本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新的環(huán)狀hsa_circrna_103127及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

唐氏綜合征(downsyndrome，ds)，即21-三體綜合征，也可稱作先天愚型或down綜合征，是由于第21號染色體異常而導(dǎo)致的出生缺陷類疾病，是出生缺陷疾病中最常見的一種染色體非整倍體遺傳性疾病?；谔剖暇C合征的發(fā)病機制仍不清楚，目前針對該病仍然沒有有效的治療方法，出生干預(yù)是目前降低出生缺陷的重要手段，而出生干預(yù)主要依賴于產(chǎn)前診斷與產(chǎn)前篩查。產(chǎn)前篩查主要在孕早期(7～12周)以及孕中期(15～20周)檢測孕婦的一定指標(biāo)包括孕婦年齡的篩查、超聲篩查、胎兒母體血清學(xué)的篩查以及聯(lián)合篩查方案等以評估胎兒是否患有ds的風(fēng)險。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷則主要采用的是侵入性的取樣手段，包括臍帶取血，羊膜腔穿刺以及絨毛膜取樣等，利用ds遺傳學(xué)診斷技術(shù)、ds分子學(xué)診斷技術(shù)、熒光原位雜交(fish)、聚合鏈反應(yīng)(qf-pcr)以及短串聯(lián)重復(fù)序列(str)等技術(shù)對胎兒樣本進行分析診斷。然而，傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查具有檢出率低、漏檢率高和結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性的缺點，產(chǎn)前診斷則因為侵入式取樣的手段容易產(chǎn)生出血、流產(chǎn)或患有其它并發(fā)癥。

為了提高產(chǎn)前篩查的準(zhǔn)確性以及產(chǎn)前診斷的安全性，研究者們一直在探索新的ds無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷方法。無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷具有簡便、安全以及可靠等優(yōu)點，其中包括母血胎兒細胞途徑，母血胎兒游離dna途徑和母血胎兒游離rna途徑。然而由于胎兒有核細胞中的基因組涵蓋了胎兒全部的遺傳信息，因而存在于孕婦循環(huán)血中的胎兒有核細胞成為了最初研究者們的研究方向。但這種方法存在的最大問題在于胎兒有核細胞在母體血液中含量極少，無法達到分析診斷的要求，最終使臨床應(yīng)用受到了一定的限制。

綜上所述，基于傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的缺陷，以及已有無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法的不足，使得探索新的無創(chuàng)性唐氏綜合征胎兒產(chǎn)前診斷標(biāo)志物具有非常重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開一種新的環(huán)狀hsa_circrna_103127。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：公開了一種環(huán)狀rna，其序列如seqidno：1所示。

優(yōu)選的，該環(huán)狀rna作為唐氏綜合征檢測、治療、預(yù)后靶點的應(yīng)用。

一種唐氏綜合征檢測試劑盒，該試劑盒中含有能夠定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的試劑。

優(yōu)選的，該試劑盒中含有實時熒光定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的引物序列。

優(yōu)選的，檢測環(huán)狀rna引物序列是：

f：5’-gaccgtcgccagccaaac-3’(seqidno：4)；

r：5’-gagtccagcggcaaaactataa-3’(seqidno：5)。

定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的試劑在制備唐氏綜合征檢測試劑中的應(yīng)用。

定量檢測環(huán)狀rna的試劑為實時熒光定量檢測序列為seqidno：1環(huán)狀rna的引物序列。

優(yōu)選的，環(huán)狀rna引物序列是：

f：5’-gaccgtcgccagccaaac-3’(seqidno：4)；

r：5’-gagtccagcggcaaaactataa-3’(seqidno：5)。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明申請公開的circrna在唐氏綜合征病人與正常人群體內(nèi)表達具有比較明顯的表達差異，目前用于唐氏綜合征的臨床輔助診斷技術(shù)尚不完善，因此該circrna具有作為唐氏綜合征相關(guān)的生物標(biāo)志物的潛能。

具體實施方式

實施例1

在對唐氏綜合癥的研究過程中，發(fā)現(xiàn)一種環(huán)狀rna，其序列是：tgttatagttttgccgctggactcttccctcccttcccccaccccatcaggatgatatgagacttgaaagaagacgatgcatacaggaggagagacttcagcatgcaaaccttcatctgttcggcttgcaccgtcattttcattccatgctgctggccttcagatggctggacagatgccccattcacatcagtacagtgaccgtcgccagccaaacataagtgaccaacaggtttctgccttatcatattctgaccagattcagcaacctctaactaaccag(seqidno：1)，將其命名hsa_circrna_103127。

實施例2樣本及處理

12例胎兒臍帶血標(biāo)本從深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心中心實驗室獲得，其中包括6例經(jīng)g顯帶染色體核型分析確診為標(biāo)準(zhǔn)型唐氏綜合征胎兒的臍帶血標(biāo)本(2男4女)以及6例正常胎兒臍帶血(2男4女)，孕齡均為18-22周；12例兒童外周血標(biāo)本從桂林市中國人民解放軍第一八一部隊醫(yī)院廣西代謝性疾病研究重點實驗室獲得，其中包括6例唐氏綜合征患兒外周血標(biāo)本(2男4女)以及6例健康兒童外周血標(biāo)本(2男4女)，年齡均為0-15歲。本研究已經(jīng)深圳市人民醫(yī)院以及桂林市解放軍第一八一部隊醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并均征得患者的知情同意，所有受試者均提供書面知情同意書。

分別采用rt-pcr技術(shù)在ds患兒與健康兒童的外周血中進行了驗證。同時對于驗證得出的差異性變化的circrna所對應(yīng)的mrna，發(fā)明人采用rt-pcr技術(shù)在外周血中進行了檢測。

rt-pcr驗證的具體實驗步驟為：

(1)制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋dna模板：

a針對每一需要測量的基因和管家基因，選擇一個確定表達該基因的cdna模板進行pcr反應(yīng)：

輕彈管底，將溶液混合，5000rpm短暫離心，設(shè)置pcr反應(yīng)：95℃，10min；40個pcr循環(huán)(95℃，10秒；60℃，60秒(收集熒光))；

b將pcr產(chǎn)物與100bpdnaladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測pcr產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶；

c將pcr產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋：設(shè)定pcr產(chǎn)物濃度為1，分別稀釋為1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8、1×10^-9，這幾個梯度濃度的dna。

(2)進行rt-pcr反應(yīng)：

a將所有cdna樣品分別配置rt-pcr反應(yīng)體系。體系配置如下：

輕彈管底，將溶液混合，5000rpm，短暫離心；

b加樣：

將8ul混合液加到384-pcr板對應(yīng)的每個孔中，再加入對應(yīng)的2μlcdna。小心粘上sealingfilm封口膜，并短暫離心混合。最后，在設(shè)置pcr程序前將準(zhǔn)備好的pcr板放在冰上；

c將上述384-pcr板置于realtimepcr儀上進行pcr反應(yīng)：

所有的指標(biāo)均按以下程序進行：95℃，10min；40個pcr循環(huán)(95℃，10秒；60℃，60秒(收集熒光))。為了建立pcr產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動進行-ramprate為0.05℃/秒)。

(3)結(jié)果與計算：

rt-pcr時各樣品的加樣量均為2μl，然而由于受rna濃度定量誤差和rna逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，每個樣品的2μl體積的cdna其含量并不完全相同，為校正此差異，使用管家基因β-actin(不同樣品間表達量基本恒定)作為內(nèi)參，以樣品待測基因的值除以此樣品內(nèi)參的值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量。

實施例3實驗結(jié)果

以β-actin為內(nèi)參照物，分別運用rt-pcr技術(shù)在外周血中對上述circrna進行了驗證。pcr引物序列如表1：

表1rt-pcr引物列表

利用2-δδct法計算差異倍數(shù)，結(jié)果如表2。

表2circrna驗證結(jié)果

結(jié)果表明，相較于健康人群，在唐氏綜合癥患者中，hsa_circrna_103127的表達量會顯著升高，二者存在著明顯的正相關(guān)的關(guān)系。

sequencelisting

<110>中國人民解放軍第一八一醫(yī)院

<120>hsa_circrna_103127在唐氏綜合征的診斷、治療及預(yù)后中的應(yīng)用

<130>

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>283

<212>dna

<213>hsa_circrna_103127

<400>1

tgttatagttttgccgctggactcttccctcccttcccccaccccatcaggatgatatga60

gacttgaaagaagacgatgcatacaggaggagagacttcagcatgcaaaccttcatctgt120

tcggcttgcaccgtcattttcattccatgctgctggccttcagatggctggacagatgcc180

ccattcacatcagtacagtgaccgtcgccagccaaacataagtgaccaacaggtttctgc240

cttatcatattctgaccagattcagcaacctctaactaaccag283

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gtggccgaggactttgattg20

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cctgtaacaacgcatctcatatt23

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gaccgtcgccagccaaac18

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gagtccagcggcaaaactataa22