本發(fā)明涉及一種鑒別國家級茶樹良種‘迎霜’camelliasinensiscv.‘yingshuang’的分子特異性標記引物，以及利用該特異性標記引物對‘迎霜’進行快速鑒別的方法。

背景技術(shù)：

‘迎霜’camelliasinensiscv.‘yingshuang’是由杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院茶葉研究所選育而成的茶樹品種，具有芽葉生育力強、持嫩性強、產(chǎn)量高、扦插繁殖力強、品質(zhì)好等優(yōu)點。1980年通過浙江省級鑒定，1987年被全國農(nóng)作物品種審定委員會認定為國家級茶樹良種，編號為gs13041-1987。該品種適于制作紅茶、綠茶，其茶品質(zhì)優(yōu)、香高、味濃鮮。浙江省農(nóng)業(yè)廳將‘迎霜’茶樹品種列為浙江省種植業(yè)主導品種之一。全國大部分產(chǎn)茶區(qū)有引種。目前，浙江、江蘇、江西、安徽、河南、湖南、湖北及廣西等省區(qū)有較大面積栽培。

‘迎霜’芽葉呈綠色，其形態(tài)學特征與其他芽葉為綠色的茶樹品種非常相似(見附圖1)。因此，利用傳統(tǒng)形態(tài)學鑒別方法很難將它們區(qū)分開，特別是在種苗交易過程中，茶農(nóng)常常因為難以辨認而買到假冒偽劣種苗，導致經(jīng)濟損失嚴重。這也為該茶樹良種的保護和利用帶來了一定的困難。

dna分子標記技術(shù)可以通過基因序列差異比較分析為植物鑒別、系統(tǒng)分類提供直接的證據(jù)。作為我國的熱點經(jīng)濟作物，目前，常規(guī)分子標記技術(shù)在茶樹品種的遺傳多樣性研究方面有了較多的應(yīng)用。例如：rapd(陳志丹等，閩南烏龍茶茶樹種質(zhì)資源rapd指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析，分子植物育種，2012，10(6)：731-739)、ssr(張明澤，黔南60份茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性的ssr分析，西北植物學報，2016，36(6)：1117-1124)、scot(陳熙等，scot標記分析陜西茶樹資源的遺傳多樣性，茶葉科學，2016，36(2)：131-138)、issr及srap(利用srap和issr標記分析廣東茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性，核農(nóng)學報2010，24(5)：948-955)。這些研究為茶樹品種的遺傳多樣性評價和保護奠定了重要基礎(chǔ)。然而，常規(guī)的分子標記技術(shù)大多采用通用隨機引物進行pcr擴增，其pcr產(chǎn)物指紋圖譜比較復(fù)雜、重復(fù)性較差。因此，這些方法在植物種質(zhì)特別是品種鑒定中的應(yīng)用性不強。特異性分子標記技術(shù)的引物具有很好的穩(wěn)定性和專一性，能夠進行特異性擴增，因此該技術(shù)在植物種質(zhì)鑒定中具有很好的應(yīng)用前景。目前尚未有特異性分子標記技術(shù)應(yīng)用茶樹品種‘迎霜’鑒別的研究報道。本專利通過開發(fā)一種迎霜的分子特異性標記引物，并建立其鑒別方法，為實現(xiàn)該名優(yōu)茶樹品種的真?zhèn)舞b別及保護提供技術(shù)支持。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供用于鑒別‘迎霜’camelliasinensiscv.‘yingshuang’的分子特異性標記引物，該引物序列如下：

上游引物s4ysf：5’-tgagctgagtgagttgaa-3’,如seqidno.1所示；

下游引物s4ysr：5’-gtcggtactgactatgaa-3’,如seqidno.2所示。

該特異性標記引物組合是采用常規(guī)pcr技術(shù)，經(jīng)過大量dna指紋圖譜比較分析，篩選獲得迎霜特異性dna片段。然后，通過切膠回收、ta克隆及測序，獲得該dna序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計迎霜分子特異性標記引物，以該引物作為pcr引物，對‘迎霜’及其相近茶樹品種進行pcr擴增，該引物只與迎霜樣本dna發(fā)生反應(yīng)，獲得1346bp大小的特異性片段，而與其他茶樹品種樣品不發(fā)生反應(yīng)。為了進一步驗證特異性引物s4ysf/s4ysr的穩(wěn)定性，用該引物組合對來自10個不同迎霜個體的樣本dna進行pcr擴增，結(jié)果所有迎霜樣品都能擴增出1346bp大小特異性條帶，說明該引物具有較高的穩(wěn)定性和應(yīng)用范圍。

本發(fā)明的第二個目的是提供上述分子特異性標記引物對迎霜進行鑒別的方法。所述方法為：采用上述引物組合(s4ysf/s4ysr)作為特異性擴增引物，以待測茶樹植物樣品dna為模板，進行pcr擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)分子量為1346bp大小的特異性片段，則待測茶樹植物樣品為‘迎霜’，反之則不是。

具體的，所述方法如下：

(1)基因組dna提取：取待測茶樹植物樣品新鮮葉片，加液氮研磨至粉末，然后，利用uniq-10柱式植物基因組dna抽提試劑盒(訂購于上海生工生物工程股份有限公司)提取待測樣品的基因組dna。

(2)pcr擴增：以步驟(1)提取的待測樣品dna為模板，以所述分子特異性標記引物(s4ysf/s4ysr)作為擴增引物，進行pcr擴增。

pcr反應(yīng)體系(總體積20μl)：1μl上游引物s4ysf(10μm)，1μl下游引物s4ysr(10μm)，10μl2×pcrsupermix(訂購于北京全式金生物技術(shù)有限公司)，1μl模板dna(50ng/μl)，7μlddh2o。

pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，57℃退火50s，72℃延伸1.5min,共32個循環(huán)；最后，72℃延伸10min。

(3)電泳檢測：取10μl步驟(2)pcr產(chǎn)物,用1.5﹪瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，然后利用凝膠成像系統(tǒng)(bio-radmoleculargeldoc^tmxr+systemwithimagelab^tmsoftware)拍照檢測。若電泳圖通道出現(xiàn)分子量為1346bp大小的dna條帶，則待測樣品為迎霜，反之則不是。

本發(fā)明主要有益效果表現(xiàn)為：設(shè)計的引物組合(s4ysf/s4ysr)為茶樹品種‘迎霜’特異性擴增引物，若為其他茶樹品種的樣品dna，則pcr反應(yīng)為陰性，進而實現(xiàn)茶樹品種‘迎霜’的快速鑒別，檢測結(jié)果準確，使用方法簡便，操作耗時短。

附圖說明

圖1為本發(fā)明涉及到的18個茶樹品種的一芽二葉表型照片。1、龍井43；2、龍井長葉；3、中茶102；4、中茶108；5、烏牛早；6、福鼎大白茶、7、茂綠；8、迎霜；9、春雨1號、10、春雨2號；11、浙農(nóng)113；12、浙農(nóng)117；13、勁峰；14、翠峰；15、中茶125；16、中茶126；17、中茶127；18、中茶128。圖1表明‘迎霜’與其他17個茶樹品種的葉片表型非常相似。

圖2為利用本發(fā)明設(shè)計的分子特異性標記引物(s4ysf/s4ysr)對18個茶樹樣品dna進行pcr擴增的電泳圖，其中m為dna分子量標準trans2kdnamarker(訂購于北京全式金生物技術(shù)有限公司)；通道1：龍井43；2：龍井長葉；3：中茶102；4：中茶108；5：烏牛早；6：福鼎大白茶、7：茂綠；8：迎霜；9：春雨1號；10：春雨2號；11：浙農(nóng)113；12：浙農(nóng)117；13：勁峰；14：翠峰；15：中茶125；16：中茶126；17：中茶127；18：中茶128。電泳圖顯示只有‘迎霜’樣品擴增出分子量為1346bp大小的特異性dna條帶。

圖3是采用迎霜分子特異性標記引物s4ysf/s4ysr對10份不同迎霜個體的dna進行檢測的pcr擴增電泳圖。其中，m為dna分子量標準trans2kdnamarker(訂購于北京全式金生物技術(shù)有限公司)；通道1-10：對應(yīng)為10個不同‘迎霜’樣品，編號分別為ys1-ys10。

具體實施方式

本發(fā)明可以在分子水平上較為快速準確的鑒別茶樹品種‘迎霜’的相關(guān)樣品。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1：茶樹品種‘迎霜’分子特異性標記引物開發(fā)設(shè)計

1.樣品基因組dna提取

剪取18個相似茶樹樣品(具體信息見附圖1說明)新鮮葉片100mg放入研缽，立即加入液氮徹底磨碎，然后利用uniq-10柱式植物基因組dna抽提試劑盒(訂購于上海生工生物工程股份有限公司)提取基因組dna，所得dna用1％瓊脂糖膠進行電泳檢測，并用紫外分光光度計檢測濃度，稀釋至50ng/μl，4℃保存，用于后續(xù)pcr擴增。

2.分子特異性標記引物s4ysf/s4ysr設(shè)計

利用常規(guī)pcr擴增技術(shù)，通過大量dna指紋圖譜比較分析，篩選獲得迎霜特異性核苷酸序列，經(jīng)過切膠回收、克隆及測序，獲得該dna序列(送上海生工生物工程股份有限公司測序)，然后基于該dna序列設(shè)計獲得迎霜特異性引物s4ysf/s4ysr(s4ysf：tgagctgagtgagttgaa；s4ysr：gtcggtactgactatgaa)(引物序列由蘇州泓迅生物科技有限公司合成)。

實施例2：特異性標記引物s4ysf/s4ysr的pcr擴增及電泳檢測

以本發(fā)明開發(fā)的特異性標記引物組合s4ysf/s4ysr為擴增引物，對不同茶樹品種樣品dna(具體見附圖1說明)進行pcr檢測。

pcr反應(yīng)體系(總體積20μl)：上游引物s4ysf(10μm)1μl，下游引物s4ysr(10μm)1μl，2×pcrsupermix(訂購于北京全式金生物技術(shù)有限公司)10μl，模板dna(50ng/μl)1μl，ddh2o7μl。

pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，57℃退火50s，72℃延伸1.5min,共32個循環(huán)；最后，72℃延伸10min。

在1.5﹪瓊脂糖凝膠上對pcr產(chǎn)物進行電泳檢測，利用凝膠成像系統(tǒng)(bio-radmoleculargeldoc^tmxr+systemwithimagelab^tmsoftware)進行拍照檢測。電泳圖如附圖2所示(圖中，通道m(xù)為dna分子量標準trans2kdnamarker；通道1～18為18個不同茶樹品種的樣品，具體見附圖說明)。從附圖2可以看出只有迎霜樣品(通道8)能擴增出1346bp大小的特異性dna片段。而其他茶樹品種沒有擴增出任何條帶，這表明本發(fā)明的特異性標記引物專一性好，靈敏度高，可以用于茶樹品種‘迎霜’的快速鑒別。

實施例3：分子特異性標記引物s4ysf/s4ysr進一步驗證

為了進一步驗證本專利開發(fā)的引物組合s4ysf/s4ysr的穩(wěn)定性和應(yīng)用范圍，利用引物s4ysf/s4ysr對10份來自不同迎霜單株的樣品dna進行pcr擴增檢測，電泳圖如附圖3所示(圖中，m為dna分子量標準trans2kdnamarker；通道1-10：對應(yīng)為迎霜樣品編號ys1-ys10)。附圖3顯示所有迎霜樣品都能擴增出1346bp大小的特異性條帶，因此，本發(fā)明的特異性標記引物s4ysf/s4ysr具有很好的穩(wěn)定性和應(yīng)用性。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所

<120>用于鑒別國家級茶樹良種'迎霜'的分子特異性標記引物及其鑒別方法

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

tgagctgagtgagttgaa18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

gtcggtactgactatgaa18