本發(fā)明屬于食品衛(wèi)生安全快速檢測(cè)領(lǐng)域。涉及微流控芯片快速檢測(cè)技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatedisothermalamplification，lamp）技術(shù)；涉及大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌五種食源性致病菌特定基因保守序列具有的特異性引物和引物組；還涉及將引物和引物組用于等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌五種食源性致病菌的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

近年來我國(guó)食品安全頻頻出現(xiàn)問題，由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全的最主要的因素之一。常見細(xì)菌性食物中毒的病原微生物有：致病性大腸桿菌（特別是出血性大腸桿菌o157:h7）；沙門氏菌屬；志賀氏菌；致病性弧菌（包括：霍亂弧菌、副溶血性弧菌）；金黃色葡萄球菌及其腸毒素；近年來發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致細(xì)菌性食物中毒的微生物越來越多，包括單核增生李斯特菌、空腸彎曲菌等。

食源性致病菌檢測(cè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中主要檢測(cè)方法為培養(yǎng)法、ellisa法和pcr法。其中培養(yǎng)法是采用最廣泛的方法，結(jié)果準(zhǔn)確。但耗時(shí)多，操作復(fù)雜，人員需要專業(yè)訓(xùn)練。ellisa法操作步驟較多，敏感性不佳，容易出現(xiàn)假陰性。

pcr技術(shù)從誕生至今已經(jīng)30多年，期間不斷發(fā)展和突破。本發(fā)明使用的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatedisothermalamplification）技術(shù)(國(guó)際專利號(hào)w000/28082)是2000年由notomi等開發(fā)的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)使用一種在65℃恒溫條件具有鏈置換活性的dna聚合酶，催化針對(duì)靶基因6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的6條特異性引物以靶基因?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸與hnb（羥基萘酚藍(lán)）發(fā)生顯色反應(yīng)。該方法特異性和敏感性都優(yōu)于傳統(tǒng)pcr技術(shù)，并且恒溫?cái)U(kuò)增，對(duì)儀器無特殊要求。檢測(cè)速度快，結(jié)果易讀。

微流控芯片采用類似半導(dǎo)體的微機(jī)電加工技術(shù)在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng)，將實(shí)驗(yàn)與分析過程轉(zhuǎn)載到由彼此聯(lián)系的路徑和液相小室組成的芯片結(jié)構(gòu)上，加載生物樣品和反應(yīng)液后，采用微機(jī)械泵、電水力泵和電滲流等方法驅(qū)動(dòng)芯片中緩沖液的流動(dòng)，形成微流路，于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng)。激光誘導(dǎo)熒光、電化學(xué)和化學(xué)等多種檢測(cè)系統(tǒng)以及與質(zhì)譜等分析手段結(jié)合的很多檢測(cè)手段已經(jīng)被用在微流控芯片中，對(duì)樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和高通量分析。微流控芯片的最大特點(diǎn)是在一個(gè)芯片上可以形成多功能集成體系和數(shù)目眾多的復(fù)合體系的微全分析系統(tǒng)。它的目標(biāo)是把整個(gè)化驗(yàn)室的功能,包括采樣、稀釋、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等集成在微芯片上。具有檢測(cè)通量高、樣品量和試劑消耗量小、污染小、成本低、且便攜等諸多優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是提供一種五種食源性病原菌微流控芯片快速檢測(cè)試劑盒，用來克服現(xiàn)在沒有類似相同功能產(chǎn)品的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種五種食源性病原菌微流控芯片快速檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括擴(kuò)增反應(yīng)液、微流控芯片陣列、陰性對(duì)照物和陽(yáng)性對(duì)照物，其中所述微流控芯片陣列設(shè)有大腸桿菌o157:h7檢測(cè)芯片、金黃色葡萄球菌檢測(cè)芯片、沙門氏菌檢測(cè)芯片、單增李斯特菌檢測(cè)芯片、副溶血弧菌檢測(cè)芯片、陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)芯片、陰性對(duì)照檢測(cè)芯片；所述大腸桿菌o157:h7檢測(cè)芯片上設(shè)有大腸桿菌o157:h7引物組，所述金黃色葡萄球菌檢測(cè)芯片上設(shè)有金黃色葡萄球菌引物組，所述沙門氏菌檢測(cè)芯片上設(shè)有沙門氏菌引物組，所述單增李斯特菌檢測(cè)芯片上設(shè)有單增李斯特菌引物組，所述副溶血弧菌檢測(cè)芯片上設(shè)有副溶血弧菌引物組；所述陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)芯片和所述陰性對(duì)照檢測(cè)芯片上同時(shí)設(shè)有大腸桿菌o157:h7引物組、金黃色葡萄球菌引物組、沙門氏菌引物組、單增李斯特菌引物組、副溶血弧菌引物組。通過一個(gè)試劑盒可以同時(shí)快速的對(duì)5種腸道菌進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述大腸桿菌o157:h7引物組由下列引物成：

正向外引物f3gctataccacgttacattttg

反向外引物b3actactcaaccttcccaccttc

正向內(nèi)引物fipgctctttaaacagactgcacattcgttgactaaatcttatctgg

反向內(nèi)引物bipctactacagctgaagctttacgcgaaatccccttacaatttgcc

正向環(huán)引物lfaggttccgctattcagcattaaat。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述金黃色葡萄球菌引物組由下列引物成：

正向外引物f3gtacggttacagatagcatg

反向外引物b3gaaaggcattacgagttcttga

正向內(nèi)引物fipgtttcataaccttcagcaagctttccatacagtcattttcaaga

反向內(nèi)引物bipaaagtcattgcagcttgcttacttcgatcactggacgacg

正向環(huán)引物lfaactcatagtttacaaca

反向環(huán)引物lbgtaaatttaatgaaagtgttca。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述單增李斯特菌引物組由下列引物構(gòu)成：

正向外引物f3acgtttccccggttactgt

反向外引物b3attccttctgaacctttgg

正向內(nèi)引物fipcataataatcggcttcaatcacgctctttaatctggcatt

反向內(nèi)引物bipgccacgttcgggcaattcgttaaaactggattaccttgaca

正向環(huán)引物lfagacggctccaactgatcg

反向環(huán)引物lbatagcctttatttgggtt。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述副溶血弧菌引物組由下列引物構(gòu)成：

正向外引物f3agctaacccaaagatgatcc

反向外引物b3ggttgtatgagaacctaattg

正向內(nèi)引物fipatggacctaaatgaaacggagctcctttaaaaaacgaagatggt

反向內(nèi)引物bipacgtcgcacggcgttatccgtttaagaacgtaatgtctg

正向環(huán)引物lfaccagtagaaatcaatg

反向環(huán)引物lbttagattttacgaacgaga。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述沙門氏菌引物組由下列引物構(gòu)成：

正向外引物f3acgtttccccggttactgt

反向外引物b3attccttctgaacctttgg

正向內(nèi)引物fipcataataatcggcttcaatcacgctctttaatctggcatt

反向內(nèi)引物bipgccacgttcgggcaattcgttaaaactggattaccttgaca

正向環(huán)引物lfagacggctccaactgatcg

反向環(huán)引物lbatagcctttatttgggtt。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述擴(kuò)增反應(yīng)液中包含以下成份：20mmtris-hcl緩沖液，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.8mbetaine，0.001tween20、150μmhnb、2-6mmmgso4、1-1.6mmdntps、0.16-0.64u/μl鏈取代dna聚合酶、ddh2o。

betaine，俗稱甜菜堿。無色柱狀結(jié)晶。熔點(diǎn)293℃（分解）。能溶于水和醇。微溶于乙醚。易潮解，有甜味。在濃氫氧化鉀中生成三甲胺。飼料級(jí)無水甜菜堿可用作飼料添加劑，是天然高效甲基供體，能部分代替蛋氨酸和氯化膽堿，降低飼料成本，減少豬背膘，提高瘦肉率和胴體品質(zhì)。它的另外一個(gè)重要的功能是滲透壓調(diào)節(jié)劑。在醫(yī)藥保健方面，甜菜堿具有保護(hù)腎臟、抗脂肪肝、明目和治療動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的作用。來源是從甜菜制糖母液中回收，也可用合成法生產(chǎn)。

tris-hcl緩沖液（0.05mol/l，25℃），中文別名：三（羥甲基）氨基甲烷，tris緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，還有許多重要用途。tris被用于不同ph條件下的蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)。tris緩沖液的低離子強(qiáng)度特點(diǎn)可用于線蟲（c.elegans）核纖層蛋白（lamin）的中間纖維的形成。tris也是蛋白質(zhì)電泳緩沖液的主要成分之一，其在電泳緩沖液中與甘氨酸構(gòu)成緩沖體系，穩(wěn)定電泳過程中的ph。此外，tris還是制備表面活性劑、硫化促進(jìn)劑和一些藥物的中間物。tris也被用作滴定標(biāo)準(zhǔn)物。作為蛋白緩沖液時(shí)，若后續(xù)工作需要質(zhì)譜，則不適宜用tris，最好換成其他質(zhì)譜儀可耐受的緩沖液。

kcl是指氯化鉀；式量74.560。無色立方晶體，常為長(zhǎng)柱狀。密度1.984克/厘米3。熔點(diǎn)770℃，于1500℃升華。溶于水，溶解度為34.7g（20℃）。易溶于甘油及堿類，微溶于乙醇，但不溶于無水乙醇、乙醚。有吸濕性，易結(jié)塊。在水中的溶解度隨溫度的升高而迅速地增加，與鈉鹽常起復(fù)分解作用而生成新的鉀鹽。

(nh4)2so4是指硫酸銨，它是一種無色結(jié)晶或白色顆粒。無氣味。280℃以上分解。水中溶解度：0℃時(shí)70.6g，100℃時(shí)103.8g。不溶于乙醇和丙酮。0.1mol/l水溶液的ph為5.5。相對(duì)密度1.77。折光率1.521。硫酸銨主要用作肥料，適用于各種土壤和作物。還可用于紡織、皮革、醫(yī)藥等方面。

tween20是指吐溫20，它是山梨醇及其一失水、雙失水化合物與月桂酸酯按每摩爾山梨醇及其脫水化合物與約20摩爾的環(huán)氧乙烷在堿性條件下縮合而制得。酯化用的月桂酸中可能含有其它脂肪酸。

dntps是指脫氧核苷酸的意思，n是指a,t,g,c四中的任意。一般是做pcr的時(shí)候加的合成鏈的原料，是核酸鏈的單元。

dna聚合酶（dnapolymeras，ec編號(hào)2.7.7.7）是一種參與dna復(fù)制的酶。它主要是以模板的形式，催化去氧核糖核苷酸的聚合。聚合后的分子將會(huì)組成模板鏈并再進(jìn)一步參與配對(duì)。dna聚合酶以去氧核苷酸三磷酸（datp、dctp、dgtp、或dttp，四者統(tǒng)稱dntps）為底物，沿模板的3'→5'方向，將對(duì)應(yīng)的去氧核苷酸連接到新生dna鏈的3'端，使新生鏈沿5'→3'方向延長(zhǎng)。新鏈與原有的模板鏈序列互補(bǔ)，亦與模板鏈的原配對(duì)鏈序列一致。

本方案中dna聚合酶優(yōu)選采用bstdna聚合酶，其乃是將bacillusstearothermophilus中的聚合酶基因，保留了5’至3’聚合酶(pol)的片段，但是去除5’至’外切酶(exo)基因片段而成的largefragment。本酵素最主要的特性是具有超強(qiáng)的股取代能力（stranddisplacement）。因此在不具有5’-3’外切酶活性的情況下，因阻礙到前端聚合反應(yīng)而被取代釋出的一股並不會(huì)被水解。這種被釋出的單股dna具有可被專一性引子(primer)辨識(shí)與做為模板的功能，因此許多恆溫增幅的反應(yīng)，包含lamp（loop-mediatedisothermalamplification）與rca(rollingcircleamplification)反應(yīng)，都是利用這種原理而設(shè)計(jì)，也因此bstdna聚合酶自然就成為這類型反應(yīng)中酵素的首選。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于前述試劑盒的檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：

步驟a：模版提取步驟，所述模版提取步驟系將食品樣品標(biāo)本分份使用相應(yīng)腸道增菌液培養(yǎng)8-12小時(shí)后離心，棄上清液后用dna提取試劑盒提取模板dna或加三蒸水煮沸后取上清液做待檢模板dna；

步驟b：樣品制備步驟，所述樣品制備步驟系按比例將擴(kuò)增反應(yīng)液與待測(cè)模版dna混合；

步驟c：測(cè)試步驟，所述測(cè)試步驟系將步驟b配制好的各樣品分別放入對(duì)應(yīng)微流控芯片中，并將陽(yáng)性對(duì)照物和陰性對(duì)照物放入對(duì)照物微流控芯片中。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述步驟b中樣品總體積為20-100μl，其中步驟a中獲得的待測(cè)模版dna體積為1-10μl，其余為擴(kuò)增反應(yīng)液。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：步驟c中每個(gè)微流控芯片含有對(duì)應(yīng)引物組，引物組中fip和bip引物濃度為40μm，f3和b3引物濃度5μm，lf和lb引物濃度20μm。

本發(fā)明通過提供五種針對(duì)大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌特定基因片段具有特異性的引物組，固定有上述引物組微流控芯片，及包含有上述擴(kuò)增反應(yīng)液的試劑盒對(duì)樣本中大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果是：本方案提供的五種食源性病原菌微流控芯片快速檢測(cè)技術(shù)及試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可解決食源性病原體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層普及應(yīng)用難題；特別是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及戰(zhàn)時(shí)野外應(yīng)用。同時(shí)，還擁有試劑消耗量小、污染小、成本低、且便攜等諸多優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

為了更清楚地說明本申請(qǐng)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本申請(qǐng)中記載的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的五種食源性病原菌微流控芯片快速檢測(cè)試劑盒的示意圖。

圖2為用圖1所示的基因芯片對(duì)大腸桿菌o157:h7進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)結(jié)果；陽(yáng)性對(duì)照和大腸桿菌o157:h7檢測(cè)孔出現(xiàn)擴(kuò)增，軟件判定為大腸桿菌o157:h7陽(yáng)性。

圖3為用圖1所示的基因芯片對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)結(jié)果；陽(yáng)性對(duì)照和金黃色葡萄球菌檢測(cè)孔出現(xiàn)擴(kuò)增，軟件判定為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性。

圖4為用圖1所示的基因芯片對(duì)沙門氏菌進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)結(jié)果；陽(yáng)性對(duì)照和沙門氏菌檢測(cè)孔出現(xiàn)擴(kuò)增，軟件判定為沙門氏菌陽(yáng)性。

圖5為用圖1所示的基因芯片對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)結(jié)果；陽(yáng)性對(duì)照和單增李斯特菌檢測(cè)孔出現(xiàn)擴(kuò)增，軟件判定為單增李斯特菌陽(yáng)性。

圖6為用圖1所示的基因芯片對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)結(jié)果；陽(yáng)性對(duì)照和副溶血弧菌檢測(cè)孔出現(xiàn)擴(kuò)增，軟件判定為副溶血弧菌陽(yáng)性。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種五種食源性病原菌微流控芯片快速檢測(cè)技術(shù)及試劑盒。以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于，提供大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌五種致病菌特異性片段檢測(cè)用引物組。

所述引物組包括大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌五種病原菌檢測(cè)用引物組，利用這些引物組能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增靶基因特異堿基序列，所述靶基因分別為：大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌，為所述引物與所述靶基因核苷酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。

所述引物組包含：

一種大腸桿菌o157:h7檢測(cè)用引物組，所述引物組由下列引物組成：

正向外引物f3gctataccacgttacattttg

反向外引物b3actactcaaccttcccaccttc

正向內(nèi)引物fipgctctttaaacagactgcacattcgttgactaaatcttatctgg

反向內(nèi)引物bipctactacagctgaagctttacgcgaaatccccttacaatttgcc

正向環(huán)引物lfaggttccgctattcagcattaaat

可以擴(kuò)增大腸桿菌o157:h7特異性序列。

一種金黃色葡萄球菌檢測(cè)用引物組，所述引物組由下列引物組成：

正向外引物f3gtacggttacagatagcatg

反向外引物b3gaaaggcattacgagttcttga

正向內(nèi)引物fipgtttcataaccttcagcaagctttccatacagtcattttcaaga

反向內(nèi)引物bipaaagtcattgcagcttgcttacttcgatcactggacgacg

正向環(huán)引物lfaactcatagtttacaaca

反向環(huán)引物lbgtaaatttaatgaaagtgttca

可以擴(kuò)增金黃色葡萄球菌特異性序列。

一種沙門氏菌檢測(cè)用引物組，所述引物組由下列引物組成：

正向外引物f3acgtttccccggttactgt

反向外引物b3attccttctgaacctttgg

正向內(nèi)引物fipcataataatcggcttcaatcacgctctttaatctggcatt

反向內(nèi)引物bipgccacgttcgggcaattcgttaaaactggattaccttgaca

正向環(huán)引物lfagacggctccaactgatcg

反向環(huán)引物lbatagcctttatttgggtt

可以擴(kuò)增沙門氏菌特異性序列。

一種單增李斯特菌檢測(cè)用引物組，所述引物組由下列引物組成：

正向外引物f3aagctgcttttgatgaaga

反向外引物b3cgattaaaagtaactactt

正向內(nèi)引物fipcgaatttgaaggaagaatttttgatcgtaagcttaaaatctgtct

反向內(nèi)引物biptacgacttttccgcaaaagattttcaaaatataacctaagtctc

反向環(huán)引物lbtgaagttcaaatcatcgattaa

可以擴(kuò)增單增李斯特菌特異性序列。

一種副溶血弧菌檢測(cè)用引物組，所述引物組由下列引物組成：

正向外引物f3agctaacccaaagatgatcc

反向外引物b3ggttgtatgagaacctaattg

正向內(nèi)引物fipatggacctaaatgaaacggagctcctttaaaaaacgaagatggt

反向內(nèi)引物bipacgtcgcacggcgttatccgtttaagaacgtaatgtctg

正向環(huán)引物lfaccagtagaaatcaatg

反向環(huán)引物lbttagattttacgaacgaga

可以擴(kuò)增副溶血弧菌特異性序列。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供針對(duì)大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌五種食源性致病菌特異性基因片段的專用微流控芯片。該微流控芯片上固定有上述五種引物組及陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品組成的陣列。圖1顯示了基因芯片的排布示意圖。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供利用上述不同引物組基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌的檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒至少包括含有擴(kuò)增反應(yīng)液及上述固定有上述引物組的基因芯片。該試劑盒的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

所述擴(kuò)增反應(yīng)液中包括如下試劑：

表1擴(kuò)增反應(yīng)液具體組分及濃度

所述bstdnapolymerase酶的原始濃度為為每微升含8-16個(gè)活性單位的bstdna聚合酶。

所述試劑盒還包括陰性及陽(yáng)性對(duì)照模板，所述陰性對(duì)照模板為雙蒸水；所述陽(yáng)性對(duì)照模板為普通大腸桿菌基因組dna(1?100nm)。

本發(fā)明同時(shí)請(qǐng)求保護(hù)所述五種食源性致病菌的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，該方法具體步驟為：

1）樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品標(biāo)本；食品細(xì)菌待檢標(biāo)本分別用相應(yīng)腸道增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時(shí)后，取1.0ml增菌10000rpm下離心2分鐘，棄其上清液后，用dna提取試劑盒提取模板dna或加20?30μl三蒸水煮沸5分鐘，再取2μl上清液做待檢模板dna。

2）將內(nèi)引物fip/bip稀釋到40μm，外引物f3/b3稀釋到5μm,環(huán)引物lf/lb稀釋到20μm,三對(duì)引物等比例混合，取1.2μl混合引物和0.8μl0.05%-5%瓊脂糖混合，將混合后的引物固定在芯片上。這一步操作在試劑盒出廠之前即已經(jīng)完成。

3）陽(yáng)性質(zhì)控品，用1×10⁵copy/μl的大腸桿菌基因組稀釋陽(yáng)性質(zhì)控品的所有引物，fip和bip引物濃度為40μm，f3和b3引物濃度5μm，lf和lb引物濃度20μm，各取0.2μl，0.05%-5%瓊脂糖0.8μl混合之后，點(diǎn)在相應(yīng)位置。

4）大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（lamp)。向擴(kuò)增反應(yīng)液中加入待檢模板，形成如下總體積為20μl?100μl的反應(yīng)體系。

表2反應(yīng)體系中具體組分及濃度（反應(yīng)總體積20μl-100μl）

振蕩混勻后離心，將離心后的上清液注入芯片，轉(zhuǎn)至等溫顯色檢測(cè)系統(tǒng)，溫度65℃進(jìn)行反應(yīng)，時(shí)間60min。

5）lamp反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)

檢測(cè)：與陰性對(duì)照孔比較，檢測(cè)孔在等溫顯色檢測(cè)系統(tǒng)上有s形曲線判定為陽(yáng)性。在等溫顯色檢測(cè)系統(tǒng)上未見s形曲線為陰性。

下面通過具體的大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌檢測(cè)過程通過基因芯片來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，如無特別說明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例一

1引物制備

通過查閱文獻(xiàn)和用blast軟件分析篩選出大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌特異性基因的核酸片段設(shè)計(jì)出lamp引物并合成，得到如下的引物：

大腸桿菌o157:h7

序列編號(hào)1

正向外引物f3gctataccacgttacattttg

序列編號(hào)2

反向外引物b3actactcaaccttcccaccttc

序列編號(hào)3

正向內(nèi)引物fipgctctttaaacagactgcacattcgttgactaaatcttatctgg

序列編號(hào)4

反向內(nèi)引物bipctactacagctgaagctttacgcgaaatccccttacaatttgcc

序列編號(hào)5

正向環(huán)引物lfaggttccgctattcagcattaaat

金黃色葡萄球菌

序列編號(hào)6

正向外引物f3gtacggttacagatagcatg

序列編號(hào)7

反向外引物b3gaaaggcattacgagttcttga

序列編號(hào)8

正向內(nèi)引物fipgtttcataaccttcagcaagctttccatacagtcattttcaaga

序列編號(hào)9

反向內(nèi)引物bipaaagtcattgcagcttgcttacttcgatcactggacgacg

序列編號(hào)10

正向環(huán)引物lfaactcatagtttacaaca

序列編號(hào)11

反向環(huán)引物lbgtaaatttaatgaaagtgttca

沙門氏菌

序列編號(hào)12

正向外引物f3acgtttccccggttactgt

序列編號(hào)13

反向外引物b3attccttctgaacctttgg

序列編號(hào)14

正向內(nèi)引物fipcataataatcggcttcaatcacgctctttaatctggcatt

序列編號(hào)15

反向內(nèi)引物bipgccacgttcgggcaattcgttaaaactggattaccttgaca

序列編號(hào)16

正向環(huán)引物lfagacggctccaactgatcg

序列編號(hào)17

反向環(huán)引物lbatagcctttatttgggtt

單增李斯特菌

序列編號(hào)18

正向外引物f3aagctgcttttgatgaaga

序列編號(hào)19

反向外引物b3cgattaaaagtaactactt

序列編號(hào)20

正向內(nèi)引物fipcgaatttgaaggaagaatttttgatcgtaagcttaaaatctgtct

序列編號(hào)21

反向內(nèi)引物biptacgacttttccgcaaaagattttcaaaatataacctaagtctc

序列編號(hào)22

反向環(huán)引物lbtgaagttcaaatcatcgattaa

副溶血弧菌

序列編號(hào)23

正向外引物f3agctaacccaaagatgatcc

序列編號(hào)24

反向外引物b3ggttgtatgagaacctaattg

序列編號(hào)25

正向內(nèi)引物fipatggacctaaatgaaacggagctcctttaaaaaacgaagatggt

序列編號(hào)26

反向內(nèi)引物bipacgtcgcacggcgttatccgtttaagaacgtaatgtctg

序列編號(hào)27

正向環(huán)引物lfaccagtagaaatcaatg

序列編號(hào)28

反向環(huán)引物lbttagattttacgaacgaga

2基因芯片制備

芯片是由大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌所對(duì)應(yīng)五組引物，pc（陽(yáng)性質(zhì)控品）、nc（陰性質(zhì)控品）組成的陣列。

大腸桿菌o157:h7，fip和bip引物濃度為40μm，f3和b3引物濃度5μm，lf和lb引物濃度20μm，各取0.2μl，0.05%-5%瓊脂糖0.8μl混合之后，點(diǎn)在相應(yīng)位置，自然晾干。

金黃色葡萄球菌，fip和bip引物濃度為40μm，f3和b3引物濃度5μm，lf和lb引物濃度20μm，各取0.2μl，0.05%-5%瓊脂糖0.8μl混合之后，點(diǎn)在相應(yīng)位置，自然晾干。

沙門氏菌，fip和bip引物濃度為40μm，f3和b3引物濃度5μm，lf和lb引物濃度20μm，各取0.2μl，0.05%-5%瓊脂糖0.8μl混合之后，點(diǎn)在相應(yīng)位置，自然晾干。

單增李斯特菌，fip和bip引物濃度為40μm，f3和b3引物濃度5μm，lf和lb引物濃度20μm，各取0.2μl，0.05%-5%瓊脂糖0.8μl混合之后，點(diǎn)在相應(yīng)位置，自然晾干。

副溶血弧菌，fip和bip引物濃度為40μm，f3和b3引物濃度5μm，lf和lb引物濃度20μm，各取0.2μl，0.05%-5%瓊脂糖0.8μl混合之后，點(diǎn)在相應(yīng)位置，自然晾干。

陽(yáng)性質(zhì)控品，用1×10⁵copy/μl的大腸桿菌基因組稀釋所有引物，其中fip和bip引物濃度為40μm，f3和b3引物濃度5μm，lf和lb引物濃度20μm，各取0.2μl，0.05%-5%瓊脂糖0.8μl混合之后，點(diǎn)在相應(yīng)位置，自然晾干。

3核酸模版制備

在本具體實(shí)施例中，為了確定每種細(xì)菌的熒光曲線，我們先培養(yǎng)上述五種菌株的dna進(jìn)行測(cè)試。具體方法為大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌用相應(yīng)增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時(shí)后，取1.0ml增菌液10000rpm離心5分鐘，棄其上清液后，加100μlddh2o煮沸10分鐘，直接取2μl上清液作模板dna。圖2-6分別顯示了使用純細(xì)菌模版得到的曲線圖譜。

但是在真正的測(cè)試中并不需要此步驟，而是樣品將食品細(xì)菌待檢標(biāo)本分別用相應(yīng)腸道增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時(shí)后，取1.0ml增菌10000rpm下離心2分鐘，棄其上清液后，用dna提取試劑盒提取模板dna或加20?30μl三蒸水煮沸5分鐘，再取2μl上清液做待檢模板dna。

4基于lamp法的基因擴(kuò)增

取擴(kuò)增反應(yīng)液72μl，加入3μl待檢模板，形成如下表總體積為75μl的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如下：（反應(yīng)總體積為75μl）

表3反應(yīng)體系中各組分及濃度

在溫度為65℃的等溫顯色檢測(cè)系統(tǒng)上反應(yīng)60分鐘。

6擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

與陰性對(duì)照孔比較，檢測(cè)孔在等溫顯色檢測(cè)系統(tǒng)上有s形曲線判定為陽(yáng)性。在等溫顯色檢測(cè)系統(tǒng)上未見s形曲線為陰性。

本發(fā)明通過提供五種針對(duì)大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌特定基因片段具有特異性的引物組，固定有上述引物組微流控芯片，及包含有上述擴(kuò)增反應(yīng)液的試劑盒對(duì)樣本中大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑和檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可解決食源性病原體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層普及應(yīng)用難題；特別是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及戰(zhàn)時(shí)野外應(yīng)用。同時(shí)，還擁有試劑消耗量小、污染小、成本低、且便攜等諸多優(yōu)點(diǎn)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gctataccacgttacattttg21

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

actactcaaccttcccaccttc22

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gctctttaaacagactgcacattcgttgactaaatcttatctgg44

<210>4

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctactacagctgaagctttacgcgaaatccccttacaatttgcc44

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

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aggttccgctattcagcattaaat24

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<213>人工序列

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gtacggttacagatagcatg20

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<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gaaaggcattacgagttcttga22

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<212>dna

<213>人工序列

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gtttcataaccttcagcaagctttccatacagtcattttcaaga44

<210>9

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

aaagtcattgcagcttgcttacttcgatcactggacgacg40

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

aactcatagtttacaaca18

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gtaaatttaatgaaagtgttca22

<210>12

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

acgtttccccggttactgt19

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

attccttctgaacctttgg19

<210>14

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

cataataatcggcttcaatcacgctctttaatctggcatt40

<210>15

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

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gccacgttcgggcaattcgttaaaactggattaccttgaca41

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

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agacggctccaactgatcg19

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

atagcctttatttgggtt18

<210>18

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

aagctgcttttgatgaaga19

<210>19

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

cgattaaaagtaactactt19

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<212>dna

<213>人工序列

<400>20

cgaatttgaaggaagaatttttgatcgtaagcttaaaatctgtct45

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<212>dna

<213>人工序列

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tacgacttttccgcaaaagattttcaaaatataacctaagtctc44

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

tgaagttcaaatcatcgattaa22

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<212>dna

<213>人工序列

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agctaacccaaagatgatcc20

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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atggacctaaatgaaacggagctcctttaaaaaacgaagatggt44

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<212>dna

<213>人工序列

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acgtcgcacggcgttatccgtttaagaacgtaatgtctg39

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<212>dna

<213>人工序列

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accagtagaaatcaatg17

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ttagattttacgaacgaga19

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