專利名稱：一種快速診斷唐氏綜合征的方法
一種快速診斷唐氏綜合征的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種擴(kuò)增21號(hào)染色體上D21S1440、D21Sll和PentaD3個(gè)STR基因座診斷唐氏綜合征的方法。
背景技術(shù)：
唐氏綜合征(Down's syndrome, DS)又稱21-三體綜合征，是人類最常見的染色體病。主要表現(xiàn)為智力低下，常合并多種畸形，生活基本不能自理。我國(guó)每年大約有26 600個(gè)DS患兒出生，平均每20分鐘出生一個(gè)，每出生1例DS患兒大約給社會(huì)造成幾十萬元的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，我國(guó)每年治療DS的總費(fèi)用超過25億元人民幣。迄今醫(yī)學(xué)上尚無根治DS方法。降低DS患兒出生率的有效方法是產(chǎn)前診斷。通過產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)DS患兒，積極采取干預(yù)措施，避免DS患兒的出生。
由于DS篩查的普及，使產(chǎn)前診斷的需求呈明顯上升的趨勢(shì)。天津市2007年有近60 000例孕婦進(jìn)行DS篩査，有3 600例左右孕婦需進(jìn)行產(chǎn)前診斷一羊水細(xì)胞染色體檢査。但實(shí)際羊水細(xì)胞染色體檢査例數(shù)只有1 000例左右，檢出染色體病胎兒20余例。也就是說有2 600例孕婦因未做羊水細(xì)胞染色體，而導(dǎo)致50余例DS患兒出生。羊水細(xì)胞染色體檢查率低的原因除與孕婦的經(jīng)濟(jì)狀況、對(duì)羊膜腔穿刺并發(fā)癥的恐懼心理有關(guān)外，還與羊水細(xì)胞染色體報(bào)告時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)。因?yàn)檠蛩?xì)胞染色體的檢測(cè)需要10 14天的細(xì)胞培養(yǎng)，21 28天方可出診斷報(bào)告，而且技術(shù)要求高，有培養(yǎng)失敗的可能性?，F(xiàn)有的細(xì)胞遺傳學(xué)方法已不能滿足日益增長(zhǎng)的產(chǎn)前診斷需要。這就要求我們建立一種適合本民族的快速產(chǎn)前診斷DS的方法，與細(xì)胞遺傳學(xué)互補(bǔ)，提高產(chǎn)前診斷率，真正做到防止先天缺陷兒的出生，降低我國(guó)人口出生缺陷率，提高我國(guó)人口素質(zhì)。
已知機(jī)體的各種有核細(xì)胞均有人類全套基因組DNA，而基因組中含有大量的重復(fù)序列，其中不少是短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeat, STR )。 STR基因座數(shù)量多、穩(wěn)定具有高度多態(tài)性，可提供較多的遺傳信息量，而且在上下代的傳遞過程中遵循孟德爾共顯性遺傳定律；STR基因座具有種族的差異；STR基因座的每一個(gè)基因代表著一條染色體，是目前檢測(cè)染色體數(shù)目異常最合適的遺傳學(xué)標(biāo)記。國(guó)外己將擴(kuò)增STR基因座作為診斷DS的方法之一。但由于STR基因座具有種族的
4差異，而且我國(guó)漢族群體占91.6。/。，因此有必要建立中國(guó)漢族群體擴(kuò)增STR基因座診斷DS的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速診斷唐氏綜合征的方法。該方法是擴(kuò)增21號(hào)染色體D21S1440、 D21Sll和PentaDSTR基因座，測(cè)序膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶及面積的分析達(dá)到診斷DS的目的。
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的方案是設(shè)計(jì)一種擴(kuò)增21號(hào)染色體D21S1440、D21Sll和PentaD STR基因座診斷DS的方法。其特征在于所述方法包括
(1) 用常規(guī)方法采集樣本，于一20'C保存?zhèn)溆?；所述樣本是羊水樣本、絨毛樣本或外周血樣本；
(2) 提取樣本中的DNA ，其中外周血樣本采用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提?。谎蛩畼颖净蚪q毛樣本采用鹽析法進(jìn)行DNA提?。?br> (3) 選擇與合成引物，其中
a. D21S1440引物序列
f-F AM-GAGTTTGA AAAT AAAGTGTTCTGC;r-CCCC ACCCCTTTT AGTTTT A;擴(kuò)增產(chǎn)物為157 175bp;
b. D21S11引物序列
f- FAM -GTGAGTCAATTCCCCAAG;r- GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC;擴(kuò)增產(chǎn)物為172 260bp;
c. PentaD引物序歹!j:
f隱FAM -GAAGGTCGAAGCTGAAGTG;r- CTTGTGTCCAGATTAAAGAATTCTT;擴(kuò)增產(chǎn)物為398bp 433bp;
5(4) PCR擴(kuò)增
以提取的基因組DNA為模板，在9600 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)體系為25^L 50pL，其中模板0.2 0.4pL其終濃度0.6ng， dNTPs 0.5pL l.(VL其終濃度0.2mmol/L， T叫酶0.5^L l.OpL其終濃度0.04 U/pL， 10xPCR buffer 2.5pL 5.0pL其終濃度lxPCR buffer,引物f-FAM 0.03pL 0.06^L其終濃度0.12拜ol/L，引物r 0.03^L 0.06nL其終濃度0.12|xmol/L，最后補(bǔ)充ddH20至25pL 5(^L。
(5) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)
采用ABI PRISM 377測(cè)序電泳、GeneScan 3.1軟件及核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)電泳條帶進(jìn)行峰面積定量檢測(cè)。
本發(fā)明擴(kuò)增D21S1440、 D21Sll和PentaDSTR基因座診斷DS的方法，用以聯(lián)
合應(yīng)用診斷DS。
本發(fā)明將DNA模板通過D21S1440、 D21S1 l和PentaD熒光引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
熒光信號(hào)變量與擴(kuò)增產(chǎn)物變量成正比，通過熒光的采集、分析和對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行峰面積定量，實(shí)現(xiàn)對(duì)原始模板量的定量。應(yīng)用D21S1440、 D21Sll和PentaD擴(kuò)增進(jìn)行DS的基因診斷時(shí)，染色體iH常樣本擴(kuò)增可出現(xiàn)2種情況雜合子顯示2條帶/峰，0.7《峰下面積比值《1.4;純合子顯示l條帶/峰，峰面積與雜合子的比值〉1.4。DS個(gè)體樣本擴(kuò)增可出現(xiàn)3種情況(1)任何1個(gè)基因座在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)3條帶/峰；(2)在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)2條帶/峰，峰下面積比值<0.7或>1.4; (3)在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)l條帶/峰，峰面積相當(dāng)于雜合子的3倍。
本發(fā)明應(yīng)用QF-PCR擴(kuò)增D21S1440、 D21Sll和PeritaD STR基因座產(chǎn)前診斷DS，與染色體核型分析相比有以下優(yōu)勢(shì)(1)快速， 一般24 48小時(shí)即可得出結(jié)果，而通過染色體核型分析一般3 4周。(2)靈敏度為100%，特異度為97.39%。(3)取材少，0.5 3mL羊水即可以用于診斷，而染色體核型分析需用羊水20mL左右。(4)可以對(duì)大批量標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行診斷，結(jié)果分析省時(shí)省力。(5)通過比較母親和胎兒的擴(kuò)增結(jié)果，可以對(duì)母血污染的樣本做出正確診斷。(6)可以區(qū)分單卵雙胎和雙卵雙胎。(7)可以對(duì)多種樣本包括上皮細(xì)胞、性腺細(xì)胞等進(jìn)行分析，而且適用于少量及微量的DNA樣本，如孕婦外周血中胎兒細(xì)胞、卵裂球、極體和經(jīng)宮頸富集的胎兒細(xì)胞等。
應(yīng)用QF-PCR擴(kuò)增STR基因座具有精確度高、自動(dòng)進(jìn)樣和結(jié)果數(shù)據(jù)化等優(yōu)勢(shì)，是大規(guī)模產(chǎn)前診斷DS的理想工具。


圖1為D21S1440 STR基因座電泳圖2a泳道l遷移率曲線圖2b泳道l峰面積定量圖3a泳道5遷移率曲線圖3b泳道5峰面積定量圖4為DS個(gè)體D21S1440 STR基因座電泳圖;
圖5a泳道4遷移率曲線圖5b泳道4峰面積定量圖6a泳道5遷移率曲線圖6b泳道5峰面積定量圖7 為D21S11 STR基因座電泳圖8a泳道4遷移率曲線圖8b泳道4峰面積定量圖9a泳道2遷移率曲線圖9b泳道2峰面積定量圖IO DS個(gè)體D21S11 STR基因座電泳圖lla泳道3遷移率曲線圖llb泳道3峰面積定量圖12a泳道2遷移率曲線圖12b泳道2峰面積定量圖13 PentaD STR基因座電泳圖；圖14a泳道4遷移率曲線圖；圖14b泳道4峰面積定量圖；圖15a泳道5遷移率曲線圖；圖15b泳道5峰面積定量圖16 DS個(gè)體PentaD STR基因座電泳圖； 圖17a泳道5遷移率曲線圖； 圖17b泳道5峰面積定量圖； 圖18a泳道4遷移率曲線圖； 圖18b泳道4峰面積定量圖。
以下結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例參照附圖進(jìn)行詳細(xì)敘述。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明選取漢族個(gè)體719例，包括外周血樣本389例、羊水樣本282例和絨毛樣 本48例。719例樣本經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)確診DS67例，652例染色體核型分析正常。
實(shí)驗(yàn)方法
(一) 樣本采集
1. 羊水樣本按常規(guī)方法經(jīng)腹抽取2~3 mL羊水一2(TC保存?zhèn)溆茫换? 000rpm 離心5min，細(xì)胞沉淀用80%乙醇固定，一20'C保存?zhèn)溆谩?br> 2. 絨毛樣本按常規(guī)方法經(jīng)陰道取10 20mg絨毛，Hank's平衡溶液漂洗后， 一2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 3. 外周血樣本取靜脈血2mL于EDTA-抗凝管中；或取200pL EDTA-抗凝 血按本室常規(guī)方法提取白細(xì)胞(white blood cell， WBC) ， 一20'C保存?zhèn)溆谩?br> (二) DNA提取
1.外周血樣本均采用DNA提取試劑盒(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司出 售)，提取過程按說明書進(jìn)行。其過程如下
(1) 取200pL分離好的WBC, 8 000rpm離心3min，棄上清，生理鹽水洗滌 沉淀一次。
(2) 加入300nL 5mol/L異硫氰酸胍，用移液器反復(fù)吸打沉淀物4~6次，加 入10nLRNaseA， 37°C溫浴10min。
(3) 加入800pL 4 mol/L NaC104 (PH: 5.2) ， 20pL Resin混勻，室溫5min。
(4) 8 000rpm離心30s，棄上清。
(5) 加入500pL 200mM NaCl、 50mM Tris-HCl (PH 7.5) 、 10mM EDTA、 無水乙醇的混合液，混勻，一20。C放置20min， 8 000rpm離心60s，棄上清。
8(6) 重復(fù)步驟(5)。
(7) 12 000rpm離心30s，吸干剩余液體，室溫放置5-10min。
(8) 加入50~100(iL TE Buffer,混勻，50。C保溫10min， 12 000 rpm離心60s， 吸取上清，即為基因組DNA。
2.羊水及絨毛樣本均采用鹽析法提取DNA。其過程如下
(1) 樣本處理取100laL80X乙醇固定的羊水細(xì)胞懸浮液，8 000rpm離心 5min，棄上清，生理鹽水洗滌沉淀2次；新鮮及凍存的羊水則直接取1 1.5mL， 12 000rpm離心10min，棄上清，生理鹽水洗滌沉淀2次；挑取10~20mg絨毛樣本 在Hank's液中漂洗去除血污后置于離心管中，生理鹽水洗滌2次。
(2) 加入300nL STE溶液，充分混勻后分別加入30pLSDS溶液和20(iL蛋 白酶K溶液。
(3) 混勻后5(TC恒溫水浴2.5~3h，至細(xì)胞完全融解，其間顛倒混勻數(shù)次。
(4) 自然冷卻至室溫，加入1/3體積的過飽和NaCl溶液(約llOpL)，強(qiáng) 烈振蕩數(shù)次，5 OOOrpm離心15min。
(5) 轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中，加入等體積CHC13 (約40(HiL)，混勻后 8 OOOrpm離心15min。
(6) 轉(zhuǎn)移水相至一新離心管中，加入2倍體積一20。C預(yù)冷的無水乙醇，一2(TC 冷凍至少2h， 12 000rpm離心30min，棄上清。
(7) 75%乙醇洗滌沉淀1次，12 000rpm離心15min，棄上清，沉淀即為所 需DNA，過夜晾干。
(8) 加15~30|iLTE Buffer溶解沉淀。
所有提取的基因組DNA用2.5%瓊脂糖凝膠以100V電壓電泳25min，以 1 OOObp DNA Marker為片段長(zhǎng)度標(biāo)記，確定標(biāo)本DNA質(zhì)量和濃度。提取的DNA 于一20'C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> (三)引物的選擇與合成
經(jīng)過21號(hào)染色體上D21S1440、D21Sll、PentaD、D21S258、D21S212、D21S210 和D21S215等7個(gè)STR基因座的篩選，確定D21S1440、 D21S11、 Penta D 3個(gè) STR基因座為診斷DS的候選基因座。根據(jù)GDB人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道， 確定D21S1440、 D21S11和PentaD 3個(gè)STR基因座的引物序列，正向引物5，-端 均由熒光染料5-羧基-熒光素(caboxyfluorescein國(guó)5-succimidyl ester， FAM)標(biāo)記， 由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。
9200810152923.31. D21S1440:定位于21q22.3， GDB: 684003，擴(kuò)增產(chǎn)物為157 175bp 引物序列f-FAM-GAGTTTGAAAATAAAGTGTTCTGC;
r-CCCCACCCCTTTTAGTTTTA
2. D21S11:定位于21q21.1, GDB: 188664，擴(kuò)增產(chǎn)物為172 260bp 引物序列f- FAM -GTGAGTCAATTCCCCAAG;
r- GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC
3. PentaD:定位于21q，擴(kuò)增產(chǎn)物為398bp 433bp
弓I物序列f- FAM隱GAAGGTCGAAGCTGAAGTG;
r隱CTTGTGTCCAGATTAAAGAATTCTT (四)PCR擴(kuò)增
以提取的基因組DNA為模板，在9600 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為 25nL~50pL。反應(yīng)組分見表l。
表l PCR擴(kuò)增體系
反應(yīng)組分加樣體積(pL)終濃度
模板0.2-0.40.6ng
dNTPs(10mM)0.5-1.00.2 mmol/L
Taq酶(2U/(iL)0.5-1.00.04 U/|iL
10xPCR buffer2.5-5.01 xPCR buffer
引物f-F AM0.03-0.060.12nmol/L
引物r (lOOpM)0.03-0.060.12|imol/L
ddH20補(bǔ)充體系至 25-5(^L
PCR擴(kuò)增條件如下
預(yù)變性93°C~95°C 2min;變性93°C~95°C 30s，退火58°C~62°C 30s，延伸 72°C lmin共32個(gè)循環(huán)；延伸72°C 5min后6(TC保溫30min， 4。C保存。
每次PCR反應(yīng)均設(shè)空白對(duì)照，所有操作均戴一次性手套在冰浴上進(jìn)行，所有 耗材均在高壓滅菌后一次性使用。 (五)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI PRISM 377測(cè)序電泳檢測(cè)。
1.預(yù)電泳20 30min至膠的溫度達(dá)到40°C。2. 取l^L的擴(kuò)增產(chǎn)物與lpL內(nèi)標(biāo)混勻，95 'C變性2min，立即放在碎冰上冷 卻，盡快取lpL上樣。
3. 1 200V電泳2.5h。
4. 電泳結(jié)束后，打開膠圖(膠圖由測(cè)序儀軟件自動(dòng)生成)，即可分析結(jié)果。
1. 結(jié)果分析用GeneScan 3.1軟件進(jìn)行電泳數(shù)據(jù)分析。用GSG-核酸/蛋白凝 膠圖像分析管理系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行峰面積定量檢測(cè)。所有操作均按操作指南進(jìn) 行。
2. DS診斷標(biāo)準(zhǔn)
(1) 任何1個(gè)基因座在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)3條帶，經(jīng)核酸/蛋白凝膠圖像 分析管理系統(tǒng)分析可見3個(gè)峰，即可診斷DS。
(2) 在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)2條帶，經(jīng)核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分 析可見峰下面積比值<0.7或>1.4的2個(gè)峰，可輔助診斷DS。
(3) 若在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)1條帶，則不能診斷DS。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)719例樣本，D21S1440、 D21S11和Penta D 3個(gè)STR基因座均擴(kuò) 增成功，擴(kuò)增產(chǎn)物為156 438bp，與GDB人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道相符。 一、D21S1440 STR基因座結(jié)果分析
719例樣本中染色體核型分析正常的652例，有645例電泳結(jié)果表現(xiàn)為2條 帶/峰，0.7《峰下面積比值《1.4，或1條帶，峰下面積與正常雜合子峰下面積比 M.4(見圖l 3b);有7例出現(xiàn)3條帶，為假陽性。
圖1可見泳道1、 3、 4顯示1條帶；泳道2、 5可見2條帶。圖2a可見對(duì)應(yīng) 泳道1的電泳條帶顯示1個(gè)峰，圖2b顯示峰下面積為l，為純合子；圖3a可見對(duì) 應(yīng)泳道5顯示2個(gè)峰，圖3b顯示峰下面積44.74/55.26，為雜合子。
67例染色體核型分析確診為DS的樣本，有21例樣本出現(xiàn)3條帶，峰面積均 值分別為32.72±3.63、 34.54±2.04和32.74±3.50; 27例樣本出現(xiàn)2條帶，峰面積均 值分別為66.06士2.84和34.12±2.77，其比值為1.96土0.24; 19例樣本出現(xiàn)1條帶。 48例可診斷為DS。
擴(kuò)增D21S1440 STR基因座診斷DS的靈敏度為71.64% (48/67)，特異度為 98.93% (645/652)。
D21S1440 STR基因座峰面積定量數(shù)據(jù)見表2 3，電泳圖及遷移率、峰面積定 量曲線圖見圖4~6b。
11表2 D21S1440 STR基因座21例3條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(％ )
樣本號(hào)條帶l條帶2條帶3樣本號(hào)條帶l條帶2條帶3
376333.2636.1330.61353732.2537.2330.52
379423.2735.0641.67365832.0833.2934.63
387129.3233.4937.19334532.0932.5330.75
386636.4135.2628.33071632.7535.4332.48
363030.6238.3431.04372836.7135.4231.83
352633.5736.0830.53373330.2632.2231.07
360833.4236.8329.75071739.636.5833.16
352335.2830.0934.63368836.7232.0828.32
364136.8233.0930.09376232.5833.9733.45
羊水230.6833.5935.73羊水432.2435.6632.10
羊水827.2933.0439.67
表3 D21S1440 STR基因座27例2條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(％)
樣本號(hào)條帶l條帶2比值樣本號(hào)條帶l條帶2比值
378465.3934.611.89387068.1631.842.14
375968.331.72,15071266,7133.292.00
378266.5433.461.99071369.3230.682.26
380665.1534.851.87377862.9337.071.70
380570.2729.732.36352262.3537.651.66
376463.4936.511.74354967.5532.452.08
376269.3230.682.26364570.0629.942.34
380863.1236.881.71324062.9437.061.70
381267.1432.862.04364966.3933.611,98
383563.2836.721.72355263.4836.521.74
385869.0330.972.23071863,7736.231.76
383062.7437.261.68羊水l61.0338.971.57
羊水369,4435.361.97羊水569.9530.052.33
羊水765.7334.271.92
圖4可見泳道1、 3顯示1條帶；泳道2、 4可見2條帶；泳道5可見3條帶。 圖5a可見對(duì)應(yīng)泳道4的電泳條帶顯示2個(gè)峰，圖5b顯示峰下面積65.15/34.85; 圖6a可見對(duì)應(yīng)泳道5顯示3個(gè)峰，圖6b顯示峰下面積23.27/35.06/41.67。
二、D21SU STR基因座結(jié)果分析
719例樣本中染色體核型分析正常的652例，有643例電泳結(jié)果表現(xiàn)2條帶/
12峰、0.7《峰下面積比值《1.4，或1條帶、峰下面積與正常雜合子峰下面積比>1.4 (見圖7 9b);有9例出現(xiàn)3條帶，為假陽性。
圖7可見泳道1、 4顯示1條帶；泳道2、 3、 5可見2條帶。圖8a可見對(duì)應(yīng) 泳道4的電泳條帶顯示1個(gè)峰，圖8b顯示顯示峰下面積為1，為純合子；圖9a 可見對(duì)應(yīng)泳道2顯示2個(gè)峰，圖9b顯示峰下面積41.49/58.51，為雜合子。
67例染色體核型分析確診為DS的樣本，有18例樣本出現(xiàn)3條帶，峰面積 均值分別為33.53±3.24、 34.11±3.10和32.36士3.36; 33例樣本出現(xiàn)2條帶，峰面積 均值分別為65.79±3.02和34.21±3.02，其比值為1.95士0.26; 16例樣本出現(xiàn)1條帶。 51例可診斷為DS。
擴(kuò)增D21S11 STR基因座診斷DS的靈敏度為76.12% (51/67)，特異度為 98.62% (643/652)。
D21S11 STR基因座峰面積定量數(shù)據(jù)見表4-5，電泳圖及遷移率/峰面積定量 曲線圖見圖10~12b。
表4 D21S11 STR基因座18例3條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(％)
樣本號(hào)條帶l條帶2條帶3樣本號(hào)條帶l條帶2條帶3
378929.3632.5538.09377836.4433.0730.49
380532.9733.4933.54352631.9836.5431.48
380233.9632.8333.21355226.8839.1433.98
380135.4436.5827.98364232.4635.8131.73
383535.1129,8435.05368532,4840.5326.99
383033.0635.8731,07071734.1330.9234.95
071230.2832.0937.63071838.4433.9127.65
071338.4928.4333.08羊水530.0333.3136.66
羊水833.4336.4230.15羊水938.5732.6228.81
表5 D21SU STR基因座33例2條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(％)樣本號(hào)條帶l條帶2比值樣本號(hào)條帶1條帶2比值
375866.3933.611.98360869.8830,122.32
377271.4328.572.50357968.5131.492.18
380665.4234.581.89361461.8138.191.62
379462.1337.871.64352867.3232.682.06
376464.1135.891.79364568.1331.872.14
376260.9239.081.56352366.4233.581.98
380860.1739.831.51324064.2535.751.80
13387268.5331.472.18364964.5935.411.82
385869.8130.192.31364166.7133.292.00
387162.9537.051.70353769.3230.682.26
385565.0234.981.86365865.4934.511.90
387061.9838.021.63071570.1629.842.35
071469.1330.872.24374166.3133.691.97
352269.3730.632.26373367.0632.942.04
354965.0834.921.86羊水l62.5737.431.67
羊水364.5935.411.82羊水462.0437.961.63
絨毛l63.5436.461.74.
圖10可見泳道5顯示1條帶；泳道1、 3、 4可見2條帶；泳道2可見3條 帶。圖lla可見對(duì)應(yīng)泳道3的電泳條帶顯示2個(gè)峰，圖lib顯示峰下面積 64.11/35.89;圖12a可見對(duì)應(yīng)泳道2顯示3個(gè)峰，圖12b顯示峰下面積 33.96/32.83/33.21。
三、PentaDSTR基因座
719例樣本中染色體核型分析正常的652例，有651例電泳結(jié)果表現(xiàn)2條帶/ 峰，0.7《峰下面積比值《1.4;或1條帶，峰下面積與正常雜合子峰下面積比〉 1.4(見圖13~15);有1例出現(xiàn)3條帶，為假陽性。
圖13可見泳道4顯示1條帶；泳道1、 2、 3、 5可見2條帶。圖14a可見對(duì) 應(yīng)泳道4的電泳條帶顯示1個(gè)峰，圖14 b顯示顯示峰下面積為1，為純合子；圖 15a可見對(duì)應(yīng)泳道5顯示2個(gè)峰，圖15b顯示峰下面積52.8/47.2，為雜合子。
67例染色體核型分析確診為DS的樣本，有26例出現(xiàn)3條帶，峰面積均值 分別為33.55±4.06、 33.35士2.42和33.33±3.88; 34例樣本出現(xiàn)2條帶，峰面積均值 分別為65.55±3.02和34.45±3.02，其比值為1.92±0.26; 7例樣本出現(xiàn)1條帶。60 例可診斷為DS。
擴(kuò)增Penta D STR基因座診斷DS的靈敏度為89.55% (60/67)，特異度為 99.85% (651/652)。
Penta D STR基因座峰面積定量數(shù)據(jù)見表6~7，電泳圖及遷移率/峰面積定量 曲線圖見圖16~18b。
表6 Penta D STR基因座26例3條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(％ )樣本號(hào)條帶l條帶2條帶3樣本號(hào)條帶l條帶2.條帶3
378440.0232.4327.55354936.2935.1730.94
375932.0727.6640.29363738.4132.7730.96
378926.9433.9539.11357938.4730.6324.95
376224.5935.7239.69352828.7636.5834.42
380832.5430.6836.28355230.4436.8231.64
380139.4733.2827.25364130.6937.9235.59
385839.4028.7331.87071536.5333.7233.03
386635.2933.0631 65372835.1430.4432.09
383035.7732.5931.64071730.7832.7732.95
377831.3932.7735.84368837.2636.2729.27
363029.4433鄰36.58352233.49334331.34
羊水l33.0833.9532.97羊水733.0833.9539.13
羊水929.7835.2235.0絨毛l33.0832.4934.43
表7 PentaD STR基因座34例2條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(％ )樣本號(hào)條帶l條帶2比值樣本號(hào)條帶l條帶2比值
376368.4831.522.17071367.5132.492.08
378267.1632.842.04071469.3730.632.26
377265.7434.261.92352669.3330.672.26
380659.7340.271.48360863.7236.281-76
379468.5931.412.18361463.7736.231.76
380560.9439.061.56364561.8738.131.62
380266.3233.681.97352366.5833.421.99
381260.5839.421.54324070.3329.672.37
387263.5936.411.75353765.7434.261.92
386762.4737.531.66334567.2832.722.06
383564.8935.111.85071669.0830.922.23
387161.4938.511.6037"71.5328.472.51
385567.0632.942.04368568.7331.272.20
387064.9335.071.85376264.7735.231.84
071264.1135.891.79羊水261.8038.201.62
15羊水3 66.8433.16 2.02羊水4 63.5436.46 1.74
羊水5 67.3232.68 2.06羊水6 63.4936.51 1.74
圖16可見泳道3顯示1條帶；泳道1、 5可見2條帶；泳道2、 4可見3條 帶。圖17a可見對(duì)應(yīng)泳道5的電泳條帶顯示2個(gè)峰，圖17b顯示峰下面積 67.16/32.84:圖18a可見對(duì)應(yīng)泳道4顯示3個(gè)峰，圖18b顯示峰下面積 26.94/33.95/39.11。
四、聯(lián)合D21S1440、 D21S11和PentaD3個(gè)STR基因座 719例樣本中染色體核型分析正常的652例，17例樣本出現(xiàn)3條帶，為假陽 性；67例DS樣本均得到診斷，53例樣本出現(xiàn)3條帶，14例樣本出現(xiàn)2條帶/峰， 0.7〉峰下面積比值>1.4。
擴(kuò)增D21S1440、 D21S11和Penta D STR基因座診斷DS的靈敏度為 100%(67/67)，特異度為97.39%(635/652)。
16序列表
<110>天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院
<120> —種快速診斷唐氏綜合征的方法
<160〉 6
<210〉 1 <211>24 <212>DNA <213〉人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(24)
<400> 1
gagtttgaaa ataaagtgtt ctgc 24
<210〉2 <211>20 <212〉DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(20)
<400> 2
ccccacccct tttagtttta 20
<210> 3 <211>8 <212> DNA <213>人工序列
<220〉
<221> gene
<222〉 (1)…(18)
<400> 3
gtgagtcaat tccccaag 18
17<210> 4 <211>22 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(22)
<400> 4
gttgtattag tcaatgttct cc 22
<210>5 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(19)
<400> 5
gaaggtcgaa gctgaagtg 19
<210〉6 <211>25 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(25)
<400> 6
cttgtgtcca gattaaagaa ttctt 25
18
權(quán)利要求
1、一種快速診斷唐氏綜合征的方法，其特征在于所述方法包括(1)用常規(guī)方法采集樣本，于-20℃保存?zhèn)溆?；所述樣本是羊水樣本、絨毛樣本或外周血樣本；(2)提取樣本中的DNA，其中外周血樣本采用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提?。谎蛩畼颖净蚪q毛樣本采用鹽析法進(jìn)行DNA提??；(3)選擇與合成引物，其中a.D21S1440引物序列f-FAM-GAGTTTGAAAATAAAGTGTTCTGC；r-CCCCACCCCTTTTAGTTTTA；擴(kuò)增產(chǎn)物為157～175bp；b.D21S11引物序列f-FAM-GTGAGTCAATTCCCCAAG；r-GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC；擴(kuò)增產(chǎn)物為172～260bp；c.Penta D引物序列f-FAM-GAAGGTCGAAGCTGAAGTG；r-CTTGTGTCCAGATTAAAGAATTCTT；擴(kuò)增產(chǎn)物為398bp～433bp；(4)PCR擴(kuò)增以提取的基因組DNA為模板，在9600PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)體系為25μL～50μL，其中模板0.2～0.4μL其終濃度0.6ng，dNTPs 0.5μL～1.0μL其終濃度0.2mmol/L，Taq酶0.5μL～1.0μL其終濃度0.04U/μL，10×PCR buffer 2.5μL～5.0μL其終濃度1×PCR buffer，引物f-FAM 0.03μL～0.06μL其終濃度0.12μmol/L，引物r 0.03μL～0.06μL其終濃度0.12μmol/L，最后補(bǔ)充ddH2O至25μL～50μL；(5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)采用ABI PRISM 377測(cè)序電泳、GeneScan 3.1軟件及核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)電泳條帶進(jìn)行峰面積定量檢測(cè)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增條件如下-預(yù)變性93 'C~95 °C 2 min;變性93 °C~95 °C 30 s，退火58 °C~62 °C 30 s， 延伸72 °C 1 min共32個(gè)循環(huán)；延伸72 °C 5 min后60 'C保溫30 min， 4'C保存。
3、 一種權(quán)利要求l所述的快速診斷唐氏綜合征的方法，用以聯(lián)合應(yīng)用診斷唐 氏綜合征。
全文摘要
本發(fā)明是一種擴(kuò)增D21S1440、D21S11和PentaD STR基因座診斷唐氏綜合征的方法。該方法是擴(kuò)增21號(hào)染色體D21S1440、D21S11和PentaD STR基因座，測(cè)序膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶及面積的分析達(dá)到診斷唐氏綜合征的目的。本發(fā)明的方法與染色體核型分析相比具有以下優(yōu)點(diǎn)快速；靈敏度、特異度高；取材少；可以對(duì)大批量樣本同時(shí)進(jìn)行診斷，結(jié)果分析省時(shí)省力等。應(yīng)用QF-PCR擴(kuò)增STR基因座方法快速、精確度高、自動(dòng)進(jìn)樣和結(jié)果數(shù)據(jù)化等優(yōu)勢(shì)，是大規(guī)模產(chǎn)前診斷唐氏綜合征的理想工具。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101492730SQ20081015292
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2008年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日 公開號(hào)200810152923.發(fā)明者史云芳, 璐 孫, 岳天孚, 穎 張, 張秀玲, 巖 李, 李曉洲, 侃 王 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院