(表1)。

2、試驗(yàn)方法

采用實(shí)施例1中的花粉育性統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)45份辣椒自交系和品種的花粉育性，其結(jié)果見表1。

利用實(shí)施例1的辣椒分子標(biāo)記鑒定各辣椒自交系和品種的花粉育性：

提取各辣椒自交系和品種的基因組dna，利用引物對pw6-126進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系和pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序同實(shí)施例1，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用7％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(圖2)，硝酸銀染色后觀察照相。圖2中，泳道1-45分別為表1的編號為1-45的辣椒。根據(jù)pcr產(chǎn)物的大小確定各辣椒自交系和品種的基因型：含有153bp的dna片段不含有147bp的dna片段的植株的基因型為rfrf基因型，含有153bp和147bp的dna片段的dna片段的植株的基因型為rfrf基因型，含有147bp的dna片段不含有153bp的dna片段的dna片段的dna片段的植株的基因型為rfrf基因型。根據(jù)實(shí)施例1中基因型與辣椒育新的對應(yīng)關(guān)系確定各辣椒的花粉育性，結(jié)果如表1所示。

表1、45份辣椒花粉育性的鑒定

結(jié)果顯示，利用本發(fā)明的辣椒分子標(biāo)記鑒定45份辣椒自交系和品種的花粉育性中，有4份辣椒的花粉與其實(shí)際育性不一致，正確率為91.11％，表明，實(shí)施例1的辣椒分子標(biāo)記適用性較強(qiáng)，在育種實(shí)際應(yīng)用中可以利用該標(biāo)記對辣椒花粉育性進(jìn)行快速鑒定。

<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>辣椒分子標(biāo)記及其多態(tài)性在鑒定辣椒花粉育性中的應(yīng)用

<160>4

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<213>辣椒

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