專(zhuān)利名稱(chēng)：：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)，具體地說(shuō)是運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)來(lái)檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌，特別是食源性蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：蠟樣芽胞桿菌在自然界分布廣泛，常存在于土壤、灰塵和污水中，植物和許多生熟食品中常見(jiàn)。己從多種食品中分離出該菌，包括肉、乳制品、蔬菜、魚(yú)、土豆、糊、醬油、布丁、炒米飯以及各種甜點(diǎn)等。在美國(guó)，炒米飯是引發(fā)蠟樣芽胞桿菌嘔吐型食物中毒的主要原因；在歐洲大都由甜點(diǎn)、肉餅、色拉和奶、肉類(lèi)食品引起；在我國(guó)主要與受污染的米飯或淀粉類(lèi)制品有關(guān)。蠟樣芽胞桿菌作為一種食源性疾病的報(bào)導(dǎo)較多，在各種食品中的檢出率也較高，如1982年犬飼等對(duì)閂本名古屋所采1641份食品樣品中，有193份檢出了該菌、陽(yáng)性率為11.8%;1984年我國(guó)有關(guān)單位對(duì)南京市所采211份食品樣品中，有81份檢出了該菌，陽(yáng)性率為38.4%。蠟樣芽胞桿菌食物中毒通常以夏秋季(6-10月)最高。引起中毒的食品常于食前由于保存溫度不當(dāng)，放置時(shí)間較長(zhǎng)或食品經(jīng)加熱而殘存的芽胞以生長(zhǎng)繁殖的條件，因而導(dǎo)致中毒。中毒的發(fā)病率較高，一般為60-100%。但也有在可疑食品中找不到蠟樣芽胞桿菌而引起食物中毒的情況，一般認(rèn)為是由于蠟桿芽胞桿菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)定毒素所致。1985年9月，美國(guó)緬因州的健康局報(bào)導(dǎo)了在一家日本餐館發(fā)生了食物中毒而導(dǎo)致的胃腸炎事件，經(jīng)調(diào)査所有的食品其加工和儲(chǔ)藏都是規(guī)范的，僅用剩飯制作的炒飯其是冷藏儲(chǔ)放還是在室溫放置說(shuō)不清楚，在炒飯中雖然找不到活的蠟樣芽胞桿菌，但是完全可能存在重新加熱過(guò)程中消除了活菌而沒(méi)有破壞熱穩(wěn)定毒素的可能性。當(dāng)攝入的食品其蠟樣芽胞桿菌數(shù)量達(dá)>106/克時(shí)?？蓪?dǎo)致食物中毒。蠟樣芽胞桿菌食物中毒在臨床上可分為嘔吐型和腹瀉型兩類(lèi)。嘔吐型的潛伏期為0.5-6小時(shí)，中毒癥狀以惡心、嘔吐為主，偶而有腹痙攣或腹瀉等癥狀，病程不超過(guò)24小時(shí)，這種類(lèi)型的癥狀類(lèi)似于由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒。腹瀉型的潛伏期為6-15小時(shí)，癥狀以水瀉、腹痙攣、腹痛為主，有時(shí)會(huì)有惡心等癥狀，病程約24小時(shí)，這種類(lèi)型的癥狀類(lèi)似于產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒。基于以上致病性，蠟樣芽胞桿菌是各國(guó)海關(guān)必檢微生物之一。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法按照《中華人民共和國(guó)專(zhuān)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——出口食品中蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)方法》檢驗(yàn)程序?yàn)?樣品制備1.1以無(wú)菌操作滅菌刀、剪將樣品剪碎。稱(chēng)取50g放于無(wú)菌均質(zhì)杯中。1.2加450ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖稀釋液于均質(zhì)杯中以18000—20000rpm均質(zhì)2min。制成1:10樣品稀釋液。1.3取l:10稀釋液10ml加到含有90ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液的稀釋瓶中，充分混勻制成1:100的稀釋液。1.4每個(gè)稀釋度換用l支10ml無(wú)菌吸管，按上述操作程序進(jìn)行10倍遞增稀釋直至1(T6。2檢驗(yàn)步驟2.1平板計(jì)數(shù)法2丄1取各稀釋液0.1ml接種到MYP瓊脂平板上。用無(wú)菌L形玻璃棒均勻涂布于整個(gè)瓊脂表面。每稀釋度接種兩個(gè)MYP瓊脂平板。2丄2將平板置于3(TC培養(yǎng)24h。2丄3選取具有15—150個(gè)典型或可疑蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，進(jìn)行計(jì)數(shù)。并計(jì)算同一稀釋度兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)。蠟樣芽胞桿菌在MYP瓊脂平板上生成的菌落為微粉紅色，環(huán)繞產(chǎn)生卵磷脂酶沉淀環(huán)。如反應(yīng)不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)24h再計(jì)數(shù)。2丄4計(jì)數(shù)后，從每個(gè)平板至少選取5個(gè)已計(jì)數(shù)的菌落分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，于3(TC培養(yǎng)24h，并按3中進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)。2丄5根據(jù)證實(shí)試驗(yàn)確定為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)，按比例計(jì)算出該皿內(nèi)的蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)再乘以10，即得到每克樣品所含蠟樣芽胞桿菌數(shù)并作出報(bào)告。2.2最近似值(MPN)法適用于污染蠟樣芽胞桿菌數(shù)不大于103個(gè)&的食品。2.2.1選用三管法MPN系列。取10-1、10-2、10-3三種稀釋液，每種稀釋液接種3管胰酪胨大豆多粘菌素肉湯，每管接種lml。2.2.2置于30。C培養(yǎng)48士2h。2.2.3從長(zhǎng)菌的試管取培養(yǎng)物劃線接種于MYP瓊脂平板上。2.2.4置30。C培養(yǎng)24—48h。2.2.5從MYP瓊脂平板上挑取粉紅色繞有沉淀環(huán)的單個(gè)菌落，接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置3(TC培養(yǎng)24h，供作證實(shí)試驗(yàn)。2.2.6根據(jù)證實(shí)試驗(yàn)確定為蠟樣芽胞桿菌的管數(shù)，由MPN表査出蠟樣芽胞桿菌的MPN值/g，并作出報(bào)告。3證實(shí)試驗(yàn)3.1形態(tài)觀察取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，作革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽(yáng)性大桿菌，呈短鏈或長(zhǎng)鏈，芽孢呈橢圓形位于菌體中央或偏端，不使菌體脹大。3.2生化學(xué)性狀3.2.1葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)接種于酚紅葡萄糖肉湯中，于厭氧條件下35。C培養(yǎng)24h。培養(yǎng)基應(yīng)由紅色變?yōu)辄S色(表明本菌在厭氧條件下分解葡萄糖產(chǎn)酸)。3.2.2硝酸鹽還原試驗(yàn)接種于硝酸鹽肉湯中35'C培養(yǎng)24h。加硝酸鹽試劑后應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(橙色)。3.2.3V-P試驗(yàn)接種于改良V-P培養(yǎng)基中，35"培養(yǎng)48h。加V-P試劑及肌酸數(shù)位，靜止lh。應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)(出現(xiàn)伊紅色)。3.2.4L-酪氨酸分解試驗(yàn)接種于L-酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，35'C培養(yǎng)48h，菌落周?chē)囵B(yǎng)基應(yīng)出現(xiàn)澄清透明區(qū)(表示產(chǎn)生酪蛋白酶)。陰性時(shí)應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)72h再觀察。3.2.5溶菌酶試驗(yàn)用直徑2mm接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種溶菌酶肉湯中，35'C培養(yǎng)24h。該菌在本培養(yǎng)基(含0.001%的溶菌酶)中能生長(zhǎng)。如出現(xiàn)陰性反應(yīng)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24h。3.2.6卵磷脂酶試驗(yàn)接種于MYP瓊脂平板上，35'C培養(yǎng)24h。菌落周?chē)鷳?yīng)出現(xiàn)沉淀環(huán)(表示產(chǎn)生卵磷脂酶)。目前細(xì)菌鑒定通常還是利用傳統(tǒng)生理生化方法進(jìn)行檢測(cè)，利用傳統(tǒng)的方法檢測(cè)食品中的蠟樣芽胞桿菌，不僅需要至少3天的時(shí)間進(jìn)行菌落培養(yǎng)，更要消耗大量的人力和物力，現(xiàn)在已經(jīng)越來(lái)越無(wú)法滿(mǎn)足進(jìn)出口貨物日益增長(zhǎng)的現(xiàn)狀。從以上說(shuō)明可以看出，檢測(cè)食品中蠟樣芽胞桿菌的各種現(xiàn)存方法，存在著過(guò)程復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確性低的不足，就是存在試劑昂貴，不利于快速檢驗(yàn)的缺點(diǎn)。因此，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，化妝品檢驗(yàn)檢疫工作中的細(xì)菌鑒定方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的簡(jiǎn)單生化實(shí)驗(yàn)水平上向分子生物學(xué)的方法如PCR、探針雜交等技術(shù)的發(fā)展。最新開(kāi)發(fā)出來(lái)的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種更為高效的分子檢測(cè)方法，己經(jīng)被很多國(guó)家認(rèn)同，并大力發(fā)展。它不僅需要的時(shí)間短，只要經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的增菌，而且，由于其要求的設(shè)備簡(jiǎn)單，一個(gè)熱塊或水浴鍋即可完成檢驗(yàn)，更加突出的是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)最初模版量的要求為10G個(gè)細(xì)菌，是普通PCR技術(shù)靈敏度的10倍。因此如何運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)食品中的蠟樣芽胞桿菌已成為食品檢驗(yàn)檢疫工作中進(jìn)行攻關(guān)的重要課題。
發(fā)明內(nèi)容為了提高食品檢測(cè)效率，節(jié)約時(shí)間，以解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法滿(mǎn)足進(jìn)出口貨物日益增長(zhǎng)的現(xiàn)狀，本發(fā)明經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，終于探索出一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌的方法，該方法具有檢測(cè)快速、便捷、低成本等特點(diǎn)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(1)設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物用于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)；(2)整合各引物使之不相互干擾。(3)以引物序列組，擴(kuò)增待測(cè)樣品模板，進(jìn)行目的基因的特異性擴(kuò)增；(4)擴(kuò)增完畢后可通過(guò)短暫離心直接目測(cè)白色沉淀檢測(cè)結(jié)果，或通過(guò)電泳帶形分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明用特異性的引物組擴(kuò)增蠟樣芽胞桿菌，反應(yīng)后目測(cè)結(jié)果和電泳結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果。該方法包括應(yīng)用該方法檢測(cè)食源性蠟樣芽胞桿菌所使用的引物組和與之配套的擴(kuò)增反應(yīng)條件。其中所使用的引物組序列如下引物序列一GCAAGGCGTAGTGTATTGTGAA引物序列二CTCTATTACAGGTTACTCTGGAACAAGCCGAAAACTGAA引物序列三TCATCGCCTCTGACTGCCTA弓I物序列四TCAAATAATCGCAACACAGCTCAACCTCACAACCCGAA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量擴(kuò)增體系預(yù)混合物2X12.5pL引物序列一10pmol/L0.2nL引物序列二1(Htmol/LL6pL引物序列三lOpmol/L0.2nL引物序列四lOpmol/L1.6pLDNA樣品2pL雙蒸水6.9[iL總體積25環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增擴(kuò)增程序?yàn)?1).61°C1小時(shí)；(2).80°C10分鐘。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法包括(1).10，000Xg，5分鐘，室溫，可在試管底部見(jiàn)到白色沉淀；一(2).加入顯色劑，反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色；(3).1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果有為階梯狀電泳條帶；選擇以上三種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法中的任意一種方法進(jìn)行檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)理論依據(jù)1、陽(yáng)性結(jié)果會(huì)產(chǎn)生白色沉淀在環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中，dNTP不斷添加進(jìn)新合成的核苷酸鏈，同時(shí)會(huì)生成大量的副產(chǎn)物——焦磷酸鎂。焦磷酸鎂是一種白色沉淀物，由于整個(gè)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)都是在6rc進(jìn)行，所以焦磷酸鎂沉淀無(wú)法溶解，最終，隨著陽(yáng)性核苷酸鏈的增加，焦磷酸鎂沉淀也不斷積累。從而，在反應(yīng)結(jié)束后，可以直接通過(guò)觀察白色沉淀而確定陽(yáng)性反應(yīng)。2、陽(yáng)性結(jié)果在加入SYBRGreen染料后，溶液變成綠色陽(yáng)性的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增會(huì)合成大量核苷酸鏈。反應(yīng)后，向陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBRGreen染料后，SYBRGreen分子會(huì)大量嵌入核苷酸鏈中，從而使SYBRGreen分子產(chǎn)生綠色熒光。而陰性結(jié)果，由于沒(méi)有目的基因片段，無(wú)法擴(kuò)增出核苷酸鏈，SYBRGreen也便無(wú)法同核苷酸鏈結(jié)合，結(jié)果只能是棕黃色。3、陽(yáng)性結(jié)果在電泳中表現(xiàn)為階梯狀電泳條帶環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增的弓I物設(shè)計(jì)有一至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，即在正常擴(kuò)增引物的5'末端結(jié)合了一段鏈內(nèi)配對(duì)區(qū)域。其目的在于，在擴(kuò)增進(jìn)行的同時(shí)，鏈內(nèi)配對(duì)區(qū)可以同新擴(kuò)增的核苷酸鏈中的某部區(qū)域配對(duì)，從而在新擴(kuò)增鏈的一端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同理，在新擴(kuò)增鏈的另一端，也可以形成相同的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。而在以后的擴(kuò)增過(guò)程中，引物會(huì)不斷地?cái)U(kuò)增這一段兩端成環(huán)的模板，從而不斷積累這一環(huán)狀單位的個(gè)數(shù)，使新合成核苷酸鏈分子以一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)為基數(shù)，不斷合成、不斷積累。而這一分子量的積累，反映在電泳中，則表現(xiàn)為形成階梯狀電泳條帶。如出現(xiàn)其它結(jié)果則表明此次檢驗(yàn)失敗不能確定是否存在蠟樣芽胞桿菌，需重新檢驗(yàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是相比傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法，基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增的鑒定方法適用于直接從患者含菌體液、食品和體液培養(yǎng)物等臨床樣品中擴(kuò)增靶基因，只需要一次環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)就能夠檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌是否存在，大大提高了效率節(jié)約了時(shí)間。相比較其它PCR方法，本方法僅需要簡(jiǎn)單的設(shè)備--個(gè)恒溫水域箱、一個(gè)離心機(jī)或普通電泳設(shè)備(電泳儀)即可，大大提高了性?xún)r(jià)比節(jié)約了成本。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定特異的目的細(xì)菌。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增鑒定方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確。圖1某待測(cè)鮮雞肉樣品環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)待測(cè)樣品DNA，離心后目測(cè)沉淀結(jié)果待測(cè)樣品試管(右側(cè))底部可見(jiàn)明顯白色沉淀；陰性對(duì)照(左側(cè))沒(méi)有沉淀。圖2某待測(cè)鮮雞肉樣品環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)待測(cè)樣品DNA，SYBRGreen染色結(jié)果待測(cè)樣品溶液(右側(cè))呈現(xiàn)綠色；陰性對(duì)照(左側(cè))為棕黃色。圖3某待測(cè)鮮雞肉樣品環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)待測(cè)樣品DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果待測(cè)樣品(第3道)出現(xiàn)階梯狀條帶；陰性對(duì)照(第2道)沒(méi)有條帶；第1道為Marker。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩詳細(xì)描述。樣本某處出口鮮雞肉。用常規(guī)生理、生化方法檢測(cè)出蠟樣芽胞桿菌落，然后進(jìn)行如下環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎。(2)將樣品放于裝有l(wèi)升營(yíng)養(yǎng)肉湯的錐形瓶中，培養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)8小時(shí)。2.DNA抽提用滴管取培養(yǎng)后的營(yíng)養(yǎng)肉湯lmL，在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心IO分鐘，取上清液，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄掉上清液，向沉淀中加入5(^l細(xì)菌裂解液，沸水浴10分鐘，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，取上清液置-20。C保存。成分濃度加樣量擴(kuò)增體系預(yù)混合物2X12.5nL引物序列一10pmol/L0.2nL引物序列二1Onmol/L1.6pL引物序列三10pmol/L0.2pL引物序列四10pmol/L1.6pLDNA樣品2pL雙蒸水6.9pL總體積25環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增程序?yàn)?1)61°C1小時(shí)；(2)80°CIO分鐘。反應(yīng)在恒溫水浴箱中進(jìn)行。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增共進(jìn)行2管反應(yīng)，其中一管中加入樣品DNA;另一管為無(wú)樣品DNA的反應(yīng)體系，作為陰性對(duì)照。4.對(duì)被檢測(cè)樣品結(jié)果進(jìn)行觀察(1)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物離心后，待測(cè)樣品試管底部有明顯白色沉淀，陰性對(duì)照則沒(méi)有沉淀，結(jié)果如圖l。(2)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物加入SYBRGreen染色后，待測(cè)樣品溶液呈現(xiàn)綠色，陰性對(duì)照為棕黃色，結(jié)果如圖2。(3)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，待測(cè)樣品有階梯狀電泳條帶，陰性對(duì)照沒(méi)有電泳條帶，結(jié)果如圖3?？梢赃x擇以上三種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法中的任意一種方法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有蠟樣芽胞桿菌。'3天后，通過(guò)常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為蠟樣芽胞桿菌。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測(cè)結(jié)果一致。權(quán)利要求1.一種檢驗(yàn)食品中蠟樣芽胞桿菌的引物，其特征在于正向引物F3的3’末端位于如序列引物序列一所示的16S-23S間區(qū)基因編碼區(qū)上游約50bp處，正向成環(huán)引物FIP的3’末端位于如序列引物序列二所示的16S-23S間區(qū)35bp處，反向成環(huán)引物BIP的3’末端位于如序列引物序列四所示的16S-23S間區(qū)204bp處，反向引物B3的3’末端位于如序列引物序列三所示的16S-23S間區(qū)下游50bp處。正向引物序列F3、正向成環(huán)引物FIP和反向引物序列B3、反向成環(huán)引物BIP的長(zhǎng)度范圍在16-40bp，并能完全擴(kuò)增蠟樣芽胞桿菌16S-23S間區(qū)編碼序列。2..根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其中正向引物F3選自具有如引物序列一所示的引物序列；正向成環(huán)引物FIP選自具有如引物序列二所示的引物序列；反向引物B3選自具有如引物序列三所示的弓I物序列；反向成環(huán)引物BIP選自具有如引物序列四所示的引物序列。3.權(quán)利要求1或2所述的引物在制備用于檢驗(yàn)食品中蠟樣芽胞桿菌的試劑盒中的應(yīng)用。4.一種用于檢驗(yàn)食品中蠟樣芽胞桿菌的試劑盒，包括(1)環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑，包括2X擴(kuò)增體系預(yù)混合物、三蒸水；(2)按照1:8:1:8比例混合的權(quán)利要求1或2所述的正向引物F3、正向成環(huán)引物FTP、反向引物B3和反向成環(huán)引物BIP;(3)陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照、陰性標(biāo)本對(duì)照；如果需要，還包括(4)使用說(shuō)明書(shū)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中還包括用于處理樣品的細(xì)菌裂解液和顯示結(jié)果的顯色劑。6.利用權(quán)利要求1-2的引物或權(quán)利要求4-5的試劑盒進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR檢測(cè)食品中蠟樣芽胞桿菌方法，包括(1)待測(cè)樣品加入營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱中30'C培養(yǎng)8小時(shí)，待分析樣品營(yíng)養(yǎng)液混濁液，室溫下3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心IO分鐘，取上清液，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄掉上清液，向沉淀中加入50u1細(xì)菌裂解液，沸水浴10分鐘，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，取上清液。(2)按照擴(kuò)增反應(yīng)液中各組分比例配制反應(yīng)液，如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>(3)調(diào)整擴(kuò)增溫度，恒溫水浴或熱塊擴(kuò)增1小時(shí)。(4)8CTC，十分鐘停止反應(yīng)。(5)根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR技術(shù)檢測(cè)食品中蠟樣芽胞桿菌的方法，其特征在于，環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及判定方法為①10，000Xg，5分鐘，室溫，可在試管底部見(jiàn)到白色沉淀。②加入SYBRGreen，反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色。③l.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果有為階梯狀電泳條帶。選擇以上三種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法中的任意一種方法進(jìn)行檢測(cè)。7.權(quán)禾腰求6戶(hù);M方法，其中待測(cè)樣品可以是肉、奶、魚(yú)、蝦、蟹、麟、tK果、糧條各種食物的生、熟制品或半成品。8.權(quán)利要求6戶(hù)腿方法，其中環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增的鵬為60-65。C。9.權(quán)利要求1或6戶(hù)皿方法，其中四種引物序列，包括(1)引物序列一GCAAGGCGTAGTGTATTGTGAA(2)引物序列二CTCTATTACAGGTTACTCTGGAACAAGCCGAAAACTGAA(3)引物序列三TCATCGCCTCTGACTGCCTA(4)弓I物序歹U四TCAAATAATCGCAACACAGCTCAACCTCACAACCCGAA10.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)JM的試劑盒在檢測(cè)食品中蠟樣芽胞桿菌方面的用途。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR技術(shù)檢測(cè)食源性蠟樣芽胞桿菌的方法，屬于食品衛(wèi)生領(lǐng)域，具體涉及一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR技術(shù)檢測(cè)食源性蠟樣芽胞桿菌的方法。其技術(shù)方案是以蠟樣芽胞桿菌16S-23S間區(qū)為目的檢測(cè)序列，設(shè)計(jì)涵蓋整個(gè)間區(qū)序列的四條特異性引物。本發(fā)明包括四條蠟樣芽胞桿菌16S-23S間區(qū)特異性引物、食源蠟樣芽胞桿菌的提取以及環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR擴(kuò)增的檢測(cè)方法以及結(jié)果的判斷。本發(fā)明填補(bǔ)了食源蠟樣芽胞桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法的空白，用于檢驗(yàn)進(jìn)出口食品中蠟樣芽胞桿菌。該方法具有低成本、高效率、操作簡(jiǎn)單、快速便捷的特點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101402997SQ200810152850公開(kāi)日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月6日優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日發(fā)明者侯麗萍,偉劉,張宏偉,宏趙,趙玉龍,趙良娟,鄭文杰,煜閻申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)天津出入境檢驗(yàn)檢疫局