本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于taqman-mgb探針檢測(cè)人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

分枝桿菌屬(mycobacterium)隸屬于細(xì)菌域，放線菌門，放線菌綱，放線菌目，棒桿菌亞目，分枝桿菌科。分枝桿菌種類可分為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌三類。結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis),是引起結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。據(jù)who報(bào)道，每年約有800萬(wàn)新病例發(fā)生，至少有300萬(wàn)人死于該病。人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)和結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)在流行上相互促進(jìn)。流行病學(xué)研究顯示，hiv是促進(jìn)結(jié)核病流行的動(dòng)力因子，結(jié)核病是aids患者最常見的機(jī)會(huì)性感染。2014年的hiv致死人數(shù)估計(jì)為120萬(wàn)人，其中包括hiv陽(yáng)性患者中的40萬(wàn)結(jié)核病死亡病例。2014年全年960萬(wàn)結(jié)核病新病例中有12％為hiv陽(yáng)性患者。在這960萬(wàn)結(jié)核病新病例中，58％發(fā)生在東南亞和西太平洋區(qū)域，非洲區(qū)域占有2014年全世界病例的28％，每10萬(wàn)人有281起病例，比全球133的平均值多一倍以上。印度、印度尼西亞和中國(guó)的病例數(shù)最多：分別占全球總數(shù)的23％、10％和10％。

近年來，艾滋病在全球流行后，非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculousmycobacteria,ntm)感染的發(fā)病率迅速上升。aids合并肺部ntm感染主要由鳥分枝桿菌復(fù)合物(mycobacteriumaviumcomplex,mac)所致，鳥分枝桿菌復(fù)合物主要包括鳥分枝桿菌(mycobacteriumavium)和胞內(nèi)分枝桿菌(mycobacteriumintracellulare)，屬于ⅲ型不產(chǎn)色的慢速生長(zhǎng)的非結(jié)核分枝桿菌，主要侵犯肺部。不僅能引起aids患者肺部感染，還能導(dǎo)致aids患者全身播散感染、淋巴結(jié)炎及皮膚感染。mac全身播散感染常伴貧血、發(fā)熱、盜汗和腹瀉等癥狀。有文獻(xiàn)報(bào)道ntm肺病具有與肺結(jié)核臨床表現(xiàn)相似的全身中毒癥狀和局部損害表現(xiàn)，在無(wú)菌種鑒定結(jié)果的情況下，可被誤診為肺結(jié)核病。涂片并不能區(qū)別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，只能依靠菌種培養(yǎng)鑒定，然而培養(yǎng)周期長(zhǎng)，一般長(zhǎng)達(dá)幾周，這給結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的鑒別帶來了阻礙。分子生物學(xué)鑒定方法有pcr-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(rflp)和dna分子雜交，但只能鑒定部分分枝桿菌，重復(fù)性差。

taqman-mgb探針法熒光定量pcr是利用taq酶的5’外切酶活性，依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成能與之特異性雜交的探針，探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)，taq酶可用外切酶活性，將熒光基團(tuán)從探針上切割下來，從而發(fā)出熒光，可根據(jù)pcr體系中的熒光強(qiáng)度計(jì)算初始dna模板的數(shù)量。而mgb是加在3’端的小溝結(jié)合物，可穩(wěn)定探針與模板的雜交，提高探針tm值。taqman-mgb熒光定量pcr技術(shù)在臨床病人病原菌檢測(cè)方面已經(jīng)起著不可或缺的作用，與傳統(tǒng)的方法相比，taqman-mgb熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、污染小，并逐漸應(yīng)用于多種病原菌的檢測(cè)中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種高度特異性、高敏感性、穩(wěn)定性好的taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的試劑盒及方法。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)以上目的，選取分枝桿菌的16srrna的基因(結(jié)核分枝桿菌基因序列g(shù)enbank號(hào)為cp016972.1，鳥分枝桿菌基因序列g(shù)enbank號(hào)為x52918.1，胞內(nèi)分枝桿菌基因序列g(shù)enbank號(hào)為nr_042165.1)為目標(biāo)序列。通過比對(duì)結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌基因序列，選擇在相同區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，分別擴(kuò)增出137bp，135bp，135bp的片段。在這片段中同時(shí)還具有特異性差異序列，在這部分區(qū)域進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)三條特異性鑒定分枝桿菌的探針，利用taqman探針熒光定量pcr技術(shù)建立檢測(cè)該菌的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法。

本發(fā)明提供用于檢測(cè)人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物和三條探針，

所述引物包括：

上游引物all-f:5’-gatgcctgggaaactgggtctaata-3’(seqno:1)

下游引物all-r:5’-cccgtcgtcgccttggtaggc-3’(seqno:2)

探針probetuber：5'-f-taggaccacgggatgcatg-q-3'(seqno:3)

探針probeavium：5'-f-taggacctcaagacgcatgtcttc-q-3'(seqno:4)

探針probeintra：5'-f-taggacctttaggcgcatgt-q-3'(seqno:5)

其中，f為熒光報(bào)告基團(tuán)，q為熒光淬滅基團(tuán)。

優(yōu)選地，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為fam，所述熒光淬滅基團(tuán)為mgb。

本發(fā)明還提供含有上述引物及探針的用于taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的試劑盒。所述試劑盒還包括dntps、taqdna聚合酶、mg²⁺、dmso、pcr反應(yīng)緩沖液等中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括人鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌及結(jié)合分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。

plb-tuber，plb-avium，plb-intra是提取的質(zhì)粒，作為結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，合成序列如下：

結(jié)核分枝桿菌合成序列(137bp)：

gcctgggaaactgggtctaataccggataggaccacgggatgcatgtcttgtggtggaaagcgctttagcggtgtgggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgacggcctaccaaggcgacgacggg(seqno:6)

鳥分枝桿菌合成序列(135bp)：

gcctgggaaactgggtctaataccggataggacctcaagacgcatgtcttctggtggaaagcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgacggcctaccaaggcgacgacggg(seqno:7)

胞內(nèi)分枝桿菌合成序列(135bp)：

gcctgggaaactgggtctaataccggataggacctttaggcgcatgtctttaggtggaaagcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacggg(seqno:8)

具體地，制備陽(yáng)性重組質(zhì)粒dna的過程如下：以結(jié)核分枝桿菌基因組dna或是鳥分枝桿菌基因組dna或是胞內(nèi)分枝桿菌基因組dna為模板，上游引物和下游引物按照常規(guī)方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與plb載體進(jìn)行連接反應(yīng)獲得所述陽(yáng)性重組質(zhì)粒；

本發(fā)明還提供taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的方法，其是利用all-f和all-r及探針probetuber、probeavium、probeintra，或所述試劑盒對(duì)人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌進(jìn)行taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)。

前述方法包括以下步驟：

(1)制備待檢模板dna：選用商品化的dna提取試劑盒，提取待檢測(cè)樣品中的基因組dna，獲得待檢測(cè)模板dna；

(2)擴(kuò)增反應(yīng)體系為：19μl分別含有探針probetuber、probeavium、probeintra的擴(kuò)增反應(yīng)液，1μl待檢模板dna或者陽(yáng)性對(duì)照或者陰性對(duì)照，反應(yīng)體系的總體積為20μl；

所述檢測(cè)體系中pcr反應(yīng)體系如下：

加ddh2o補(bǔ)齊至20μl

其中，plb-tuber，plb-avium，plb-intra是提取質(zhì)粒作為結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌的陽(yáng)性對(duì)照樣品；

(3)三種分枝桿菌屬熒光定量pcr擴(kuò)增：將配置好的步驟2)的擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行pcr反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10min；95℃15s，65℃1min，40個(gè)循環(huán)；在65℃1min進(jìn)行熒光信號(hào)采集；

(4)判斷：對(duì)擴(kuò)增曲線及ct值進(jìn)行分析。

本發(fā)明應(yīng)用目標(biāo)基因克隆的質(zhì)粒plb-tuber，plb-avium，plb-intra作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行了檢測(cè)方法評(píng)價(jià)，包括敏感性評(píng)價(jià)，特異性評(píng)價(jià)和重復(fù)性評(píng)價(jià)。

所述敏感性評(píng)價(jià)如下：以得到的結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒、鳥分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒、胞內(nèi)分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，以每個(gè)稀釋度的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)，以質(zhì)?？截悢?shù)的log值為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閾值ct值為縱坐標(biāo)，繪制結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取結(jié)核分枝桿菌(h37rv，武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院章曉聯(lián)贈(zèng))、鳥分枝桿菌(atcc700898)、胞內(nèi)分枝桿菌(atcc13950)標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組，梯度稀釋后，以稀釋后的基因組作為模板，進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)，將能檢測(cè)到熒光值的最大稀釋度對(duì)應(yīng)的ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到最低拷貝數(shù)。

所述特異性評(píng)價(jià)方法如下：以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組dna為模板，分別加入probetuber、probeavium、probeintra，以鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組dna為模板，分別加入probetuber、probeavium、probeintra，以胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組dna為模板，分別加入probetuber、probeavium、probeintra，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增曲線及ct值進(jìn)行分析。

所述重復(fù)性評(píng)價(jià)方法如下：

以同一批次梯度的，10⁴個(gè)拷貝數(shù)的結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；以不同批次的10⁵，10⁶個(gè)拷貝數(shù)的結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

以同一批次梯度的，10⁴個(gè)拷貝數(shù)的鳥分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；以不同批次的10⁵，10⁶個(gè)拷貝數(shù)的鳥分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；

以同一批次梯度的，10⁵個(gè)拷貝數(shù)的胞內(nèi)分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；以不同批次的10⁶，10⁷個(gè)拷貝數(shù)的胞內(nèi)分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

本發(fā)明選取16srrna的基因?yàn)槟繕?biāo)序列，基于該序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物與三條分別對(duì)結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌特異的taqman探針。應(yīng)用目標(biāo)基因克隆的質(zhì)粒plb-tuber，plb-avium，plb-intra作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行了敏感性、特異性和重復(fù)性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，三條探針均能特異性鑒別結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌；變異系數(shù)，無(wú)論是同一批次還是不同批次，均小于5％；結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低檢測(cè)拷貝數(shù)，lg1.939＝87copies；鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低檢測(cè)拷貝數(shù)，lg1.13＝14copies；胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低檢測(cè)拷貝數(shù)，lg3.34＝2187copies。該檢測(cè)系統(tǒng)特異性、敏感性、重復(fù)性均良好，適合臨床aids病人早期感染結(jié)核桿菌、鳥分枝桿菌-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合體的篩查工作。

附圖說明

圖1為三株菌株16srrna基因序列比對(duì)圖；

圖2為結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒梯度稀釋擴(kuò)增曲線圖，橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度；

圖3為結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低檢測(cè)稀釋度柱狀圖，橫軸為稀釋度，縱軸為循環(huán)閾值；

圖4為結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低拷貝數(shù)擴(kuò)增曲線圖，橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度；

圖5為結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，橫軸為質(zhì)粒拷貝數(shù)log值，縱軸為ct值；

圖6為鳥分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒梯度稀釋擴(kuò)增曲線圖，橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度；

圖7為鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低檢測(cè)稀釋度柱狀圖，橫軸為稀釋度，縱軸為循環(huán)閾值；

圖8為鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低拷貝數(shù)擴(kuò)增曲線圖，橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度；

圖9為鳥分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，橫軸為質(zhì)?？截悢?shù)log值，縱軸為ct值；

圖10為胞內(nèi)分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒梯度稀釋擴(kuò)增曲線圖，橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度；

圖11為胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低檢測(cè)稀釋度柱狀圖，橫軸為稀釋度，縱軸為循環(huán)閾值；

圖12為胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低拷貝數(shù)擴(kuò)增曲線圖，橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度；

圖13為胞內(nèi)分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，橫軸為質(zhì)?？截悢?shù)log值，縱軸為ct值；

圖14為結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖，橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度；

圖15為結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組特異性試驗(yàn)柱狀圖；

圖16為鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖，橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度；

圖17為鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組特異性試驗(yàn)柱狀圖；

圖18為胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖，橫軸為循環(huán)次數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度；

圖19為胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組特異性試驗(yàn)柱狀圖。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

【實(shí)施例1】taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的方法

1、材料

標(biāo)準(zhǔn)菌株：結(jié)核桿菌(m.tuberculosis，h37rv，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院章曉聯(lián)贈(zèng))，鳥分枝桿菌(m.avium，atcc700898)，胞內(nèi)分枝桿菌(m.intracellulare，atcc13950)。

2、主要儀器設(shè)備與試劑

kod高保真dna聚合酶(日本toyobo)

plb零背景快速克隆試劑盒(北京天根生化科技)

taqpcrmastermix(2×)(thermofisher)

去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(omegabio-tek)

瓊脂糖凝膠回收試劑盒(omegabio-tek)

細(xì)菌基因組提取試劑盒(roche)

abi7300熒光定量pcr儀(thermofisher公司)

3、靶基因篩選、引物與探針的設(shè)計(jì)與合成

通過比對(duì)結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌16srrna基因序列，選定一段區(qū)域作為靶基因，該部分基因序列大約在135bp左右。在該區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物及三條探針，具體的序列比對(duì)結(jié)果見附圖1。taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的檢測(cè)體系包括一對(duì)通用引物及三條taqman-mgb探針，引物和探針序列如下：

上游引物：all-f:5’-gatgcctgggaaactgggtctaata-3’

下游引物all-r:5’-cccgtcgtcgccttggtaggc-3’

探針probetuber：fam5'-taggaccacgggatgcatg-3'mgb

探針probeavium：fam5'-taggacctcaagacgcatgtcttc-3'mgb

探針probeintra：fam5'-taggacctttaggcgcatgt-3'mgb

4、標(biāo)準(zhǔn)品的制備

結(jié)核分枝桿菌合成序列：

gcctgggaaactgggtctaataccggataggaccacgggatgcatgtcttgtggtggaaagcgctttagcggtgtgggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgacggcctaccaaggcgacgacggg

鳥分枝桿菌合成序列：

gcctgggaaactgggtctaataccggataggacctcaagacgcatgtcttctggtggaaagcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgacggcctaccaaggcgacgacggg

胞內(nèi)分枝桿菌合成序列：

gcctgggaaactgggtctaataccggataggacctttaggcgcatgtctttaggtggaaagcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacggg

具體地，制備陽(yáng)性重組質(zhì)粒dna的過程如下：以結(jié)核分枝桿菌基因組dna或是鳥分枝桿菌基因組dna或是胞內(nèi)分枝桿菌基因組dna為模板，上游引物和下游引物按照常規(guī)方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與plb載體進(jìn)行連接反應(yīng)獲得所述陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的方法包括如下步驟：

(1)制備待檢模板dna:選用商品化的dna提取試劑盒，提取待檢測(cè)樣品中的基因組dna，獲得待檢測(cè)模板dna；

(2)擴(kuò)增反應(yīng)體系為：19μl分別含有探針probetuber、probeavium、probeintra的擴(kuò)增反應(yīng)液，1μl待檢模板dna或者陽(yáng)性對(duì)照或者陰性對(duì)照，反應(yīng)體系的總體積為20μl；

所述檢測(cè)體系中pcr反應(yīng)體系如下：

加ddh2o補(bǔ)齊至20μl。

(3)三種分枝桿菌屬熒光定量pcr擴(kuò)增：將配置好的步驟2)的擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行pcr反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10min；95℃15s，65℃1min，40個(gè)循環(huán)；在65℃1min進(jìn)行熒光信號(hào)采集。

【實(shí)施例2】人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的taqman-mgb探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的敏感性評(píng)價(jià)

(1)提取結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組。

(2)按10^-1至10^-7梯度稀釋結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒，按10^-1至10^-7梯度稀釋結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組，以稀釋后的質(zhì)粒(10^-1至10^-7稀釋度)和基因組(10^-4至10^-7稀釋度)作為模板，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)；得到陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖(附圖2)，并確定結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最大稀釋度為10^-6稀釋度(附圖3，4)，以質(zhì)粒拷貝數(shù)的log值為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閾值ct值為縱坐標(biāo)，繪制結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖5)，其線性擬合系數(shù)r²＝0.9963，滿足線性檢測(cè)應(yīng)用要求。將檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株10^-6稀釋度對(duì)應(yīng)的ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算得到拷貝數(shù)log值(附圖5)，為1.939，換算后得到結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低檢測(cè)拷貝數(shù)，lg1.939＝87copies。

(3)按10^-1至10^-7梯度稀釋鳥分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒,按10^-1至10^-7梯度稀釋鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組，以稀釋后的質(zhì)粒(10^-1至10^-7稀釋度)和基因組(10^-4至10^-7稀釋度)作為模板，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)；得到陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖(附圖6)，并確定鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最大稀釋度為10^-6(附圖7，8)。以質(zhì)?？截悢?shù)的log值為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閾值ct值為縱坐標(biāo)，繪制鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖9)，其線性擬合系數(shù)r²＝0.9934，滿足線性檢測(cè)應(yīng)用要求。將檢測(cè)到鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最大稀釋度對(duì)應(yīng)的ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算得到拷貝數(shù)log值(附圖9)，為1.13，換算后得到鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低檢測(cè)拷貝數(shù)，lg1.13＝14copies。

(4)按10^-1至10^-6梯度稀釋胞內(nèi)分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒,按10^-1至10^-6梯度稀釋胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組，以稀釋后的質(zhì)粒(10^-1至10^-6稀釋度)和基因組(10^-4至10^-6稀釋度)作為模板，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)；得到陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖(附圖10)，并確定胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最大稀釋度，當(dāng)稀釋至10^-4后，ct值沒有明顯變化，故取10^-4為最大稀釋度(附圖11，12)，以質(zhì)粒拷貝數(shù)的log值為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閾值ct值為縱坐標(biāo)，繪制胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖13)，其線性擬合系數(shù)r²＝0.9951，滿足線性檢測(cè)應(yīng)用要求。將檢測(cè)到胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株10^-4稀釋度對(duì)應(yīng)的ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算得到拷貝數(shù)log值(附圖13)，為3.34，換算后得到胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低檢測(cè)拷貝數(shù)，lg3.34＝2187copies。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所建立的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法對(duì)于結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌具有較高的敏感性，對(duì)胞內(nèi)分枝桿菌鑒定靈敏度稍差。

【實(shí)施例3】人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的taqman-mgb探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的特異性評(píng)價(jià)

以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組dna為模板，分別加入probetuber、probeavium、probeintra，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增曲線及ct值進(jìn)行分析，只有加入probetuber的組才擴(kuò)增(附圖14、15)。以鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組dna為模板，分別加入probetuber、probeavium、probeintra，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增曲線及ct值進(jìn)行分析，只有加入proberavium的組才擴(kuò)增(附圖16、17)。以胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組dna為模板，分別加入probetuber、probeavium、probeintra，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增曲線及ct值進(jìn)行分析，只有加入probeintra的組才擴(kuò)增(附圖18、19)。結(jié)果表明，本發(fā)明的hiv合并感染分枝桿菌的taqman-mgb探針法實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性，三條探針均能特異性鑒別結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌。

【實(shí)施例4】人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的taqman-mgb探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的重復(fù)性評(píng)價(jià)

以同一批次梯度的，10⁴個(gè)拷貝數(shù)的結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，變異系數(shù)為1.03％；以不同批次的10⁵,10⁶個(gè)拷貝數(shù)的結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，變異系數(shù)為1.16％，1.86％。

以同一批次梯度的，10⁴個(gè)拷貝數(shù)的鳥分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，變異系數(shù)為0.67％；以不同批次的10⁵，10⁶個(gè)拷貝數(shù)的鳥分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，變異系數(shù)為0.65％，1.00％。

以同一批次梯度的，10⁵個(gè)拷貝數(shù)的胞內(nèi)分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，變異系數(shù)為1.36％；以不同批次的10⁶，10⁷個(gè)拷貝數(shù)的胞內(nèi)分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獲得擴(kuò)增曲線，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果循環(huán)閾值(ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，變異系數(shù)為2.16％，1.00％。

表1：重復(fù)性評(píng)價(jià)結(jié)果

(表1)所示變異系數(shù)，無(wú)論是同一批次還是不同批次，均小于5％，滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用要求。因此，本發(fā)明的hiv合并分枝桿菌感染的taqman-mgb探針法實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法具有較好的批內(nèi)重復(fù)性與批間重復(fù)性。

sequencelisting

<110>武漢大學(xué)

<120>基于taqman-mgb探針檢測(cè)人非結(jié)合分枝桿菌和結(jié)合分枝桿菌的試劑盒及方法

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gatgcctgggaaactgggtctaata25

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cccgtcgtcgccttggtaggc21

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

taggaccacgggatgcatg19

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

taggacctcaagacgcatgtcttc24

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

taggacctttaggcgcatgt20

<210>6

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<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gcctgggaaactgggtctaataccggataggaccacgggatgcatgtcttgtggtggaaa60

gcgctttagcggtgtgggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgacggcct120

accaaggcgacgacggg137

<210>7

<211>135

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gcctgggaaactgggtctaataccggataggacctcaagacgcatgtcttctggtggaaa60

gcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgacggcctac120

caaggcgacgacggg135

<210>8

<211>135

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gcctgggaaactgggtctaataccggataggacctttaggcgcatgtctttaggtggaaa60

gcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctac120

caaggcgacgacggg135