本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種半邊蓮與通泉草的分子鑒別引物及方法。

背景技術(shù)：

半邊蓮(lobeliachinensislour.)為桔梗科多年生小草本植物，全草入藥，是常用中藥之一?！侗静菥V目》載：“生陰濕塍塹邊，就地細(xì)梗引蔓，節(jié)節(jié)而生細(xì)葉，秋開小花，淡紅紫色，止有半邊，如蓮花狀?！惫史Q為“半邊蓮”，分布較廣，主產(chǎn)于福建、江蘇、浙江、安徽、江西、廣東與廣西等省。具有清熱解毒，利水消腫等功效，主治毒蛇咬傷，燒傷，扁桃體炎，闌尾炎，癰腫療瘡，肝硬化腹水及多種癌癥等，全草含有生物堿類，黃酮類與多炔類等成分，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有鎮(zhèn)痛消炎、抗腫瘤、抑制α-葡萄糖苷酶、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞與抗心肌缺血再灌注等方面作用，已被廣泛應(yīng)用于各種臨床實(shí)踐中，且取得了良好的治療效果。

玄參科植物通泉草（mazuspumilus）同為矮生草本，生態(tài)位寬度較大，在中國分布廣泛，適應(yīng)性強(qiáng)，資源較豐富，由于與半邊蓮生長環(huán)境相似，且兩者全草有具有相似的形態(tài)特征等原因，市場上有以通泉草的干燥全草冒充半邊蓮的現(xiàn)象。偽品通泉草與半邊蓮的主治功效不一樣，不能代替半邊蓮藥用，藥材在市場流通時需要準(zhǔn)確相互辨別。目前，對半邊蓮的鑒定主要通過性狀鑒別、顯微鑒別與理化鑒別等傳統(tǒng)生藥鑒定方法，而傳統(tǒng)生藥鑒定方法比較依賴個人經(jīng)驗(yàn)，不利于推廣。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，dna條形碼(dnabarcoding)鑒別技術(shù)因不受被檢測對象形態(tài)特征的影響，通用性強(qiáng)，重復(fù)性和穩(wěn)定性高，有統(tǒng)一易于掌握的操作標(biāo)準(zhǔn)和流程，方便于推廣等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為中藥鑒定有效工具。

長期以來，植物dna條形碼多選用葉綠體上的dna序列片段，其中，rbcl在光合作用及光呼吸中起關(guān)鍵性作用，受其功能的限制，rbcl進(jìn)化速度較慢，主要存在種以上水平的遺傳變異，在物種水平遺傳變異較小，rbcl序列片段全長約1300bp，具有引物通用性強(qiáng)、易擴(kuò)增、易比對等特點(diǎn)，在pcr分子鑒定中可以提供長度差異較明顯的擴(kuò)增片段進(jìn)行辨別，因?yàn)槲锓N鑒別方便，實(shí)際研究中常選取其作為分子鑒定的dna條形碼。本研究擬對來源于不同居群的半邊蓮與通泉草的rbcl序列進(jìn)行聚類分析，并利用其rbcl區(qū)的snp位點(diǎn)，基于這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，利用該特異引物分別建立特異擴(kuò)增半邊蓮與通泉草的pcr體系，并在pcr產(chǎn)物中加入sybrgreeni染料對真?zhèn)谓Y(jié)果進(jìn)行快速檢測。結(jié)合dna快速提取技術(shù)，可大大提高檢測效率，從而建立2種藥材便捷的鑒定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種半邊蓮與通泉草的分子鑒別引物及方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種半邊蓮與通泉草的分子鑒別引物，所述引物序列為：半邊蓮的鑒別引物lcf：atgtcaccacaaacagaractaaagc；通泉草的鑒別引物mpf：gcgaagaaatgatgaaaagaggtat；共同反向引物lmr：catttccccacggatgtcctaa。

一種半邊蓮與通泉草的分子鑒別方法，反應(yīng)體系為：總體積20μl，其中包括taq酶1u，10×buffer緩沖液2.0μl，所述的引物各0.2μm，dntp20nm，ddh2o補(bǔ)足20μl；pcr反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4min后，94℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，35個循環(huán)后72℃延伸8min；pcr產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，以goldview染色觀察。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明方法的關(guān)鍵在于特異鑒別引物的設(shè)計(jì)，其難易程度在于可用于鑒別的snp位點(diǎn)的多寡，應(yīng)用連續(xù)2-3個snp位點(diǎn)用于特異鑒別，可提高特異鑒別pcr的穩(wěn)定性與重復(fù)性。另外，由于特定樣品中葉綠體dna比核dna具有更多的拷貝數(shù)，基于核dna的分子鑒別方法比較容易受到dna降解的影響，應(yīng)用來源于葉綠體dna的條形碼進(jìn)行分子鑒別更適于干燥的中藥材的分子鑒別。經(jīng)典pcr檢測方法，需經(jīng)制膠，凝膠，電泳與成像等多個步驟才能完成檢測，比較繁瑣，本發(fā)明可對樣品的陽性與陰性檢測進(jìn)行快速識別，大大提高了檢測速度，為本發(fā)明借鑒該方法建立了快速簡便的檢測體系。

附圖說明

圖1基于nj法構(gòu)建rbcl序列的半邊蓮與通泉草的系統(tǒng)聚類樹。

圖2半邊蓮與通泉草鑒別方法示意圖。

圖3特異性pcr鑒別半邊蓮與通泉草凝膠電泳與熒光檢測圖（電泳圖上方為熒光檢測圖），(m:dl2000dnamaker;1-9:來源不同產(chǎn)地的半邊蓮樣品，10-16：不同產(chǎn)地的通泉草樣品)。

圖4特異性pcr鑒別通泉草與半邊蓮凝膠電泳與熒光檢測圖（電泳圖上方為熒光檢測圖）(m:dl2000dnamaker;1-7:來源不同產(chǎn)地的通泉草樣品，8-16：不同產(chǎn)地的半邊蓮樣品)。

具體實(shí)施方式

1儀器與材料

pcr儀（eppendorf，型號5332），低溫冷凍離心機(jī)（eppendorf，型號5810r）,微量移液器（eppendorf）,電泳系統(tǒng)（北京市六一儀器廠，型號dyy—12），凝膠成像分析儀（bio-radchemidocxrs），手持式紫外燈。

ctab提取液，tae緩沖液，瓊脂糖（promega公司），goldview(北京索萊寶科技有限公司)，dnataq聚合酶（takara公司），1000*sybrgreeni染料(invitrogen公司)，三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇均為國產(chǎn)分析純。

本實(shí)驗(yàn)樣品是由福建中醫(yī)藥大學(xué)鑒定并收集，采自不同產(chǎn)地的半邊蓮(lobeliachinensislour.)9份，通泉草（mazuspumilus）7份。

表1實(shí)驗(yàn)材料概況

2方法

2.1樣品基因組dna的提取

采取ctab法提取干燥樣品的基因組dna，所提dna稀釋后做為pcr模版用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

2.2擴(kuò)增受試樣品的rbcl序列

利用通用引物rbclf與rbclr擴(kuò)增rbcl序列：總體積20μl，其中包括taq酶1u，10×buffer緩沖液2.0μl，引物各0.2μm，dntp20nm，ddh2o補(bǔ)足20μl。pcr反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性4min后，94℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，35個循環(huán)后72℃延伸8min。pcr產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，以goldview染色觀察。

2.3聚類分析

對16個受試樣品的rbcl序列進(jìn)行測序，獲得16條rbcl序列，用clustalx2.1軟件進(jìn)行多重序列比對，利用mega5.0進(jìn)行鄰接（nj）系統(tǒng)聚類樹分析。

2.4引物設(shè)計(jì)

用clustalx2.1軟件對所有序列進(jìn)行多重序列比對，分析半邊蓮與通泉草的2組樣品之間的snp位點(diǎn)，篩選2組樣品之間的鑒別位點(diǎn)，根據(jù)特異引物的設(shè)計(jì)原則，利用鑒別位點(diǎn)設(shè)計(jì)半邊蓮與通泉草的相互鑒別的特異引物。

2.5特異性pcr鑒別受試半邊蓮與通泉草樣品

利用所設(shè)計(jì)的可鑒別半邊蓮與通泉草的特異性引物lcf、mpf分別與共用反向引物lmr構(gòu)建一個pcr體系，反應(yīng)體系同上，通過退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)(50，50.5，51.6，53.2，55.1，56.7，57.6，58℃)考察不同退火溫度對該pcr擴(kuò)增體系擴(kuò)增效果的影響。為了建立簡便的快速鑒別方法，在20μlpcr產(chǎn)物中加入2μlsybrgreeni染料于365nm紫外波長下檢測熒光。

3結(jié)果分析

3.1聚類分析

經(jīng)測序，獲得半邊蓮與通泉草所有受試樣品的rbcl序列，用clustalx2.1軟件對所有序列進(jìn)行多重序列比對，進(jìn)一步應(yīng)用meg5.0軟件構(gòu)建nj系統(tǒng)聚類樹分析所有受試樣品rbcl序列，分析其相互進(jìn)化關(guān)系，見圖1。nj系統(tǒng)聚類樹結(jié)果顯示9個不同來源的半邊蓮樣品單獨(dú)聚為一類，與7個不同來源的通泉草樣品沒有交叉，表明rbcl序列適用于半邊蓮與通泉草之間的相互鑒別，可應(yīng)用rbcl序列建立半邊蓮與通泉草的分子鑒別方法。

3.2引物設(shè)計(jì)

用clustalx2.1軟件對所有受試樣品rbcl序列進(jìn)行多重序列比對，篩選獲得半邊蓮與通泉草的snp位點(diǎn)，篩選二者之間的特異鑒別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)半邊蓮的鑒別引物lcf，通泉草的鑒別引物mpf，這2條特異引物可與共同反向引物lmr分別構(gòu)建特異pcr，所構(gòu)建的pcr鑒別體系中，半邊蓮樣品則可產(chǎn)生969bp的pcr擴(kuò)增片段，而通泉草樣品則可產(chǎn)生501bp的pcr擴(kuò)增片段。根據(jù)pcr擴(kuò)增片段的大小則可進(jìn)行樣品的鑒別，引物設(shè)計(jì)位置及引物序列見圖2及表2。

表2本發(fā)明所用引物

3.3特異性pcr快速鑒別受試半邊蓮與通泉草樣品

利用半邊蓮與通泉草的特異性鑒別引物lcf、mpf分別與共同的反向引物lmr構(gòu)建pcr反應(yīng)體系，通過設(shè)計(jì)退火溫度梯度，分析不同退火溫度的pcr擴(kuò)增效果，結(jié)果顯示，此反應(yīng)體系在退火溫度51.6～58℃條件下均能擴(kuò)增出半邊蓮969bp的特征鑒別條帶，通泉草601bp的特征鑒別條帶。

以退火53℃，應(yīng)用以上建立的pcr反應(yīng)體系，分別對受試所有半邊蓮與通泉草樣品進(jìn)行檢測，受試9個半邊蓮樣品，7個通泉草樣品均能檢測到相應(yīng)的陽性特征條帶（見圖3-圖4），而相對應(yīng)的陰性樣品則擴(kuò)增不到條帶。表明該pcr體系具有特異性，可以用于鑒別半邊蓮與通泉草樣品。

為了建立更加快捷簡便的檢測方法，添加2μlsybrgreeni染料于20μlpcr產(chǎn)物中，然后于365nm紫外波長下檢測熒光，所建立的pcr鑒別體系所檢測的陽性樣品均可見熒光，而陰性樣品均無熒光（見圖3-圖4，電泳圖上方為熒光檢測圖）。表明該方法可用于對受試樣品的快捷鑒別。

4小結(jié)

dna條形碼技術(shù)通過比較一段通用dna片段，對物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的識別和鑒定，是近年來生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)。在中藥鑒定領(lǐng)域，dna分子標(biāo)記可以彌補(bǔ)和克服傳統(tǒng)鑒定方法的一些問題與缺點(diǎn)，為中藥鑒定提供了一個強(qiáng)大的工具，應(yīng)用該方法鑒定中藥原植物及其藥材和飲片，取得了快速發(fā)展，大大加快了中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程?；跅l形碼snp位點(diǎn)的特異性pcr方法對中藥基源進(jìn)行鑒定為解決藥材的識別提供了快速有效的分子手段，有利于解決日益擴(kuò)大的中藥材國內(nèi)與國際貿(mào)易中需要準(zhǔn)確快速鑒定藥用植物及其混偽品的問題。

該方法的關(guān)鍵在于特異鑒別引物的設(shè)計(jì)，其難易程度在于可用于鑒別的snp位點(diǎn)的多寡，應(yīng)用連續(xù)2-3個snp位點(diǎn)用于特異鑒別，可提高特異鑒別pcr的穩(wěn)定性與重復(fù)性。另外，由于特定樣品中葉綠體dna比核dna具有更多的拷貝數(shù)，基于核dna的分子鑒別方法比較容易受到dna降解的影響，應(yīng)用來源于葉綠體dna的條形碼進(jìn)行分子鑒別更適于干燥的中藥材的分子鑒別。經(jīng)典pcr檢測方法，需經(jīng)制膠，凝膠，電泳與成像等多個步驟才能完成檢測，比較繁瑣，本發(fā)明方法對樣品的陽性與陰性檢測進(jìn)行快速識別，大大提高了檢測速度，為本研究借鑒該方法建立了快速簡便的檢測體系。本發(fā)明顯示特異性pcr方法檢測靈敏高，20μlpcr體系中20ng模板dna即可檢測到陽性條帶，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，可用于半邊蓮與通泉草植物及其藥材的簡便鑒別，也將為今后有關(guān)半邊蓮與通泉草的相互鑒別提供思路。由于二者的兩者功效和主治均不相同，本技術(shù)也為防止藥材的混用誤用提供依據(jù)，具有實(shí)際應(yīng)用價值。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建農(nóng)林大學(xué)

<120>一種半邊蓮與通泉草的分子鑒別引物及方法

<130>5

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgtcaccacaaacagaractaaagc26

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

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gcgaagaaatgatgaaaagaggtat25

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<212>dna

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

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