專利名稱：染色體rs1333049多態(tài)性位點(diǎn)基因分型引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因分型引物，尤其涉及一種用于染色體rsl333049多態(tài)性位點(diǎn)基因分型的引物。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism, SNP)是指基因組 DNA 中某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化，它與許多疾病直接相關(guān)是決定人類疾病易感性和藥物反應(yīng)差異的主要因素。SNP具有數(shù)量多、分布廣和穩(wěn)定遺傳，是繼限制 性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和微衛(wèi)星多態(tài)性這兩種遺傳標(biāo)記之后，成為第三代分子標(biāo)記。通常認(rèn)為SNP只有兩種類型，即等位基因，因此在對(duì)已知突變位點(diǎn)檢測(cè)時(shí)只需要對(duì)SNP進(jìn)行兩種不同類型堿基的確認(rèn)分析，而無需對(duì)DNA片段全序列測(cè)定。據(jù)估計(jì)，大約有IO5個(gè)SNP分子標(biāo)記將被用于基因功能及與疾病相關(guān)性的關(guān)聯(lián)研究，如此龐大的分析工作，對(duì)檢測(cè)技術(shù)提出了極高的要求。因此，一種理想的SNP測(cè)定方法應(yīng)該具備如下優(yōu)點(diǎn)。I)準(zhǔn)確——新方法必須經(jīng)的起標(biāo)準(zhǔn)方法加以驗(yàn)證，而且準(zhǔn)確率必須> 99%。2)可靠——此技術(shù)穩(wěn)定，以免重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)使花費(fèi)上升，耽誤結(jié)果，浪費(fèi)寶貴的樣品O3)簡(jiǎn)便一步驟簡(jiǎn)單，操作時(shí)間短，這樣可以降低時(shí)間及金錢上的花費(fèi)。4.)經(jīng)濟(jì)——時(shí)間及金錢上的花費(fèi)要少越好，例如試劑費(fèi)，設(shè)備需求，使用費(fèi)等，花費(fèi)過高就無法測(cè)試大量的樣品。目前單核苷酸多態(tài)性的基因分型有多種方法，如Sanger測(cè)序、限制性內(nèi)切酶法、Taqman探針法、Massarray法,但是這些基因分型方法要么耗時(shí)、效率低(限制性內(nèi)切酶法，每個(gè)位點(diǎn)需要1-3元，需要6-12小時(shí))，要么成本高(測(cè)序法,每個(gè)位點(diǎn)需要24小時(shí)，20元)或者需要其他大型設(shè)備(如Taqman探針法需要突光定量PCR儀,每個(gè)位點(diǎn)需要5_10元，需要2小時(shí))。多態(tài)性位點(diǎn)rsl333049位于染色體9p21區(qū)域多態(tài)性，至2007年Nature、Science雜志報(bào)道9p21區(qū)域與冠心病發(fā)病率相關(guān)以來，已有近百個(gè)研究顯示全世界多民族冠心病、糖尿病、早老性癡呆、腦卒中、主動(dòng)脈瘤等疾病發(fā)病率均與該區(qū)域相關(guān)。9p21區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)以rsl333049位點(diǎn)與疾病相關(guān)性研究最多，與疾病相關(guān)性也最強(qiáng)；2008年，研究者在韓國(guó)和日本人群中對(duì)染色體9p21區(qū)域的rsl333049位點(diǎn)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與冠心病顯著相關(guān)。人群中rsl333049最小等位基因頻率為O. 17-0. 5，在中國(guó)人群中MAF約O. 478，發(fā)明人前期工作也揭示該位點(diǎn)與中國(guó)人群急性心肌梗死明確相關(guān)。因此，該在普通人群或者病人中分型rsl333049,對(duì)評(píng)估病人的病情及遺傳異質(zhì)性十分有意義。rsl333049位點(diǎn)無法用內(nèi)切酶分型，目前研究一般采用的方法是Taqman探針法，該探針可從ABI公司購買，也可由公司合成，基因分型如果采用ABI7900實(shí)時(shí)定量PCR儀(384孔板)，I個(gè)位點(diǎn)需要4-5元。采用其他實(shí)時(shí)定量PCR儀(96孔板)，I個(gè)反應(yīng)需要7-9元。ABI7900該儀器一般需要15萬美元，目前上海市僅有不到10臺(tái)同類型機(jī)器。因此，采用該方法需要研究平臺(tái)高，且費(fèi)用高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的是現(xiàn)有的rS1333049位點(diǎn)基因分型方法成本高的問題。本發(fā)明的目的是提供一種染色體rs1333049多態(tài)性位點(diǎn)基因分型的引物、包括所述引物的試劑盒、以及進(jìn)行基因分型的方法。

本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種染色體rsl333049多態(tài)性位點(diǎn)基因分型引物，其中，以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2中的任意一種或兩種序列作為上游引物，以SEQ ID No. 3序列作為下游引物。5’-ATACTAACCATATGATCAACAGTCC-3’ SEQ ID No. I5’-ATACTAACCATATGATCAACAGTCG-3’ SEQ ID No. 2
5’- TTTTCTAGCGCAATACCACA-3’SEQ ID No. 3
本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種包括上述引物的染色體rsl333049多態(tài)性位點(diǎn)基因分型試劑盒，其中，包括SEQ ID No. I和/或SEQ ID No. 2序列作為上游引物，包括SEQ IDNo. 3序列為下游引物。根據(jù)本發(fā)明所述試劑盒的一種優(yōu)選實(shí)施方式，包括SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2序列作為上游引物。本發(fā)明所述的任意試劑盒，還可以包括Taq酶。本發(fā)明所述的任意試劑盒，還可以包括，MgCl2, dNTP、緩沖液中的任意一種或幾種。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)染色體rsl333049多態(tài)性位點(diǎn)基因分型方法，其中，以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2中的任意一種序列作為上游引物，以SEQ ID No. 3序列作為下游引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)(可以是DNA測(cè)序、凝膠電泳等檢測(cè)方法);如果與引物對(duì)應(yīng)PCR有反應(yīng)產(chǎn)物，就證明該模板含有該等位基因，否則沒有該等位基因。其中，SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2序列中3’末端分別為C和G堿基，SEQ IDNo. I、SEQ ID No. 3 的 PCR 產(chǎn)物代表具有 C 等位基因，SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 的 PCR 產(chǎn)物代表具有G等位基因；即
與SEQ ID No. I反應(yīng)而不與SEQ ID No. 2反應(yīng)，則該模板基因型為CC型，與SEQ IDNo. 2反應(yīng)而不與SEQ ID No. I反應(yīng)，則該模板基因型為GG型，同時(shí)與引物I、引物2反應(yīng)，則為GC或CG型。經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明提供的引物，能夠準(zhǔn)確分型染色體rsl333049多態(tài)性位點(diǎn)，特異性高，假陽性率低于1% ;而且需要條件簡(jiǎn)單，普通PCR儀和普通PCR試劑即能用于基因分型(一個(gè)位點(diǎn)分型僅需要O. 5元);此外檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、所需時(shí)間短，PCR反應(yīng)后直接電泳，基因分型僅需要3小時(shí)。


圖I為采用本發(fā)明所述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，不同基因型PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；
圖2為66條DNA的PCR擴(kuò)展產(chǎn)物電泳結(jié)果；圖3為66條DNA的PCR擴(kuò)展產(chǎn)物Sanger測(cè)序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式等位基因特異PCR (allele specific PCR，AS-PCR)成本低，僅需要三條PCR引物和普通PCR儀，直接PCR+電泳即能完成分型，每個(gè)位點(diǎn)分型僅需要O. 5元。等位基因特異PCR原理PCR過程中引物延伸是3’端開始的，所以3’末端的堿基對(duì)引物的延伸來說處于至關(guān)重要的位置。如果這個(gè)堿基與模板互補(bǔ)，則引物能從不間斷延伸，PCR可以正常進(jìn)行，得到特定長(zhǎng)度擴(kuò)增帶。反之，亦然。所以只要將突變與正常等位基因所不 同的那個(gè)堿基安排在3’最末端，當(dāng)用某一含突變序列的引物進(jìn)行PCR時(shí)，如果得到特異擴(kuò)增帶，表明被測(cè)基因含有該種突變。沒有特異擴(kuò)增帶出現(xiàn)，則表示沒有這種突變。該方法中需要嚴(yán)格設(shè)計(jì)引物，以達(dá)到引物和模板的正確配對(duì)。否則引物和其它基因型模板發(fā)生非特異性結(jié)合，發(fā)生非特異PCR，進(jìn)而不能有效進(jìn)行基因分型或者基因分型假陽性率高，因此限制了該方法應(yīng)用。申請(qǐng)人:在提供了一對(duì)高特異性等位基因特異PCR引物，該引物能有效對(duì)人染色體多態(tài)性位點(diǎn)rsl333049分型。該引物不僅特異性高，假陽性率低于(1%)，而且需要條件簡(jiǎn)單，普通PCR儀和普通PCR試劑即能用于基因分型(一個(gè)位點(diǎn)分型僅需要O. 5元)，此外方法簡(jiǎn)單，PCR電泳后直接電泳，基因分型僅需要3小時(shí)。引物擴(kuò)增片段287bp，全部序列信息如下
ATACTAACCATATGATCAACAGTTGAAAAGCAGCCACTCGCAGAGGTAAGCAAGATATATGGTAAATACTGT
GTTGACAAAAGTATGCAGAAGCAGTCACATTTATACAGTAGTGAAGGAAATGTAAATTGGACAAACTTTTTGGAAGA
TAAGTTGAGAATGTCAAAAATCAAAACACACTTTCTGTTTTATTCAGCAATTATGAGCCCTTTGTTTTACAGCTATG
CTCACAAATATATACAAACATGTATGCACAATTATGTTCACTGTGGTATTGCGCTAGAAAA
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述基因分析引物、試劑盒以及基因分型PCR檢測(cè)方法，進(jìn)行詳細(xì)的介紹和描述，以使更好的理解本發(fā)明內(nèi)容，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例I 弓I物I:
上游引物5’-ATACTAACCATATGATCAACAGTCC-3’ SEQ ID No. I 下游引物5’_ TTTTCTAGCGCAATACCACA-3’SEQ ID No. 3
PCR反應(yīng)體系
H2O10. 5 μ I
Buffer2 μ I
MgCl2I. 5μ I
dNTP2 μ I
上游引物Ιμ I
下游引物Ιμ
DNA 模板I μ I I
Taq 酶I μ I
總體積20 μ I
PCR反應(yīng)條件95°C，3min- (95°C,30s-60°C,30s-72°C,30s) 35 次循環(huán)。結(jié)果分析
PCR產(chǎn)物電泳以I. 2%瓊脂糖電泳，引物I與引物2產(chǎn)物分開點(diǎn)膠電泳，紫外燈下拍照。不同基因型PCR電泳結(jié)果見圖I。實(shí)施例2 引物2
上游引物5’-ATACTAACCATATGATCAACAGTCG-3’ SEQ ID No. 2 下游引物5’_ TTTTCTAGCGCAATACCACA-3’SEQ ID No. 3
PCR反應(yīng)體系
H2O10. 5 μ I
Buffer2 μ I
MgCl2I. 5μ I
dNTP2 μ I
上游引物Ιμ I
下游引物Ιμ
DNA 模板I μ I I
Taq 酶I μ I
總體積20 μ I
PCR反應(yīng)條件
95°C，3min- (95°C, 30s-60°C,30s-72°C,30s) 35 次循環(huán)。結(jié)果分析
PCR產(chǎn)物電泳以I. 2%瓊脂糖電泳，引物I與引物2產(chǎn)物分開點(diǎn)膠電泳，紫外燈下拍照。不同基因型PCR電泳結(jié)果見圖I。圖I中給出了三種不同DNA模板，與引物I和引物2進(jìn)行PCR反應(yīng)的結(jié)果，其中，電泳結(jié)果中，最左側(cè)的DNA樣品檢測(cè)到與引物I的PCR反應(yīng)產(chǎn)物、而無與引物2的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，因此，為CC型樣本；而最右側(cè)的DNA樣品檢測(cè)到與引物2的PCR反應(yīng)產(chǎn)物、而無與引物I的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，因此，為GG型樣本；中間的DNA樣品與引物I和引物2均有反應(yīng)產(chǎn)物，因此為GC型樣本。通過Sanger測(cè)序,證實(shí)了上述檢測(cè)結(jié)果是正確的，Sanger測(cè)序結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例3
隨機(jī)選取(不同濃度和不同純度的)66個(gè)DNA標(biāo)本，分別以上述PCR反應(yīng)條件、與引物I和引物2進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，先將引物I的PCR產(chǎn)物電泳30分鐘，隨后將對(duì)應(yīng)模板引物2的PCR產(chǎn)物在相同泳道電泳30分鐘，結(jié)果顯示擴(kuò)增效果及特異性極高。根據(jù)電泳結(jié)果、以及上述判斷方法，可以很容易判斷每個(gè)標(biāo)本的基因型，如圖2所示(圖中，Γ66為樣品編號(hào)，引物I和引物2箭頭所指的條帶分別為引物I的PCR產(chǎn)物和引物2的PCR產(chǎn)物)，樣品I為CC型；樣品2為GC型；樣品3為GC型；樣品4為GG型；樣品5為GC型......。 通過Sanger測(cè)序，證實(shí)了上述檢測(cè)方法是正確的，并且特異性高，沒有出現(xiàn)假陽性檢測(cè)結(jié)果。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)
權(quán)利要求
1.一種染色體rsl333049多態(tài)性位點(diǎn)基因分型引物，其特征在于，以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2中的任意一種或兩種序列作為上游引物，以SEQ ID No. 3序列作為下游引物。
2.一種包括權(quán)利要求I所述引物的染色體rsl333049多態(tài)性位點(diǎn)基因分型試劑盒，其特征在于，包括SEQ ID No. I和/或SEQ ID No. 2序列作為上游引物，包括SEQ ID No. 3序列為下游引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，包括SEQID No. I和SEQ ID No. 2序列作為上游引物。
4.一種檢測(cè)染色體rsl333049多態(tài)性位點(diǎn)基因分型方法，其特征在于，以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2中的任意一種序列作為上游引物，以SEQ ID No. 3序列作為下游引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，如果與引物對(duì)應(yīng)PCR有反應(yīng)產(chǎn)物，就證明該模板含有該等位基因，否則沒有該等位基因； 其中，SEQ ID No. I、SEQ ID No. 3的PCR產(chǎn)物代表具有C等位基因，SEQ ID No. 2、SEQID No. 3的PCR產(chǎn)物代表具有G等位基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一對(duì)高特異性等位基因特異PCR引物，該引物能有效對(duì)人染色體多態(tài)性位點(diǎn)rs1333049分型。該引物不僅特異性高，假陽性率低于(1%)，而且需要條件簡(jiǎn)單，普通PCR儀和普通PCR試劑即能用于基因分型(一個(gè)位點(diǎn)分型僅需要0.5元)，此外方法簡(jiǎn)單，PCR電泳后直接電泳，基因分型僅需要3小時(shí)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102643911SQ201210104418
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月11日
發(fā)明者莊劍輝, 彭文輝, 徐亞偉, 李海玲 申請(qǐng)人:上海市第十人民醫(yī)院