專利名稱：進(jìn)行抗體表達(dá)和裝配的系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及重組制備的抗體及其用途。
背景技術(shù)：
近年來，抗體作為各種疾病的診斷和治療制劑的前景越來越令人鼓舞。很多研究和臨床應(yīng)用要求大量的功能性抗體或抗體片段，因此需要成倍增長、但又經(jīng)濟(jì)的抗體制備系統(tǒng)。特別有用的是，利用從諸如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌等原核細(xì)胞，到酵母、植物、昆蟲細(xì)胞以及哺乳動物細(xì)胞等各種表達(dá)宿主，通過重組方法制備抗體Kipriyanov and Little(1999)Mol.Biotech.12173-201。
與其它抗體制備系統(tǒng)相比，細(xì)菌，尤其是大腸桿菌有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。所用原料(即細(xì)菌細(xì)胞)價格便宜且易于培養(yǎng)，因此產(chǎn)物的成本降低。原核宿主的生長速度比哺乳動物細(xì)胞等快得多，能夠?qū)z傳操作更快地進(jìn)行分析。代時短和易于按比例擴(kuò)增也使細(xì)菌發(fā)酵成為大量生產(chǎn)蛋白的一種更具吸引力的方式。很多細(xì)菌物種，包括大腸桿菌，它們的遺傳結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性都已經(jīng)研究得很透徹，而且目前已經(jīng)能夠提供廣泛多種合適的載體，因此目標(biāo)抗體的表達(dá)更為方便。與真核生物相比，生產(chǎn)工藝涉及的步驟較少，包括對重組基因的操作，宿主中多拷貝的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物的表達(dá)誘導(dǎo)和鑒定。Pluckthun and Pack(1997)Immunotech 383-105。此外，大腸桿菌特有隨機(jī)進(jìn)入細(xì)胞的途徑。由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或噬菌體轉(zhuǎn)染的強(qiáng)大效力，大腸桿菌可以用于構(gòu)建多種類型抗體變體的噬菌體文庫，這對于功能性基因組研究尤其重要。
有多種方法已經(jīng)用于在細(xì)菌中制備重組抗體。與其它異源蛋白相似，從細(xì)菌獲得抗體分子的方式包括，使表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中的包涵體重新折疊(refolding)，或先進(jìn)行表達(dá)然后分泌到細(xì)菌周質(zhì)中。分泌還是重新折疊，對此的選擇通常受數(shù)種條件影響。分泌一般是更快和更常用的抗體制備策略。Kipriyanov and Little(1999)，出處同上。
Opper等的美國專利6,008,023描述了一種大腸桿菌胞質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其中抗體片段(如，F(xiàn)ab)與在定向腫瘤治療中使用的酶融合。Zemel-Dreasen等(1984)Gene 27315-322報道了一種抗體輕鏈在大腸桿菌中的分泌和加工。Lo等的PCT申請WO 93/07896報道了缺乏CH2重鏈區(qū)的四聚體抗體在大腸桿菌中的制備。編碼其中的輕鏈和缺乏CH2之重鏈的基因被構(gòu)建到相同的表達(dá)載體中，受單個啟動子的控制。
抗體在原核系統(tǒng)中的表達(dá)可以在不同的規(guī)模進(jìn)行。搖瓶培養(yǎng)(2-5升水平)通常產(chǎn)生不到5mg/l的產(chǎn)物。Carter等(1992)Bio/Technology 1012-16開發(fā)了一種高細(xì)胞密度發(fā)酵系統(tǒng)，它可以高水平表達(dá)(高達(dá)2g/l)抗體片段。Carter等獲得的Fab’的g/l滴度主要是由于更精確控制發(fā)酵罐的環(huán)境所產(chǎn)生的較高細(xì)胞密度，而不是由于簡單的搖動燒瓶。該系統(tǒng)包含一種雙順反子性質(zhì)的操縱子，其設(shè)計目的是共表達(dá)輕鏈和重鏈片段。這種雙順反子性質(zhì)的操縱子受單個大腸桿菌phoA啟動子的控制，該啟動子可通過磷酸鹽饑餓條件來誘導(dǎo)。每一抗體鏈的前面是大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素II(stII)信號序列，它用于指導(dǎo)向周質(zhì)空間中進(jìn)行的分泌。Carter等(1992)所描述的這種系統(tǒng)將在下文中進(jìn)一步討論。
關(guān)于在大腸桿菌中制備抗體的綜述，參見Pluckthun and Pack(1997)Immunotech 383-105；Pluckthun等(1996)，ANTIBODY ENGINEERINGAPRACTICAL APPROACH，pp 203-252(Oxford Press)；Pluckthun(1994)，HANDBOOK OF EXP PHARMCOL VOL 3THE PHARMCOL OF MONOCLONALANTIBODIES，pp269-315(M.Rosenberg和G.P.Moore編；Springer-Verlag，Berlin)。
很多生物學(xué)測定(如X-射線晶體成像)和臨床應(yīng)用(如蛋白治療)需要大量抗體。因此，需要一種高產(chǎn)的簡單系統(tǒng)用于制備正確裝配的可溶性功能抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明提供在宿主細(xì)胞，如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中，重組制備功能性抗體或抗體片段的新方法和組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在諸如原核細(xì)胞等宿主細(xì)胞中分時分別(temporally separating)表達(dá)抗體輕鏈和重鏈，從而提高裝配好的功能性抗體分子的產(chǎn)量的方法。具體地，所述方法包括用兩種不同的翻譯單元轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述不同的翻譯單元分別編碼輕鏈和重鏈；培養(yǎng)所述細(xì)胞，所用的培養(yǎng)條件適合于依次表達(dá)輕鏈和重鏈；將輕鏈和重鏈裝配成功能性抗體或其片段。在一個優(yōu)選方面，輕鏈和重鏈的分時分別表達(dá)，通過利用分別控制輕鏈和重鏈的兩種不同啟動子來實現(xiàn)，其中所述不同啟動子在不同條件下活化。例如，可將編碼輕鏈和重鏈的DNA插入單個質(zhì)粒載體，但分別在兩種翻譯單元中，這兩種翻譯單元各自受互不相同的啟動子控制。其中一種啟動子(例如，第一種啟動子)可以是組成型或誘導(dǎo)型，而另一種啟動子(例如第二種啟動子)為誘導(dǎo)型。如此一來，當(dāng)在適合于活化一種啟動子(例如第一種啟動子)的條件下，培養(yǎng)已經(jīng)用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞時，僅一種鏈(例如輕鏈)被表達(dá)。然后，使第一種鏈(例如輕鏈)表達(dá)所需的時間段以后，將培養(yǎng)條件改變?yōu)檫m合于活化另一種啟動子(例如，第二種啟動子)，并因此誘導(dǎo)第二種鏈(例如，重鏈)表達(dá)。在一個優(yōu)選實施方案中，首先表達(dá)輕鏈，然后表達(dá)重鏈。在另一實施方案中，首先表達(dá)重鏈，然后表達(dá)輕鏈。
本發(fā)明還提供用于在原核或真核宿主細(xì)胞中制備裝配好的功能性抗體或其片段的重組載體，所述載體包含第一種啟動子和第二種啟動子，所述第一種啟動子位于第一種翻譯單元之前，所述第一種翻譯單元編碼與輕鏈可操作相連的分泌信號；所述第二種啟動子位于第二種翻譯單元之前，所述第二種翻譯單元編碼與重鏈可操作相連的分泌信號。第一種和第二種啟動子在不同條件下被誘導(dǎo)。
很多原核和真核種類都可以用作本發(fā)明抗體表達(dá)的宿主。優(yōu)選地，原核宿主為革蘭氏陰性細(xì)菌。更優(yōu)選地，所述宿主為大腸桿菌。在一個方面中，所述宿主細(xì)胞是經(jīng)過遺傳改造的適合于大量產(chǎn)生異源蛋白的大腸桿菌菌株。例如，所述宿主細(xì)胞可以是含有蛋白酶等位基因突變體，和或dsb基因的額外拷貝的大腸桿菌。很多已知的組成型或誘導(dǎo)型啟動子都適用于本發(fā)明，只要它們可以與另一種啟動子有效地聯(lián)合應(yīng)用。
本發(fā)明的方法和組合物可用于大量制備廣泛多種已經(jīng)裝配好的抗體分子，包括完整抗體或抗體片段如Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)(ab’)2-亮氨酸拉鏈融合體，F(xiàn)v和dsFv。更有甚者，本發(fā)明的抗體分子可以是人的抗體分子，嵌合抗體分子，人源化抗體分子或親和成熟的抗體分子。所述抗體可以是特異于任何合適的抗原，優(yōu)選那些生物學(xué)重要的多肽?？梢詫⒖贵w片段與二聚體化結(jié)構(gòu)域，如亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合。
本發(fā)明還涉及本文所述方法所制備的抗體的各種診斷和治療應(yīng)用。在一個治療應(yīng)用中，經(jīng)重組制備的抗體或其片段在一種治療中與另一種治療劑聯(lián)合使用。


圖1示抗CD18 F(ab’)2(-亮氨酸拉鏈)質(zhì)粒pS1130(單啟動子)和pxCD18-7T3(雙-啟動子)的構(gòu)建。
圖2描述雙-啟動子構(gòu)建體pxCD18-7T3中插入的核苷酸序列。
圖3示構(gòu)建體pxCD18-7T3之中的兩種翻譯單元所編碼的氨基酸序列。N-末端STII分泌信號序列用下劃線標(biāo)出。
圖4比較了用單啟動子系統(tǒng)(pS1130/59A7)和雙啟動子系統(tǒng)(pxCD18-7T3/59A7)裝配的F(ab’)2的產(chǎn)量。
圖5描述了使用單啟動子表達(dá)系統(tǒng)(pS1130)表達(dá)抗-CD18的表達(dá)圖譜。
圖6描述了使用雙啟動子表達(dá)系統(tǒng)(pxCD18-7T3)表達(dá)抗-CD18的表達(dá)圖譜。
圖7比較了單啟動子系統(tǒng)(pS1130)和雙啟動子系統(tǒng)(pxCD18-7T3)的重鏈總產(chǎn)量和裝配效率。裝配效率代表了重鏈合成的最初10個小時期間，裝配到F(ab’)2中的重鏈級分。
圖8示抗-組織因子IgG1質(zhì)粒paTF130(PhoA/PhoA啟動子)和pxTF-7T3FL(PhoA/TacII-啟動子)。
圖9示PhoA/TacII-啟動子構(gòu)建體pxTF-7T3FL中插入的核酸序列。
圖10示構(gòu)建體pxTF-7T3FL之中的兩種翻譯單元所編碼的氨基酸序列。N-末端STII分泌信號序列用下劃線標(biāo)出。
圖11A和11B是還原條件(11A)或非還原條件(11B)下進(jìn)行western印跡的結(jié)果，比較了用相同啟動子系統(tǒng)(PhoA/PhoA)和雙啟動子系統(tǒng)(PhoA/TacII)進(jìn)行的抗-組織因子IgG1的表達(dá)。
優(yōu)選實施方案本發(fā)明的主要實施方案基于以下意外發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞系統(tǒng)(如大腸桿菌發(fā)酵系統(tǒng))中正確裝配的可溶性抗體的產(chǎn)量，可通過分時分別誘導(dǎo)輕鏈和重鏈表達(dá)而大大提高。通過利用新的重組系統(tǒng)(其中一種鏈，如輕鏈，先表達(dá)，然后再誘導(dǎo)第二種鏈，如重鏈，表達(dá))，相較于輕鏈和重鏈同時表達(dá)的參照系統(tǒng)，裝配好的抗體的滴度增加約兩倍。
傳統(tǒng)上，抗體利用雙順反子載體在諸如大腸桿菌等宿主細(xì)胞中制備，在所述載體中，編碼輕鏈和重鏈的基因受單個啟動子的控制。在適合于活化該啟動子的條件下進(jìn)行培養(yǎng)后，輕鏈和重鏈基因同時表達(dá)。例如，Carter等(1992)Bio/Technology 10163-167描述了輕鏈和重鏈片段的一種雙順反子性質(zhì)的操縱子，它受單個大腸桿菌phoA啟動子的控制，可以通過磷酸鹽饑餓條件來誘導(dǎo)。每一抗體鏈之前是大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素II(stII)信號序列，用于指導(dǎo)向周質(zhì)空間分泌。當(dāng)用這種載體制備某些抗體時，尤其是當(dāng)輕鏈和重鏈的表達(dá)水平都較高時，相當(dāng)多的單個鏈分子發(fā)生聚集，無法再裝配成可溶性功能抗體。雙順反子載體(具有用于控制輕鏈和重鏈表達(dá)的單個啟動子)中的聚集問題將在后文的實施例中進(jìn)一步闡述。
在不受任何具體理論限制的前提下，聚集的問題可以至少部分歸因于單個鏈在上述條件下進(jìn)行折疊的有限能力?？贵w的各個鏈在表達(dá)、分泌以及裝配成功能性抗體的過程中表現(xiàn)不一。例如，一條鏈(如輕鏈)在單獨(dú)分泌到宿主細(xì)胞的周質(zhì)空間之后有可能明顯保持可溶性，另一條鏈(如重鏈)則在分泌之后很大程度上聚集并且不溶，除非它以裝配好的抗體復(fù)合物的形式存在。故，可溶性較強(qiáng)的鏈較早地表達(dá)，有利于可溶性較弱的鏈的折疊以及隨后這兩條鏈的裝配。另外，宿主細(xì)胞通過其分泌體系轉(zhuǎn)移已經(jīng)表達(dá)的多肽的能力有限。在某些情況下，分泌能力的限制可能被擴(kuò)大，例如，同時表達(dá)多個多肽時，或者由具有較強(qiáng)翻譯強(qiáng)度的載體表達(dá)出大量的前體蛋白時，或者表達(dá)出較大分子量的蛋白時，或者上述情況的任意組合。結(jié)果，分泌出的是成熟程度較低的蛋白，它們被用于裝配抗體復(fù)合物。
在不限于任何機(jī)制的情況下，本發(fā)明提供了一種新的(原核或真核)系統(tǒng)，它可用于以顯著較高的產(chǎn)量生產(chǎn)裝配好的可溶性功能抗體分子。利用本發(fā)明的雙啟動子表達(dá)載體，可以首先合成一條鏈。表達(dá)了一定量的第一條鏈之后，可以誘導(dǎo)出對變化的培養(yǎng)條件發(fā)生應(yīng)答的第二種啟動子控制下的第二條鏈表達(dá)。然后將新表達(dá)的第二條鏈與此前制備的第一條鏈復(fù)合，形成可溶性抗體或其片段。這樣一來，通過操控兩條鏈的表達(dá)時間，可以指導(dǎo)更多的表達(dá)出的抗體鏈摻入可溶性抗體復(fù)合物，從而增加總產(chǎn)量。
本發(fā)明的分時表達(dá)系統(tǒng)主要通過制備抗體及其片段來舉例說明，但應(yīng)理解，本文所述方法可以應(yīng)用于，需要產(chǎn)生多個蛋白單元/鏈、而且中間產(chǎn)物或者最終蛋白復(fù)合物需要將上述各個單元/鏈正確裝配才能具有功能的任何系統(tǒng)中。所述方法尤其可以用于制備包含免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的蛋白復(fù)合物，例如，抗體，T-細(xì)胞受體，I類和II類MHC分子，整聯(lián)蛋白，CD8和CD28分子，及其相關(guān)片段，衍生物，變體和融合蛋白。
抗體術(shù)語“抗體”是指最廣義上的抗體，包括單克隆抗體，多克隆抗體，多價抗體，多特異性抗體(如雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要它們顯示所需生物學(xué)活性即可。天然抗體包含四條多肽鏈，兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)通過二硫鍵相互連接。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈恒定區(qū)，該恒定區(qū)的天然形式包含三個結(jié)構(gòu)域，CH1，CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域，CL。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步分為多個超變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其間穿插著相對保守的區(qū)，稱為框架區(qū)(FR)。VH和VL每一個由三個CDR和四個FR組成，從氨基端到羧基端依次為FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。
任何脊椎動物的抗體輕鏈，根據(jù)它們的恒定區(qū)氨基酸序列，都可以被分配為兩種截然不同的型別(κ和λ)中的一種。
根據(jù)抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可以將抗體(免疫球蛋白)分為不同的類。有五大類免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，它們中的一些還可以進(jìn)一步分為亞類(同種型)，如IgG-1，IgG-2，IgA-1，IgA-2等。與不同類免疫球蛋白相對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別稱為α，δ，ε，γ，和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象是已知的，可參見Abbas等Cellular and Mol.Immunology，第4版(2000)。
抗體可以是相對更大的融合分子的一部分，這時，該抗體或抗體的一部分可以與一或多個另外的蛋白或肽以共價或非共價方式結(jié)合而形成融合分子。這種融合蛋白的實例包括，用鏈霉親和素核心區(qū)制備四聚體scFv分子(Kipriyanov等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 693-101)，用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽以及C-末端多組氨酸標(biāo)簽制備二價的生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1994)Mol.Immunol.311047-1058)。
本發(fā)明涉及單克隆抗體。本文中術(shù)語“單克隆抗體”是指，來自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個抗體均相同。單克隆抗體具有高度特異性，直接針對單個抗原。而且，與主要包括針對不同決定簇(表位)的多個不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每種單克隆抗體直接針對抗原上的單個表位。
本文中單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，以及這些抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性，所述嵌合抗體中，重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟惢騺嗩惖目贵w的相應(yīng)序列相同或同源，但所述鏈的剩余部分與源自另一個物種或?qū)儆诹硪活惢騺嗩惖目贵w的相應(yīng)序列相同或同源(美國專利4,816,567；和Morrison等，美國國家科學(xué)院院刊，816851-6855(1984))。
“功能性”或“生物活性”抗體是在結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)、生物化學(xué)或生物物理學(xué)事件中能夠發(fā)揮其一或多種天然活性的抗體。例如，功能性抗體可能具有特異性結(jié)合抗原的能力，而這種結(jié)合能激發(fā)或改變細(xì)胞事件或分子事件，如信號傳遞或酶活性。功能性抗體還可能阻斷受體的配體活化過程或者作為激動劑抗體發(fā)揮作用。抗體能否發(fā)揮其一或多種天然活性取決于多種因素，包括多肽鏈的正確折疊和裝配。本文中，由所公開的方法制備的功能性抗體主要是異四聚體，它們有兩條相同的L鏈和兩條相同的H鏈通過多個二硫鍵相連并正確折疊。本發(fā)明一些方面涉及阻斷抗體，抗體拮抗劑和/或抗體激動劑?！白钄唷笨贵w或抗體“拮抗劑”是指，抑制或降低與其結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性者。這種阻斷可通過，例如干擾以下事件而發(fā)生配體與受體結(jié)合，形成受體復(fù)合物，受體復(fù)合物中酪氨酸激酶受體的酪氨酸激酶活性和/或酪氨酸激酶殘基在受體中的磷酸化或通過受體發(fā)生的磷酸化。例如，VEGF拮抗劑抗體與VEGF結(jié)合并抑制VEGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的能力。優(yōu)選的阻斷抗體或拮抗劑抗體徹底抑制抗原的生物學(xué)活性。
“抗體激動劑”是指，結(jié)合并激活諸如受體等抗原的抗體。一般而言，激動劑抗體與該受體的天然激動劑配體相比，受體激活能力至少在質(zhì)上相似(并且可能在量上基本相似)。
抗體特異性本發(fā)明可以應(yīng)用于具有任何合適的抗原結(jié)合特異性的抗體或抗體片段。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體特異于作為生物學(xué)上重要多肽的抗原。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體可以用于治療或診斷哺乳動物的疾病。本發(fā)明所得抗體或抗體片段特別可用于作為治療劑，如阻斷抗體，抗體激動劑或抗體偶聯(lián)物。治療性抗體的非限制性實例包括，抗-VEGF，抗-IgE，抗-CD11，抗-CD18，抗-組織因子，以及抗-TrkC抗體。對抗非多肽抗原(如腫瘤相關(guān)糖脂抗原)的抗體也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
術(shù)語“抗原”在本領(lǐng)域眾所周知，包括具有免疫原性的物質(zhì)(即免疫原)以及誘導(dǎo)免疫不應(yīng)答或無能的物質(zhì)(即無能原(anergen))。當(dāng)抗原是多肽時，它可以是跨膜分子(如受體)或配體，如生長因子?？乖瓕嵗ㄒ韵路肿幽I素；生長因子，包括人生長因子和牛生長因子；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；甲狀腺刺激素；脂蛋白；α-l-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；前胰島素；卵泡刺激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子如凝血因子VIIIC，凝血因子IX，組織因子(TF)，和von Willebrands因子；抗-凝血因子，如蛋白C；心房利鈉因子(atrial naturietic factor)；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活劑，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)；蛙皮素(bombesin)；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子α和β；腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)激活，通常由T細(xì)胞表達(dá)和分泌)；人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；前松弛素；小鼠絨毛膜促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，例如β內(nèi)酰胺酶；DNase；IgE；細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白A或D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，例如骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經(jīng)生長因子，例如NGF-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長因子，例如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生(morphogenetic)蛋白(BMP)；干擾素，例如干擾素-α、-β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(IL)，例如IL-1到IL-10；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變(decay)加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；粘著素(adderssin)；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；腫瘤相關(guān)抗原，例如HER2、HER3或HER4受體；以及上述任何多肽的片段。
本發(fā)明抗體的優(yōu)選抗原包括CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD34和CD46；ErbB受體家族的成員，例如EGF受體，HER2、HER3或HER4受體；細(xì)胞粘附分子，例如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β3整聯(lián)蛋白、以及包括其α或β亞單位的αv/β3整聯(lián)蛋白；生長因子如VEGF，組織因子(TF)，和TGF-β；α干擾素(α-IFN)；白細(xì)胞介素，例如IL-8；IgE；血型(bloodgroup)抗原Apo2，死亡受體；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；蛋白C等。本文中最優(yōu)選的目標(biāo)為VEGF，TF，CD19，CD20，CD40，TGF-β，CD11a，CD18，Apo2和C24。
可溶性抗原或其片段(可選與其它分子偶聯(lián)的形式)，可用作免疫原來制備抗體。對于跨膜分子，如受體，其片段(例如受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)可以用作免疫原?；蛘?，表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞可以用作免疫原。此類細(xì)胞可以源自天然來源(例如癌癥細(xì)胞系)，或者可以是通過重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞。用于制備抗體的其它抗原和它們的形式對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的抗體可以具有單特異性，雙特異性，三特異性，或更多特異性。多特異性抗體可以特異于單個分子上的不同表位，或者可以特異于不同分子上的表位。設(shè)計和制備多特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的，例如，Millstein等(1983)Nature 305537-539；Kostelny等(1992)J.Immunol.1481547-1553；WO 93/17715。
抗體片段本發(fā)明涉及抗體或抗體片段的原核或真核制備。多種形式的抗體片段是本領(lǐng)域已知的，并且包括在本文中。“抗體片段”僅包含完整抗體的一部分，通常包括完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，因此保留了結(jié)合抗原的能力。本發(fā)明抗體片段的實例包括(i)Fab片段，它具有VL，CL，VH和CH1區(qū)；(ii)Fab’片段，它是在CH1區(qū)的C末端具有一或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，它具有VH和CH1區(qū)；(iv)Fd’片段，它具有VH和CH1區(qū)，并且在CH1區(qū)的C末端具有一或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，具有抗體單臂的VL和VH區(qū)；(vi)dAb片段(Ward等，Nature 341，544-546(1989))，由VH區(qū)組成；(vii)分離的CDR區(qū)；(viii)F(ab′)2片段，一種二價片段，包括兩個通過二硫橋在鉸鏈區(qū)相連的Fab’片段；(ix)單鏈抗體分子(如單鏈Fv；scFv)(Bird等，Science 242423-426(1988)；Huston等，PNAS(USA)855879-5883(1988))；(x)具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的“二價抗體(diabodie)”，它在同一條多肽鏈上包含與輕鏈可變區(qū)(VL)相連的重鏈可變區(qū)(VH)(參見，如，EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993))；(xi)“線性抗體”，它包含一對串聯(lián)的Fd節(jié)段(VH-CH1-VH-CH1)，它們與互補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)(Zapata等Protein Eng.8(10)1057-1062(1995)；美國專利5,641,870)。
本發(fā)明還涉及經(jīng)過修飾而增加了穩(wěn)定性和/或用于制備多價抗體復(fù)合物的抗體片段。對眾多醫(yī)學(xué)應(yīng)用而言，抗體片段必須有足夠的對抗變性或蛋白裂解條件的穩(wěn)定性，而且理想的抗體片段應(yīng)該能以高親和力結(jié)合靶抗原。目前已開發(fā)出多種技術(shù)和材料來提供穩(wěn)定的和或多價的抗體片段。本發(fā)明的抗體片段可以與二聚體化結(jié)構(gòu)域融合。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體片段通過與二聚體化結(jié)構(gòu)域(如亮氨酸拉鏈)結(jié)合而二聚體化。
“亮氨酸拉鏈”是在多種真核轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白二聚體化基序，它使兩個DNA-結(jié)合區(qū)適當(dāng)并列，以便能結(jié)合轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列。亮氨酸拉鏈的二聚體化通過形成短的平行卷曲螺旋而發(fā)生，并且一對α-螺旋彼此纏繞，形成超螺旋。Zhu等(2000)J.Mol.Biol.3001377-1387。將這些卷曲螺旋結(jié)構(gòu)稱為“亮氨酸拉鏈”，是由于它們在每7個位置中優(yōu)選一個亮氨酸，這種結(jié)構(gòu)也已用于其它蛋白(包括抗體)的二聚化設(shè)計中。Hu等(1990)Science 2501400-1403；Blondel and Bedouelle(1991)Protein Eng.4457。已有數(shù)種亮氨酸拉鏈被鑒定為對二聚體和四聚體形式的抗體構(gòu)建體特別有用。
Pluckthun and Pack(1997)Immunotech.383-105；Kostelny等(1992)J.Immunol.1481547-1553。
抗體變體本發(fā)明還涉及抗體或其片段的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性?？贵w的氨基酸序列變體可通過在抗體核酸中導(dǎo)入適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖?，或通過肽合成法來制備。所述修飾包括，例如，抗體的氨基酸序列中的殘基缺失，和/或插入和/或取代。可對缺失、插入、和取代進(jìn)行任意組合以獲得最終構(gòu)建體，只要該最終構(gòu)建體具有所需特性?？梢栽谛纬伤隹贵w的氨基酸序列時，在其序列中引入氨基酸變化。
一種鑒別抗體中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是Cunningham和Wells(1989)，Science，2441081-1085所述的“丙氨酸掃描誘變”。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如arg，asp，his，lys，和glu)，并用中性或帶負(fù)電的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與抗原的相互作用。那些證實對取代具有功能敏感性的氨基酸位置，通過在取代位點(diǎn)引入進(jìn)一步的變體或其它變體，或者引入能提供取代位點(diǎn)的進(jìn)一步的變體或其它變體，而改進(jìn)。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但突變本身的性質(zhì)不必是預(yù)定的。例如，為分析在指定位點(diǎn)處突變的進(jìn)行，在靶密碼子或區(qū)域?qū)嵭斜彼釖呙杌螂S機(jī)誘變，并篩選所表達(dá)的抗體的預(yù)期活性。
氨基酸序列插入包括，氨基-和/或羧基-端的融合(其長度從一個殘基至包含100個或更多殘基的多肽)，以及序列內(nèi)單個或多個氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括，帶有N-末端甲硫氨酰殘基的抗體，或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括，使抗體的N-或C-末端與酶(例如，針對ADEPT的酶)或能增加該抗體的血清半壽期的多肽進(jìn)行融合。
另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體使抗體分子中至少一個氨基酸殘基被另一種不同的殘基取代。最有興趣進(jìn)行取代誘變的位點(diǎn)包括超變區(qū)，也可以改變FR。保守取代見表1的“優(yōu)選取代”欄。如果這些取代引起生物學(xué)活性的改變，則可引入表1中“取代舉例” 欄的更實質(zhì)性改變，或進(jìn)一步在下文的氨基酸分類中所述的更實質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。
表1


抗體的生物學(xué)特性的實質(zhì)性修改可通過選擇性取代來完成，所選的取代應(yīng)在維持(a)取代區(qū)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層結(jié)構(gòu)或螺旋構(gòu)象，(b)該分子的靶位點(diǎn)的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈的大小，這幾方面有顯著不同的效應(yīng)。天然殘基根據(jù)共有的側(cè)鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。
與維持抗體正確構(gòu)象無關(guān)的任何半胱氨酸殘基也可被取代，通常被絲氨酸取代，以提高該分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反，可在抗體中添加半胱氨酸連接以提高其穩(wěn)定性。
取代變體的特別優(yōu)選類型包括取代親本抗體(例如，人源化抗體或人的抗體)超變區(qū)的一或多個殘基。通常，最終選出的用于進(jìn)一步開發(fā)的變體相對于其親本抗體應(yīng)具有改進(jìn)的生物學(xué)活性。產(chǎn)生這種取代變體的一個方便方法涉及利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行親和力成熟。簡單地說，使超變區(qū)的幾個位點(diǎn)(如6-7個位點(diǎn))突變以便在每一位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣產(chǎn)生的抗體變體展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個顆粒內(nèi)包裝的M13的基因III產(chǎn)物融合形成的融合體。然后篩選經(jīng)噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)。為了鑒定備選的超變區(qū)修飾位點(diǎn)，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結(jié)合作出主要貢獻(xiàn)的超變區(qū)殘基?；蛘?，或另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以確定抗原與抗體之間的接觸點(diǎn)也較有利。這些接觸殘基及其鄰近殘基是根據(jù)本文所述技術(shù)進(jìn)行取代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對它們?nèi)窟M(jìn)行篩選，選出在一或多個相關(guān)實驗中具有優(yōu)勢特性的抗體以便進(jìn)一步開發(fā)。
編碼抗體的氨基酸序列變體的核酸分子，可通過本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括，但不限于，從天然來源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過對早先制備的抗體變體或未變異的抗體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變，PCR誘變和盒式誘變來制備。
可能希望在本發(fā)明抗體的Fc區(qū)中引入一或多個氨基酸修飾，從而制備Fc區(qū)變體。所述Fc區(qū)變體可包含人Fc區(qū)序列(如人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的Fc區(qū))，其中在一或多個氨基酸位置包含氨基酸修飾(如取代)。
在一個實施方案中，所述Fc區(qū)變體可以表現(xiàn)經(jīng)過改變而全新的Fc受體(FcRn)結(jié)合親和力。這種改變的Fc區(qū)可以在Fc區(qū)的任何一或多個下述氨基酸位置包含氨基酸修飾238，252，253，254，255，256，265，272，286，288，303，305，307，309，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，386，388，400，413，415，424，433，434，435，436，439或447，其中的Fc區(qū)殘基編號采用的是Kabat中的EU指數(shù)。與FcRn的結(jié)合降低的那些Fc區(qū)變體在Fc區(qū)的下列任何一或多個位置包含氨基酸修飾252，253，254，255，288，309，386，388，400，415，433，435，436，439或447，其中的Fc區(qū)殘基編號采用的是Kabat中的EU指數(shù)。或者，上述Fc區(qū)變體可表現(xiàn)出與FcRn的結(jié)合增加，并在Fc區(qū)的任何一或多個下述氨基酸位置包含氨基酸修飾238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，其中的Fc區(qū)殘基編號采用的是Kabat中的EU指數(shù)。
與FcγR的結(jié)合降低的那些Fc區(qū)變體，在Fc區(qū)的任何一或多個下述氨基酸位置包含氨基酸修飾238，239，248，249，252，254，265，268，269，270，272，278，289，292，293，294，295，296，298，301，303，322，324，327，329，333，335，338，340，373，376，382，388，389，414，416，419，434，435，437，438或439，其中的Fc區(qū)殘基編號采用的是Kabat中的EU指數(shù)。
例如，與FcγRI的結(jié)合降低的那些Fc區(qū)變體，在Fc區(qū)的任何一或多個下述氨基酸位置包含氨基酸修飾238，265，269，270，327或329，其中的Fc區(qū)殘基編號采用的是Kabat中的EU指數(shù)。
Fc區(qū)變體可能表現(xiàn)出與FcγRII的結(jié)合降低，并在Fc區(qū)的任何一或多個下述氨基酸位置包含氨基酸修飾238，265，269，270，292，294，295，298，303，324，327，329，333，335，338，373，376，414，416，419，435，438或439，其中的Fc區(qū)殘基編號采用的是Kabat中的EU指數(shù)。
Fc區(qū)變體可能表現(xiàn)出與FcγRIII的結(jié)合降低，并在Fc區(qū)的任何一或多個下述氨基酸位置包含氨基酸修飾238，239，248，249，252，254，265，268，269，270，272，278，289，293，294，295，296，301，303，322，327，329，338，340，373，376，382，388，389，416，434，435或437，其中的Fc區(qū)殘基編號采用的是Kabat中的EU指數(shù)。
具有改變(即改進(jìn)或消除)的C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)的那些變體可參見WO99/51642。這些變體可能在Fc區(qū)的任何一或多個下述氨基酸位置包含氨基酸修飾270，322，326，327，329，331，333或334。關(guān)于Fc區(qū)變體，還可參見Duncan & Winter Nature 322738-40(1988)；美國專利5,648,260；美國專利5,624,821；以及WO94/29351。
人抗體，人源化抗體或親和力成熟的抗體“人抗體”具有對應(yīng)于由人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列和/或它是利用本文公開的制備人抗體的任何技術(shù)制備的。人抗體的這種定義特別排出了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
本發(fā)明既涉及人抗體，也涉及人源化抗體?！叭嗽椿毙问降姆侨?如鼠)抗體是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在多數(shù)情況下，人源化抗體是下述人免疫球蛋白(受體(recipient)抗體)，其中受體的超變區(qū)殘基被非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類(供體(donor)抗體)的具有所需特異性、親和力和能力(capacity)的超變區(qū)的殘基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。此外，人源化抗體可包含未在受體抗體或供體抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進(jìn)一步強(qiáng)化抗體的功能。一般情況下，人源化抗體基本上包含至少一個、通常兩個可變區(qū)的全部，其中所有或基本上所有超變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗體任選還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常為人免疫球蛋白的至少一部分。詳見Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature332323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。還可參見以下綜述及其中引用的參考文獻(xiàn)Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions231035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5428-433(1994)。
“親和力成熟的”抗體在其一或多個CDR中有一或多個變化，從而導(dǎo)致該抗體針對抗原的親和力比不具有那些變化的親本抗體增強(qiáng)。優(yōu)選的親和力成熟抗體對靶抗原的親和力在納摩爾水平或者甚至是皮摩爾水平。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知的方法來制備。Marks等Bio/Technology10779-783(1992)描述了通過VH和VL區(qū)重排(shuffling)實現(xiàn)親和力成熟。CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變可參見Barbas等Proc Nat.Acad.Sci，USA913809-3813(1994)；Schier等Gene 169147-155(1995)；Yelton等J.Immunol.1551994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.154(7)3310-9(1995)；Hawkins等，J.Mol.Biol.226889-896(1992)。
使非人抗體人源化的各種方法為本領(lǐng)域已知。例如，人源化過程可以基本如Winter及其同事(Jones等(1986)Nature 321522-525；Riechmann等(1988)Nature 332323-327；Verhoeyen等(1988)Science 2391534-1536)所述，用超變區(qū)序列取代人抗體的相應(yīng)序列來進(jìn)行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人類物種的相應(yīng)序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中超變區(qū)殘基以及可能有一部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代。
選擇可用于制備人源化抗體的人類可變區(qū)(重鏈和輕鏈)，對降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂“最適應(yīng)(best-fit)”方法，針對已知人類可變區(qū)序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等(1993)J.Immunol.1512296；Chothia等(1987)J. Mol.Biol.196901。另一種方法采用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列衍生特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285；Presta等(1993)J.Immunol.，1512623。
更重要的是，將抗體人源化后仍保留對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物來制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象的計算機(jī)程序。通過觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基，通過這種方法，可從受體和引進(jìn)序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對靶抗原的親和力增加?？傊儏^(qū)殘基直接并且最主要涉及對抗原結(jié)合的影響。
抗體衍生物本發(fā)明的抗體和抗體變體，可以通過進(jìn)一步修飾，而包含本領(lǐng)域已知并且容易得到的其它非蛋白性質(zhì)的組分。衍生化尤其可用于改進(jìn)或恢復(fù)所述抗體或其片段的生物學(xué)特性。例如，對抗體片段進(jìn)行PEG修飾可以改變穩(wěn)定性，體內(nèi)循環(huán)半壽期，結(jié)合親和力，溶解度以及對蛋白裂解的抗性。
優(yōu)選適合于抗體衍生化的組分為水溶性聚合物。水溶性聚合物分子的非限制性實例包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊環(huán)，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/馬來酸酐共聚物，聚氨基酸(同型聚合物或隨機(jī)共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇同型聚合物，聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物(prolypropylene oxide/ethylene oxide co-polymer)，聚氧乙烯化多元醇(如甘油)，聚乙烯醇，及它們的混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的穩(wěn)定性而在生產(chǎn)中有利。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或非分支的。與抗體結(jié)合的聚合物數(shù)量可以不等，當(dāng)有不止一個聚合物結(jié)合時，它們可以是相同或不同的分子。一般而言，衍生化所用聚合物的數(shù)量和類型可以根據(jù)以下因素來決定，所述因素包括但不限于待改進(jìn)的抗體的具體特性或功能，抗體衍生物是否用于治療特定疾病。
一般而言，由本文所述原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體或抗體片段未經(jīng)糖基化，并且其Fc區(qū)缺乏可以檢測到的效應(yīng)子活性。在一些情況中，可能希望至少部分地恢復(fù)天然抗體的一或多種效應(yīng)子功能。因此，本發(fā)明涉及將適當(dāng)?shù)慕M分與非糖基化抗體Fc區(qū)中鑒定出的位點(diǎn)結(jié)合，從而恢復(fù)效應(yīng)子功能的方法。用于此目的的優(yōu)選組分是PEG，也可以采用其它碳水化合物聚合物。PEG化可以通過本領(lǐng)域已知的任何PEG化反應(yīng)來進(jìn)行。參見，例如，EP 0401384；EP 0154316；WO 98/48837。在一個實施方案中，首先用半胱氨酸殘基取代所述抗體上鑒定出的位置(如抗體或抗體變體通常被糖基化的位置，或者抗體表面的位置)上的殘基。優(yōu)選用半胱氨酸取代下列一或多個位置上的殘基297，298，299，264，265和239(編號按照Kabat中的EU指數(shù))。表達(dá)后，這種半胱氨酸取代型抗體變體可以有各種形式的PEG(或預(yù)合成的碳水化合物)與游離半胱氨酸殘基進(jìn)行化學(xué)連接。
抗體制備載體構(gòu)建本文中術(shù)語“載體”是指能轉(zhuǎn)運(yùn)與它相連的另一種核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)?！?，它是指一種環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其中連接了其它DNA節(jié)段。另一類載體是病毒載體，其中已將其它DNA節(jié)段連接到病毒基因組中。某些載體能在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制(如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體，以及哺乳動物附加體載體)。其它載體(如，哺乳動物非-附加體載體)可以通過引入宿主細(xì)胞而整合到宿主細(xì)胞的基因組中，然后隨宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)與其可操作相連的基因的表達(dá)。這類載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡稱“重組載體”)。一般情況下，重組DNA技術(shù)中應(yīng)用的表達(dá)載體常常為質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。
本文中術(shù)語“翻譯單元”是指一種遺傳元件，它包含編碼多肽鏈及其鄰接的控制區(qū)的核苷酸序列?！班徑拥目刂茀^(qū)”包括，例如，翻譯起始區(qū)(下文稱TIR)和終止區(qū)。
本文中“翻譯起始區(qū)”或TIR是指，使目的基因的有效翻譯起始的核酸區(qū)。一般情況下，具體翻譯單元內(nèi)部的TIR涵蓋核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)以及RBS的5’和3’側(cè)序列。RBS最起碼包含Shine-Dalgarno區(qū)和起始密碼子(AUG)。因此，TIR還包括需要翻譯的核酸序列的至少一部分。優(yōu)選TIR包括編碼分泌信號肽的序列，它位于翻譯單元內(nèi)部的輕鏈或重鏈編碼序列之前。TIR變體在TIR區(qū)內(nèi)部包含改變TIR效力(如下文定義的其翻譯強(qiáng)度)的序列變異(尤其是取代)。優(yōu)選本發(fā)明的TIR變體在位于翻譯單元內(nèi)部輕鏈或重鏈編碼序列之前的信號序列的最初約2-約14個密碼子，優(yōu)選約4-12個密碼子，更優(yōu)選約6個密碼子內(nèi)部包含序列取代。
本文中術(shù)語“翻譯強(qiáng)度”是指，在對照系統(tǒng)中分泌多肽的度量值，在所述系統(tǒng)中，一或多個TIR變體被用于指導(dǎo)多肽分泌，并且結(jié)果與野生型TIR或一些其它對照在相同培養(yǎng)和試驗條件下進(jìn)行比較。在不受任何一種理論限制的前題下，本文中的“翻譯強(qiáng)度”包括，例如，mRNA穩(wěn)定性、核糖體與核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的效力、以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模式，的度量值。
“分泌信號序列”或“分泌信號肽”是指一種短的氨基酸序列，它可用于指導(dǎo)新合成的目的蛋白跨過細(xì)胞膜，例如原核細(xì)胞的內(nèi)膜或內(nèi)膜加外膜。這樣以來，在例如原核細(xì)胞中，目的蛋白如輕鏈或重鏈多肽被分泌到原核宿主細(xì)胞的周質(zhì)中或者被分泌到培養(yǎng)基中。分泌信號序列可以是該宿主細(xì)胞的內(nèi)源序列，或者可以是外源序列，包括需要表達(dá)的多肽的天然信號序列。分泌信號序列通常位于多肽的N-末端，并且通常在所述多肽的生物合成和從細(xì)胞質(zhì)分泌這兩個過程之間被酶解除去。因此，分泌信號序列一般不會出現(xiàn)在最終的蛋白產(chǎn)物中。
本文中術(shù)語“宿主細(xì)胞”(或“重組宿主細(xì)胞”)是指已經(jīng)發(fā)生遺傳改變的細(xì)胞，或者是指能通過引入外源多核苷酸(如重組質(zhì)?；蜉d體)而發(fā)生遺傳改變的細(xì)胞。應(yīng)理解，所述術(shù)語不僅是指具體的主體細(xì)胞，還指這類細(xì)胞的后代細(xì)胞。在成功傳代中由于突變或環(huán)境影響而可能發(fā)生某些修飾，故事實上所述后代可能并不完全等同于親代細(xì)胞，但它們?nèi)园ㄔ诒疚乃觥八拗骷?xì)胞”的范疇內(nèi)。
編碼本發(fā)明抗體分子的輕鏈和重鏈的DNA序列可以用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)獲得。所需DNA序列可以從抗體生成細(xì)胞如雜交瘤細(xì)胞中分離并測序?；蛘?，可以用核苷酸合成儀或PCR技術(shù)合成該DNA。一旦獲得了編碼輕鏈和重鏈的DNA，就可以將它們插入能在原核或真核宿主中復(fù)制、表達(dá)并分泌外源多核苷酸的重組載體中。為了本發(fā)明的目的可以采用現(xiàn)有的以及本領(lǐng)域已知的多種載體。對適當(dāng)載體的選擇取決于需要插入的核酸的大小，以及希望用該載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì)胞。
一般用包含來源于宿主細(xì)胞相容性物種的復(fù)制子和控制序列的重組載體作為親代載體，來構(gòu)建本發(fā)明的具體載體。載體通常攜有復(fù)制起點(diǎn)和標(biāo)記序列作為基本組成，所述標(biāo)記序列能在經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中提供表型選擇。復(fù)制起點(diǎn)是能使載體在一或多個選定的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的核酸序列。一般在克隆載體中，該序列是能使載體獨(dú)立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，它包括復(fù)制起點(diǎn)或自我復(fù)制序列。這樣的序列對于各種細(xì)菌、酵母和病毒而言是眾所周知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌。
表達(dá)載體和克隆載體可包含篩選基因，也稱為可篩選標(biāo)記。典型的篩選基因編碼蛋白，該蛋白(a)提供對抗生素或其它毒素，如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素等的抗性，(b)彌補(bǔ)營養(yǎng)缺陷，或(c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中不能得到的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，例如為芽孢桿菌提供編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。篩選方案的一個實例是利用藥物阻滯宿主細(xì)胞的生長。那些被異源基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生能賦予藥物抗性的蛋白，從而在篩選過程中存活。適合于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的質(zhì)粒載體的實例是pBR322。pBR322包含編碼氨芐青霉素(Amp)和四環(huán)素(Tet)抗性的基因，并因此提供了鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡單方法。pBR322的衍生物或其它微生物質(zhì)粒或噬菌體也可以用作親代載體。用于表達(dá)特定抗體的pBR322衍生物的實例詳見Carter等的美國專利5,648,237。
除此之外，含有與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體也可以作為轉(zhuǎn)化載體與它們的宿主一起使用。例如，象λGEM.TM.-11這樣的噬菌體可以用于制備那些能用于轉(zhuǎn)化易感宿主細(xì)胞(如大腸桿菌LE392)的重組載體。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的重組載體至少包含兩個翻譯單元，一個用于輕鏈表達(dá)，另一個用于重鏈表達(dá)。而且，用于輕鏈和重鏈的這兩個翻譯單元受不同啟動子控制。啟動子是位于編碼序列起點(diǎn)的上游(5′)、并控制編碼序列表達(dá)的非翻譯序列(通常約100-1000bp)。這類啟動子一般分為兩類誘導(dǎo)型和組成型。誘導(dǎo)型啟動子是指，當(dāng)培養(yǎng)條件發(fā)生一些改變，例如存在或缺乏某種營養(yǎng)，或者改變溫度或pH時，應(yīng)答這樣的改變而使受其控制的DNA的轉(zhuǎn)錄水平升高的那些啟動子。
為了本發(fā)明的目的，可以用組成型或誘導(dǎo)型啟動子作為第一種啟動子來控制第一條鏈的及時表達(dá)，并用誘導(dǎo)型啟動子作為第二種啟動子來控制隨后第二條鏈的表達(dá)。在一個優(yōu)選實施方案中，所述第一種啟動子和第二種啟動子都是受到嚴(yán)格(tight)調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)型啟動子。由各種潛在的宿主細(xì)胞識別的非常多種啟動子是本領(lǐng)域已知的。選定的啟動子序列可以通過限制酶消化從源頭DNA分離并插入本發(fā)明的載體中。另一種方法是合成所選定的啟動子。天然啟動子序列和多種異源啟動子都可以用于指導(dǎo)靶基因的擴(kuò)增和/或表達(dá)。但優(yōu)選異源啟動子，因為它們與天然靶多肽的啟動子相比，通常能進(jìn)行更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄，并且靶基因的表達(dá)量更高。
適合于在原核宿主中應(yīng)用的啟動子包括phoA啟動子，β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜合啟動子如tac或trc啟動子。然而，其它已知能在細(xì)菌中發(fā)揮作用的啟動子(例如其它已知的細(xì)菌或噬菌體啟動子)也是適合的。它們的核苷酸序列已經(jīng)被公開，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用能提供任何所需的限制酶位點(diǎn)的接頭或銜接子，將它們與編碼靶輕鏈和重鏈的翻譯單元連起來(Siebenlist等(1980)Cell 20269)。更優(yōu)選用于本發(fā)明的啟動子是PhoA啟動子和TacII啟動子。能在真核宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的啟動子是本領(lǐng)域已知的，例如美國專利6,331,415中描述的那些。這類啟動子的實例可包括從多瘤病毒、腺病毒2型或猴病毒40(SV40)衍生的那些。
本發(fā)明重組載體的每一翻譯單元包含插入基因充分表達(dá)所必需的附加非翻譯序列。重組載體的這類必需序列是本領(lǐng)域已知的，包括，例如，位于起始密碼子5’側(cè)的Shine-Dalgarno區(qū)和位于翻譯單元3’末端的轉(zhuǎn)錄終止子(如，λto)。
重組載體的每一翻譯單元還包含能指導(dǎo)所表達(dá)的多肽鏈跨膜分泌的分泌序列組分。一般情況下，分泌信號序列可以是載體的組成部分，或者可以是插入載體的靶多肽DNA的一部分。為本發(fā)明目的而選定的分泌信號序列應(yīng)該是可以由宿主細(xì)胞識別并加工(即通過信號肽酶裂解)的信號序列。對于不能識別并加工所述異源多肽的天然信號序列的原核宿主細(xì)胞，用選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp，或熱穩(wěn)定腸毒素II(STII)前導(dǎo)區(qū)，LamB，PhoE，PelB，OmpA或MBP的原核信號序列替換所述天然信號序列。在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中，表達(dá)系統(tǒng)的兩個翻譯單元中用到的信號序列都是STII信號序列或其變體。優(yōu)選編碼這類信號序列的DNA與編碼輕鏈或重鏈的DNA的5’-連接，并且位于同一閱讀框內(nèi)，以便形成融合多肽。一旦從宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分泌出來，信號肽序列就從成熟多肽上被酶解下來。
在本發(fā)明一些方面中，輕鏈和重鏈除了表達(dá)時間不同以外，表達(dá)量之比也受到調(diào)節(jié)，目的是使最終分泌出的正確裝配的抗體或其片段產(chǎn)量最大。所述調(diào)節(jié)是通過同時調(diào)節(jié)本發(fā)明重組載體中輕鏈和重鏈的翻譯強(qiáng)度來實現(xiàn)的。一種調(diào)節(jié)翻譯強(qiáng)度的技術(shù)由Simmons等的美國專利5,840,523公開。簡言之，該方法利用了翻譯單元內(nèi)部翻譯起始區(qū)(TIR)的變體。對于一種給定的TIR，可以在一定翻譯強(qiáng)度范圍內(nèi)生成一系列氨基酸或核酸序列變體，從而能方便地調(diào)整該因子，使特定鏈的表達(dá)達(dá)到所需水平。TIR變體可以通過導(dǎo)致密碼子改變從而改變氨基酸序列的常規(guī)誘變技術(shù)來制備，但優(yōu)選在核苷酸序列中產(chǎn)生靜默改變(如下述)。TIR中的改變包括，例如，Shine-Dalgarno序列的數(shù)目或間隔(spacing)的改變，以及信號序列中的改變。產(chǎn)生突變型信號序列的一種優(yōu)選方法是，在編碼序列的最開始處生成一種不改變該信號序列的氨基酸序列(即為靜默改變)的“密碼子庫”。這可以通過改變每一密碼子的第三個核苷酸位置來實現(xiàn)；另外，一些氨基酸，如亮氨酸，絲氨酸，和精氨酸有多個可以在生成上述庫時增加復(fù)雜性的第一和第二位置。這種誘變方法詳見Yansura等(1992)METHODSA Companion to Methods inEnzymol.4151-158。
優(yōu)選生成一套載體，使其具有對應(yīng)于每一翻譯單元的TIR強(qiáng)度。這種限定使得能夠在各種TIR強(qiáng)度組合下比較每條鏈的表達(dá)水平以及抗體產(chǎn)物的產(chǎn)量。TIR強(qiáng)度可以按照Simmons等的美國專利5,840,523的詳細(xì)描述定量報告基因的表達(dá)水平來確定。為了本發(fā)明的目的，載體中一對具體的TIR的翻譯強(qiáng)度組合可以表示為(N-輕鏈，M-重鏈)，其中N是輕鏈的相對TIR強(qiáng)度，M是重鏈的相對TIR強(qiáng)度。例如，(7-輕鏈，3-重鏈)是指，載體在輕鏈表達(dá)方面的相對TIR強(qiáng)度約為7，在重鏈表達(dá)方面的相對TIR強(qiáng)度約為3。根據(jù)翻譯強(qiáng)度的比較，選出所需的各個TIR，組合在本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建體中。
含有一或多個上述組分的合適載體利用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)和或本領(lǐng)域已知的其它分子克隆技術(shù)構(gòu)建。將分離的質(zhì)?；駾NA片段切割，裁剪(tailor)，并重新連接成能產(chǎn)生所需質(zhì)粒的形式。
為了分析證實所構(gòu)建的質(zhì)粒中的正確序列，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，通過氨芐青霉素或四環(huán)素抗性選出成功轉(zhuǎn)化體。從轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，通過限制性核酸內(nèi)切酶消化進(jìn)行分析，和/或通過Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467或Messing等(1981)Nucleic Acids Res.9309所述方法，或Maxam等(1980)Methods in Enzymology 65499所述方法測序?？梢圆捎枚喾N市售自動測序儀測定質(zhì)粒的序列。例如，ABI PRISM3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)是一種自動毛細(xì)電泳測序儀，它能分析熒光標(biāo)記的DNA片段。該儀器附帶的測序化學(xué)指南(Sequencing Chemistry Guide)中介紹了樣品的制備。
適合于表達(dá)本發(fā)明抗體的原核宿主細(xì)胞包括古細(xì)菌和真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物。有用的細(xì)菌的實例包括埃希氏菌(如大腸桿菌)，芽孢桿菌(如枯草芽孢桿菌)，腸細(xì)菌，假單胞菌(如銅綠假單胞菌)，鼠傷寒沙門氏菌，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)，克雷伯氏菌，變形菌(Proteus)，志賀氏菌，根瘤菌(Rhizobia)，透明顫菌(Vitreoscilla)，或副球菌(Paracoccus)。優(yōu)選使用革蘭氏陰性細(xì)胞。更優(yōu)選使用大腸桿菌細(xì)胞作為本發(fā)明的宿主。
很多大腸桿菌菌株都適于作為本文所述的表達(dá)宿主或作為親代宿主以便從中產(chǎn)生改良的表達(dá)宿主。本領(lǐng)域已知并且可得到的大腸桿菌菌株包括，但不限于，大腸桿菌W3110(ATCC 27，325)，大腸桿菌294(ATCC 31，446)，大腸桿菌B，大腸桿菌1776(ATCC 31，537)和大腸桿菌RV308(ATCC31，608)。也可以使用上述任何細(xì)菌的突變細(xì)胞。當(dāng)然，必需根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制子的復(fù)制能力來選擇合適的細(xì)菌。例如，用眾所周知的質(zhì)粒如pBR322，pBR325，pACYC177，或pKN410來提供復(fù)制子時，大腸桿菌，沙雷氏菌或沙門氏菌適合用作宿主。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞應(yīng)分泌最少量的蛋白裂解酶，且最好是在細(xì)胞培養(yǎng)物中摻入額外的蛋白酶抑制劑。
合適的真核宿主細(xì)胞也是本領(lǐng)域已知的。例如，宿主細(xì)胞包括酵母，VERO，HeLa，CHO，W138，BHK，COS-7和MDCK細(xì)胞。
宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)宿主細(xì)胞用上述重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染(術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”在本文中可以互換使用)，并在改進(jìn)型傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經(jīng)改進(jìn)已適于誘導(dǎo)啟動子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。
轉(zhuǎn)化是指，將DNA引入原核宿主以使DNA能夠作為染色體外元件或以染色體整合體的形式復(fù)制。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，用適合于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。利用氯化鈣進(jìn)行鈣處理的方法常用于包含堅固的細(xì)胞壁屏障的細(xì)菌細(xì)胞。另一種轉(zhuǎn)化方法使用聚乙二醇/DMSO。還有一種技術(shù)是電穿孔。轉(zhuǎn)染是指由宿主細(xì)胞攝取表達(dá)載體，而不論事實上是否表達(dá)了任何編碼序列。多種轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，例如，Ca PO4沉淀和電穿孔。成功的轉(zhuǎn)染一般是在宿主細(xì)胞中出現(xiàn)關(guān)于該載體操作的任何征兆時可以予以識別。
用于制備本發(fā)明多肽的原核細(xì)胞在本領(lǐng)域已知的適于培養(yǎng)所選宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基的實例包括添加了必需的營養(yǎng)添加物的luria broth(LB)。在一個優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)基還包含一種選擇制劑，它是基于表達(dá)載體的構(gòu)建而選出的，可以選擇性允許含有該表達(dá)載體的原核細(xì)胞生長。例如，在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素，使表達(dá)氨芐青霉素抗性基因的細(xì)胞生長。除了碳源，氮源，和無機(jī)磷酸鹽源以外，還可以包括適當(dāng)濃度的任何必需添加物，它們可以單獨(dú)加入，或者與另一種添加物或培養(yǎng)基組合成混合物再加入，如復(fù)合氮源。還可選在培養(yǎng)基中包含一或多種還原劑，所述還原劑選自谷胱甘肽，半胱氨酸，胱胺，硫代乙醇酸，二硫赤蘚醇和二硫蘇糖醇。
原核宿主細(xì)胞在適當(dāng)溫度中培養(yǎng)。例如，大腸桿菌優(yōu)選在約20℃-約39℃，更優(yōu)選約25℃-約37℃，甚至更優(yōu)選約30℃生長。培養(yǎng)基的pH可以是在約5-約9的范圍內(nèi)的任何pH，這主要取決于宿主生物。對于大腸桿菌，pH優(yōu)選約6.8-約7.4，更優(yōu)選約7.0。
用于制備本發(fā)明抗體的真核宿主細(xì)胞可以在本領(lǐng)域已知的各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，市售培養(yǎng)基如Ham’s F10(Sigma)，基本必需培養(yǎng)基((MEM)Sigma)，RPMI-1640(Signma)，和Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)都適于培養(yǎng)哺乳動物真核宿主細(xì)胞。此外，Ham and Wallace，Meth.Enz.，5844(1979)，Barnes and Sato，Anal.Biochem.，102255(1980)，U.S.4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；U.S.Pat.Re.30,985；或U.S.5,122,469(所有文獻(xiàn)都全文引入本文作為參考)所述的培養(yǎng)基也可以用作宿主細(xì)胞培養(yǎng)基。任何上述培養(yǎng)基可以根據(jù)需要添加激素和/或其它生長因子(如胰島素，運(yùn)鐵蛋白，或表皮生長因子)，鹽(如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸鹽)，緩沖液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸腺嘧啶)，抗生素(如GentamycinTM)，痕量元素(定義為通常以微摩爾水平的終濃度出現(xiàn)的化合物)，和葡萄糖或等效能源。還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)濃度的任何其它必需添加物。培養(yǎng)條件，如溫度，pH等，都是前面在選定的表達(dá)宿主上用到的那些，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見的。
輕鏈和重鏈的分時分別表達(dá)一旦宿主細(xì)胞生長到一定密度，就改變培養(yǎng)條件以便促進(jìn)蛋白合成。根據(jù)本發(fā)明，輕鏈和重鏈在合成期間的不同時間點(diǎn)被誘導(dǎo)。在一個方面中，利用上述雙-啟動子載體實現(xiàn)輕鏈和重鏈的分時分別表達(dá)。當(dāng)本發(fā)明雙-啟動子載體中使用的是誘導(dǎo)型啟動子時，在適于活化該啟動子的條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。在一個優(yōu)選實施方案中，兩個啟動子都是誘導(dǎo)型的。更優(yōu)選所述雙啟動子分別為phoA和TacII。例如，可以制備一種載體，其中用phoA啟動子控制輕鏈轉(zhuǎn)錄，用TacII啟動子控制重鏈轉(zhuǎn)錄。在誘導(dǎo)的第一階段中，被所述phoA/TacII雙啟動子載體轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞，通過在磷酸鹽限制培養(yǎng)基中培養(yǎng)來誘導(dǎo)phoA啟動子并表達(dá)輕鏈。待輕鏈表達(dá)持續(xù)了所需的時間以后，向培養(yǎng)基中加入足量IPTG來誘導(dǎo)TacII啟動子并產(chǎn)生重鏈。
在一個方面中，本發(fā)明的抗體或抗體片段可以在細(xì)菌宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。有多種方法可用于改進(jìn)可溶性功能抗體或抗體片段在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中的產(chǎn)生。例如，已發(fā)現(xiàn)trxB基因缺陷型大腸桿菌菌株能促進(jìn)在細(xì)胞質(zhì)中形成二硫鍵，因此它可用于促進(jìn)能正確形成二硫鍵的功能性抗體分子在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)。Proba等(1995)Gene 159203-207?？梢灾苽淇贵w片段的變體，以便替換半胱氨酸殘基，使VH和VL中都不必形成二硫鍵，這種抗體片段變體(有時稱為“內(nèi)體(intrabodies)”)因此可以在不利于有效形成二硫橋的還原環(huán)境(如細(xì)菌細(xì)胞質(zhì))中產(chǎn)生。Proba等(1998)J.Mol.Biol.275245-253。
當(dāng)分泌信號序列用于本發(fā)明的載體中時，所表達(dá)的輕鏈和重鏈多肽被分泌到宿主細(xì)胞的周質(zhì)中，并且從該周質(zhì)中回收。蛋白回收通常涉及微生物的破環(huán)，一般是通過諸如滲透休克，超聲波降解或裂解等手段實現(xiàn)。一旦細(xì)胞被破環(huán)，細(xì)胞碎片或整個細(xì)胞可以通過離心或過濾除去。蛋白可以進(jìn)一步純化，例如，通過親和樹脂層析純化?；蛘撸梢詫⒌鞍邹D(zhuǎn)運(yùn)到培養(yǎng)基中，從那里分離出來?？梢詫⒓?xì)胞與培養(yǎng)物分開，將培養(yǎng)上清過濾并濃縮，以便進(jìn)一步純化出蛋白產(chǎn)物。表達(dá)的多肽可以用常見方法，如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡分析，進(jìn)行進(jìn)一步分離和鑒定。
在本發(fā)明的一個方面，所述抗體通過發(fā)酵方法進(jìn)行大規(guī)模制備。目前有多種可用于制備重組蛋白的大規(guī)模補(bǔ)料分批發(fā)酵方法。大規(guī)模發(fā)酵的容量至少為1000升，優(yōu)選約1,000-100,000升。這些發(fā)酵罐使用葉輪式攪拌器或其它合適的手段來分散氧氣和營養(yǎng)，尤其是葡萄糖(這是優(yōu)選的碳源/能源)。小規(guī)模發(fā)酵通常是指在不超過近100升容積的發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，所述容積可以在約1升-約100升范圍內(nèi)不等。
在一種發(fā)酵過程中，通常在細(xì)胞于適當(dāng)條件中生長至所需密度，例如OD550約180-270以后，開始誘導(dǎo)蛋白表達(dá)?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明所采用的載體構(gòu)建體選用多種誘導(dǎo)劑，這是本領(lǐng)域已知的并且在上文中已經(jīng)描述。細(xì)胞在誘導(dǎo)之前可以進(jìn)行短時間的生長。通常將細(xì)胞誘導(dǎo)約12-50小時，也可以采用更長或更短的誘導(dǎo)時間。
為了改進(jìn)本發(fā)明抗體分子的產(chǎn)量和質(zhì)量，可以對各種發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)整。例如，為了改進(jìn)所分泌的抗體多肽的正確裝配和折疊，可以用過表達(dá)侶伴蛋白(chaperone)的其它載體共轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞，所述侶伴蛋白如Dsb蛋白(DsbA，DsbB，DsbC，DsbD和或DsbG)或FkpA(一種具有侶伴蛋白活性的肽酰脯氨酰順，反-異構(gòu)酶)。侶伴蛋白已被證實能促進(jìn)細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的異源蛋白的正確折疊并增加溶解度。Chen等(1999)J Bio Chem27419601-19605；Georgiou等，美國專利6,083，715；Georgiou等，美國專利6,027,888；Bothmann and Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.27517100-17105；Ramm and Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.27517106-17113；Arie等(2001)Mol.Microbiol.39199-210。充分的二硫鍵鍵合對于具有兩條重鏈和兩條輕鏈的全長二價抗體的形成和折疊特別重要。
為了將所表達(dá)的異源蛋白(尤其對蛋白裂解很敏感的那些)在諸如原核宿主細(xì)胞中的蛋白裂解降至最低，一些具有蛋白裂解酶缺陷的宿主菌株可用于本發(fā)明。例如，可以修飾原核宿主細(xì)胞，使編碼已知的細(xì)菌蛋白酶或其組合的基因中出現(xiàn)基因突變，所述酶例如蛋白酶III，OmpT，DegP，Tsp，蛋白酶I，蛋白酶Mi，蛋白酶V，蛋白酶VI。目前已經(jīng)有一些蛋白酶缺陷型大腸桿菌菌株，可參見，例如Joly等(1998)，出處同上；Georgiou等，美國專利5,264,365；Georgiou等，美國專利5,508,192；Hara等(1996)Microbial DrugResistance 263-72。
抗體純化從宿主細(xì)胞制備的抗體組合物優(yōu)選經(jīng)歷至少一個純化步驟。合適的純化步驟的實例包括，羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析，和親和層析，優(yōu)選親和層析。具體蛋白是否適于作為親和配體取決于該抗體上任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。例如，蛋白A可用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體。Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.621-13。有人建議將蛋白G用于所有的小鼠同種型和人γ3。Guss等(1986)EMBO J.515671575。與親和配體結(jié)合的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但也可利用其它基質(zhì)。具有機(jī)械穩(wěn)定性的基質(zhì)如孔徑受到控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯等，比瓊脂糖允許更快的流速且耗時更短。當(dāng)抗體包括CH3區(qū)時，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)有利于純化。還可以根據(jù)需要回收的抗體來選擇其它蛋白純化技術(shù)，例如離子交換柱分級分離，乙醇沉淀，反向HPLC，硅層析，肝素SEPHAROSETM層析，陽離子或陰離子交換樹脂(例如聚天冬氨酸柱)層析，層析聚焦，SDS-PAGE，以及硫酸銨沉淀。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明制備的抗體經(jīng)過進(jìn)一步純化，獲得實質(zhì)上更均一的制劑，以備進(jìn)一步的分析和應(yīng)用。例如，可以采用美國專利5,641,870中所述的疏水相互作用層析(HIC)，尤其是低pH HIC(LPHIC)進(jìn)行進(jìn)一步純化。具體地，LPHIC提供了一種將正確折疊且二硫鍵鍵合的抗體與不想要的污染物(如，不正確結(jié)合的輕鏈和重鏈片段)分開的途徑。
活性分析本發(fā)明抗體的物理/化學(xué)特性和生物學(xué)功能可以通過本領(lǐng)域已知的各種試驗來確定。在本發(fā)明一個方面中，重要的是將在本發(fā)明雙-啟動子系統(tǒng)中制備的抗體與在其它表達(dá)系統(tǒng)(如不同表達(dá)載體設(shè)計或不同宿主細(xì)胞系統(tǒng))中制備的類似抗體進(jìn)行比較。具體地，可以將本發(fā)明雙-啟動子載體表達(dá)并裝配好的抗體復(fù)合物的量與由各種多順反子載體表達(dá)的抗體的量進(jìn)行比較。定量蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，從表達(dá)的蛋白取樣，在考馬斯蘭染色SDS-PAGE的上比較它們的量化強(qiáng)度?；蛘?，可以通過，例如，western印跡凝膠分析來檢測所需的具體的帶(如，裝配好的抗體的帶)。
已經(jīng)純化的抗體還可通過一系列分析進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，這些分析包括，但不限于，N-末端測序，氨基酸分析，非變性大小排阻高壓液相層析(HPLC)，質(zhì)譜分析，離子交換層析以及木瓜蛋白酶消化。
在本發(fā)明的某些實施方案中，分析了所制備的抗體的生物學(xué)活性。優(yōu)選地，檢測本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。本領(lǐng)域已知并且可以用于本文的抗原結(jié)合試驗包括，但不限于，利用下列技術(shù)進(jìn)行的任何直接或競爭性結(jié)合試驗例如，western印跡，放射免疫分析，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)，“夾心”免疫分析，免疫沉淀試驗，熒光免疫分析，以及蛋白A免疫分析。下文實施例章節(jié)中提供了抗原結(jié)合試驗的一個實例。
抗體的用途本發(fā)明的抗體可用于，例如，純化，檢測，和靶向它所識別的特異性多肽，包括針對各種疾病的體外和體內(nèi)診斷，預(yù)防或治療方法。
“疾病”是指可從所述抗體的治療中獲益的任何情況。這包括慢性和急性疾病或病癥，包括使哺乳動物對所述疾病易感的那些病理狀況。這些需要治療的疾病的非限定實例包括，良性和惡性腫瘤；非白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間質(zhì)和囊胚腔的疾??；炎性、血管原性和免疫性疾病。
本文中“自身免疫病”是一種源自個體自身組織并且直接針對個體自身組織的非惡性疾病。本文中自身免疫病特別排除了惡性疾病或癌性疾病，尤其排除了B細(xì)胞淋巴瘤，急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，毛細(xì)胞(Hairy cell)白血病和慢性成髓細(xì)胞性白血病。自身免疫病實例包括，但不限于，炎性應(yīng)答如炎性皮膚疾病包括牛皮癬和皮炎(如過敏性皮炎)；系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥；與炎性腸疾病有關(guān)的應(yīng)答(如克羅恩氏(Crohn’s)病和潰瘍性結(jié)腸炎)；呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘破綜合征；ARDS)；皮炎；腦脊膜炎；腦炎；色素膜炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；過敏性疾病如濕疹和哮喘，以及涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎性應(yīng)答的其它疾?。粍用}粥樣硬化；白細(xì)胞粘附缺陷；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(如I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病)；多發(fā)性硬化癥；雷諾氏(Reynaud’s)綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；斯耶格倫氏(Sjorgen’s)綜合征；幼年型糖尿病(juvenile onset diabetes)；常見于結(jié)核、結(jié)節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和脈管炎中的，涉及細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)的免疫應(yīng)答；惡性貧血(阿狄森氏(Addison’s)病)；與白細(xì)胞滲出有關(guān)的疾病；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病變；多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥；或庫姆斯氏(Combs)陽性貧血)；重癥肌肌無力；抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾??；抗腎小球基底膜疾??；抗磷脂綜合征；過敏性神經(jīng)炎；格雷夫斯氏(Graves’s)綜合征；蘭-伊氏(Lambert-Eaton)肌無力綜合征；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內(nèi)分泌腺疾?。毁囂貭柺?Reiter’s)?。蝗砑?qiáng)直(stiff-man)綜合征；貝切特氏(Behcet)??；巨細(xì)胞性動脈炎；免疫復(fù)合物性腎炎；IgA腎?。籌gM多發(fā)性神經(jīng)炎；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少癥等。
術(shù)語“癌癥”和“癌的”是指或是描述哺乳動物中，以不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長為典型特征的生理狀況。癌癥的實例包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這些癌的更具體的實例包括鱗狀細(xì)胞癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，肺腺癌，肺鱗狀上皮癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌(hepatocellular cancer)，胃腸癌，胰腺癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤(hepatoma)，乳腺癌，結(jié)腸癌，結(jié)直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，肝癌(liver cancer)，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepatic crcinoma)，以及各種頭、頸部癌。
本文中“治療”是指，在改變待治個體或細(xì)胞的自然過程的嘗試中進(jìn)行的臨床干預(yù)，它可以是為了預(yù)防而實施，或者可以在臨床病理過程中實施。治療希望達(dá)到的效果包括，阻止疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)，緩解癥狀，消除疾病的任何直接或間接病理學(xué)結(jié)果，防止轉(zhuǎn)移，降低疾病進(jìn)展的速度，改善或減輕病情，以及消退或改進(jìn)預(yù)后。
“有效量”是指，在所需劑量和時間內(nèi)，能獲得所需治療或預(yù)防結(jié)果的量?？贵w的“治療有效量”可以根據(jù)多種因素而變化，例如疾病狀態(tài)，個體的年齡、性別、和體重，抗體在所述個體中激發(fā)所需反應(yīng)的能力。治療有效量也可以是指，抗體的任何毒性或有害效應(yīng)不及治療有益效應(yīng)的量。“預(yù)防有效量”是指，在所需劑量和時間內(nèi)，能獲得所需預(yù)防結(jié)果的量。通常，由于預(yù)防劑量是在疾病發(fā)生之前或疾病的較早期應(yīng)用于受試者，因此，預(yù)防有效量比治療有效量少。
在一個方面，本發(fā)明抗體可用于免疫分析中定性和定量測定生物樣品中的特異性抗原。檢測抗原-抗體結(jié)合的常規(guī)方法包括，例如，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，放射免疫分析(RIA)或免疫組織化學(xué)。多種方法可以用標(biāo)記物結(jié)合抗體以便進(jìn)行檢測。用于抗體的標(biāo)記物可以是任何可以進(jìn)行檢測且不干擾其與抗體結(jié)合的功能體。已知有多種標(biāo)記物，包括放射性同位素32P，32S，14C，125I，3H，和131I，熒光團(tuán)如稀土螯合物或熒光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，單磺?；瑐阈瓮?，螢光素酶(如，螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶，美國專利4,737,456)，螢光素，2，3-二氫二氮雜萘二酮，辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶)，和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)，乳過氧化物酶，生物素/親和素，spin標(biāo)記，噬菌體標(biāo)記，穩(wěn)定的自由基，用于成像的放射性核素(如Technecium)等。
目前已有使這些標(biāo)記與抗體多肽共價結(jié)合的常規(guī)方法。例如，可以用下述偶聯(lián)劑使抗體帶上上述熒光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，和酶標(biāo)記如二醛，碳二亞胺，二馬來酰亞胺，雙-亞胺酸酯(bis-imidate)，雙-重氮化聯(lián)苯胺(bis-diazotized benzidine)等。參見，例如，美國專利3,940,475(熒光測量)和美國專利3,645,090(酶)；Hunter等Nature 144945(1962)；David等Biochemistry 131014-1021(1974)；Pain等J.Immunol.Methods 40219-230(1981)；Nygren Histochem.and Cytochem 30407-412(1982)。本文優(yōu)選的標(biāo)記是酶，如辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。將這樣的標(biāo)記物(包括酶)與抗體多肽偶聯(lián)是本領(lǐng)域免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)操作。參見，例如，O′Sullivan等，“Methodsfor the Preparation of Enzyme-抗體 Conjugates for Use in EnzymeImmunoassay”，Methods in Enzymology，ed.J.J.Langone and H.Van Vunakis，Vol.73(Academic Press，New York，N.Y.，1981)，pp.147-166。這種鍵合方法適用于本發(fā)明的抗體多肽。
除了標(biāo)記抗體以外，還可以通過競爭性免疫分析來檢測生物液體中的抗原，所述分析利用了經(jīng)可檢測的物質(zhì)標(biāo)記的競爭性抗原標(biāo)準(zhǔn)品和未經(jīng)標(biāo)記的抗體。在該分析中，將生物樣品，標(biāo)記的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和抗體混合，測定標(biāo)記的抗原標(biāo)準(zhǔn)品與未經(jīng)標(biāo)記的抗體結(jié)合的量。生物樣品中所測抗原的量，與結(jié)合在抗體上的帶標(biāo)記的抗原標(biāo)準(zhǔn)品的量，成反比。
在一個方面，本發(fā)明的抗體特別可用于體外或體內(nèi)檢測特異性表面抗原的表達(dá)并勾畫其表達(dá)圖譜。表面抗原可以特異于具體的細(xì)胞或組織類型，從而作為該細(xì)胞或組織類型的標(biāo)志。優(yōu)選地，表面抗原標(biāo)志在特定細(xì)胞或組織類型的各種分化階段有不同的表達(dá)。對抗這類表面抗原的抗體因此可用于從細(xì)胞或組織群體中篩選出表達(dá)該標(biāo)志的那些。例如，本發(fā)明的抗體可用于篩選和分離干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞，造血干細(xì)胞，和間質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明的抗體還可用于檢測表達(dá)腫瘤相關(guān)表面抗原(如HER2，HER3或HER4受體)的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的抗體可用作親和純化制劑。在該方法中，用本領(lǐng)域已知方法將抗體固定在固相(Sephadex樹脂或濾紙)上。使固相化抗體與含有待純化的抗原的樣品接觸，然后用適當(dāng)溶劑淋洗支持物，以便將該樣品中除了與固相抗體結(jié)合的待純化抗原以外的幾乎所有其它物質(zhì)除去。最后，用另一種適當(dāng)溶劑淋洗該支持物，例如甘氨酸緩沖液，pH5.0，以便使抗原從抗體上釋放。
本發(fā)明抗體可用作拮抗劑以便在體外和體內(nèi)部分或完全封閉特異性抗原活性。此外，至少有一部分本發(fā)明抗體可以中和其它物種來源的抗原活性。因此，本發(fā)明抗體可以，例如，在含有該抗原的細(xì)胞培養(yǎng)物中，在人類受試者中，或在具有與本發(fā)明抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的抗原的其它哺乳動物受試者(如黑猩猩，狒狒，狨，食蟹猴(cynomolgus)和獼猴(rhesus)，豬或小鼠)中，抑制特異性抗原活性。
在另一實施方案中，本發(fā)明抗體可以在抑制患病受試者體內(nèi)有害抗原的方法中應(yīng)用，該方法包括對該受試者施用本發(fā)明的抗體，從而抑制該受試者中該抗原的活性。優(yōu)選該抗原是人的蛋白分子，而該受試者是人類受試者?；蛘撸鍪茉囌呖梢允潜磉_(dá)能與本發(fā)明抗體結(jié)合的抗原的哺乳動物。所述受試者還可以是引入了所述抗原的哺乳動物(如，通過給藥該抗原或通過表達(dá)抗原轉(zhuǎn)基因而引入)。本發(fā)明的抗體可以為了治療目的而給予人類受試者。此外，本發(fā)明的抗體可以對表達(dá)能與所述抗體交叉反應(yīng)的抗原的非人哺乳動物(如，靈長類，豬或小鼠)施用，以便實現(xiàn)獸醫(yī)目的，或作為人類疾病的動物模型。如果是作為動物模型，所述模型可用于評估本發(fā)明抗體的治療效力(如，測定給制劑量和時間安排)。具有治療意義的本發(fā)明阻斷抗體包括但不限于，抗-VEGF，抗-IgE，抗-CD11和抗-組織因子抗體。本發(fā)明的阻斷抗體可用于診斷、治療、抑制或預(yù)防與一或多種抗原分子的異常表達(dá)和或活性相關(guān)的疾病，所述疾病包括但不限于惡性和良性腫瘤；非白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間質(zhì)和囊胚腔的疾?。谎仔?、血管原性和免疫性疾病。
在一個方面，本發(fā)明的阻斷抗體特異于配體抗原，并通過阻斷或干擾該配體抗原所參與的配體-受體相互作用而抑制該抗原的活性，從而抑制相應(yīng)的信號途徑和其它分子或細(xì)胞事件。本發(fā)明的特征還在于受體特異性抗體，它不必阻止配體結(jié)合，但能干擾受體活化，從而抑制通常由配體結(jié)合所啟動的任何應(yīng)答。本發(fā)明還涉及，優(yōu)選地結(jié)合或排他性結(jié)合配體-受體復(fù)合物的抗體。本發(fā)明的抗體還可以作為具體抗原受體的激動劑，以加強(qiáng)、促進(jìn)或活化由配體介導(dǎo)的受體活化的全部或部分活性。
在一些實施方案中，可以制備并應(yīng)用免疫偶聯(lián)物，它包含與細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)的抗體。優(yōu)選所述免疫偶聯(lián)物和/或與它結(jié)合的抗原被細(xì)胞內(nèi)化(internalize)，導(dǎo)致在殺傷與它結(jié)合的靶細(xì)胞時增加免疫偶聯(lián)物的治療效果。在優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞毒制劑在靶細(xì)胞中靶向或干擾核酸。
本文中術(shù)語“細(xì)胞毒制劑”是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語旨在包括放射性核素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，和Lu的放射性同位素)，化療劑，毒素如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。
“化療劑”是在癌癥治療中使用的化學(xué)化合物。化療劑實例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)；環(huán)磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(azirdine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶(ethyleneimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞胺嗪(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；acetogenins(特別是bullatacin和bullatacinone)；喜樹堿(包括合成的類似物拓?fù)涮婵?topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括它的阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；cryptophycins(特別是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；海兔毒素(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CBI-TMI)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloricde)；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如enediyne抗生素(如加利車霉素，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素θI1，參見例如Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33183-186(1994)；dynemicin，包括dynemicin A；esperamicin；以及新制癌菌素生色團(tuán)(neocarzinostatin chromophore)和相關(guān)的色蛋白enediyne抗生素生色團(tuán))，阿克拉霉素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋紅霉素(carminomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D，柔紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)(包括嗎啉代-阿霉素，氰基嗎啉代-阿霉素，2-吡咯啉基-阿霉素和脫氧阿霉素)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達(dá)比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結(jié)核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶羅呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達(dá)拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，雙脫氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類，如二甲睪酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，如氨魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑如frolinic acid；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptiniumacetate)；epothilone；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；美登木素生物堿(maytan sinoids)(包括美登素和柄型菌素)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；rhizoxin；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；單端孢霉烯族毒素類(尤其是T-2毒素，verracurin A，桿孢菌素A，蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春堿酰胺；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；taxoids，如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和紫杉萜(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑，包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奧那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制劑，如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，比卡魯胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。
本文還涉及抗體與一或多種小分子毒素，如加利車霉素、美登素(美國專利5,208,020)、單端孢霉烯(trichothene)、CC1065的偶聯(lián)物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使抗體與一或多個美登素分子偶聯(lián)(如每個抗體分子與約1-10個美登素分子偶聯(lián))。美登素可轉(zhuǎn)化成May-SS-Me，然后還原成May-SH3，并與經(jīng)修飾的抗體反應(yīng)(Chari等CancerResearch 52127-131(1992))產(chǎn)生美登木素生物堿(maytansinoid)-抗體免疫偶聯(lián)物。
另一種感興趣的免疫偶聯(lián)物包含與一或多個加利車霉素分子偶聯(lián)的抗體。加利車霉素家族的抗生素能在亞pM濃度水平產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。可以使用的加利車霉素結(jié)構(gòu)類似物包括，但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG以及θI1(Hinman等Cancer Research 533336-3342(1993)，Lode等Cancer Research 582925-2928(1998))。也參見美國專利5,714,586；5,712,374；5,264,586；和5,773,001。
可以應(yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日公開的WO93/21232。
本發(fā)明還涉及抗體與具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶如脫氧核糖核酸酶；DNase)偶聯(lián)形成的免疫偶聯(lián)物。
多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯(lián)的抗體，實例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，以及Lu的放射性同位素。
抗體與細(xì)胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，亞氨基硫醇(iminothiolane)(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二甲基己二酸亞氨酯(dimethyladipimidate HCl)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲?；?己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等Science 2381098(1987)所述制備。C14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至抗體的偶聯(lián)劑之一。見WO94/11026。這種接頭可能是有利于細(xì)胞毒藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放的“可斷開的接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定型接頭，肽酶敏感型接頭，二甲基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等Cancer Research 52127-131(1992))。
或者，可通過例如重組技術(shù)或肽合成來獲得含有抗體與細(xì)胞毒制劑的融合蛋白。
在另一實施方案中，抗體可與腫瘤預(yù)靶向中應(yīng)用的“受體”(如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯(lián)，將該抗體-受體偶聯(lián)物給予患者，之后用清除劑除去循環(huán)中未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予已偶聯(lián)了細(xì)胞毒制劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如抗生物素蛋白)。
本發(fā)明的抗體可以在治療中單獨(dú)使用，或者與其它組合物聯(lián)合使用。例如，所述抗體可以與另一抗體、化療劑(包括化療劑的混合物)、其它細(xì)胞毒制劑、抗-血管生成劑、細(xì)胞因子和/或生長抑制劑共同給藥。當(dāng)所述抗體抑制腫瘤生長時，可能特別希望將該抗體與一或多種也能抑制腫瘤生長的其它治療劑聯(lián)合。例如，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療中，阻斷VEGF活性的抗-VEGF抗體可以與抗-ErbB抗體(如HERCEPTIN抗-HER2抗體)聯(lián)合?；蛘撸蛄硗?，患者可接受聯(lián)合放射治療(如外部光束照射或用帶有放射活性標(biāo)記的制劑如抗體進(jìn)行治療)。上述這種聯(lián)合治療包括聯(lián)合給藥和分隔給藥，在聯(lián)合給藥中，兩種或多種制劑包含在同一配制劑或不同配制劑中；在分隔給藥中，抗體可在給予輔助治療之前和/或之后給藥。
抗體(和輔助治療劑)可用任何適當(dāng)方式給藥，包括非腸道、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)給藥，如果需要局部治療，可以在損傷內(nèi)給藥。非腸道輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥。另外，抗體適宜經(jīng)脈沖輸注給藥，特別是使用遞減劑量的抗體時。優(yōu)選經(jīng)注射給藥，最優(yōu)選經(jīng)靜脈或皮下注射給藥，它們部分取決于給藥是短暫還是長期(慢性)的。
可以根據(jù)良好醫(yī)療實踐，配制、成劑并給藥本發(fā)明的抗體組合物。這其中要考慮的因素包括接受治療的具體病癥、接受治療的具體哺乳動物、患者個體的臨床狀況、病因、制劑釋放的部位、給藥方法、給藥時程表，以及醫(yī)療實踐者所熟知的其它因素。抗體并不必需，但可選擇，與一或多種目前用于預(yù)防或治療所述疾病的制劑配制在一起。所述其它制劑的有效量，取決于該配制劑中抗體的含量、病癥或治療的類型，以及上述討論的其它因素。這些制劑一般使用其此前所用相同劑量和相同給藥途徑，或者使用此前所用劑量的約1～99％。
在疾病的預(yù)防或治療中，所述抗體(單獨(dú)應(yīng)用，或者與其它制劑如化療劑聯(lián)合應(yīng)用時)的合適劑量取決于需要治療的疾病類型，抗體類型，疾病的嚴(yán)重程度和病程，給予抗體的目的是預(yù)防還是治療，在先的治療，患者的臨床病史以及對該抗體的反應(yīng)，主治醫(yī)師的判斷。所述抗體優(yōu)選在一次治療中或者在一系列治療中給予患者。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，抗體的起始劑量可以是，通過一或多次給藥，或者通過連續(xù)輸注，給予約1μg/kg-15mg/kg(如0.1mg/kg-10mg/kg)。通常每日劑量為約1μg/kg-100mg/kg或更多，取決于上述因素。當(dāng)在數(shù)天內(nèi)或更長時間段內(nèi)多次給藥時，根據(jù)具體情況，可以將治療一直持續(xù)到出現(xiàn)所需的抑制疾病的狀態(tài)為止。所述抗體的優(yōu)選劑量為約0.05mg/kg-約10mg/kg。故，可以給予患者一或多劑，每劑約0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)。這樣的劑量可以間歇給予，例如每周或每三周(例如，使患者接受約2-20個劑量的抗體，例如約6個劑量的抗體)。可以采用較高起始裝載劑量，接著是一或多個較低劑量。劑量方案的一個實例包括，起始裝載劑量為約4mg/kg，接著是每周維持劑量約2mg/kg的抗體。其它劑量方案也是有效的。所述治療的進(jìn)展可以很容易地通過常規(guī)技術(shù)和試驗進(jìn)行監(jiān)控。
藥物配制劑本發(fā)明抗體的治療性配制劑，可以通過將具有所需純度的抗體與任選的生理學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington′s PharmaceuticalSciences第16版Osol，A.編(1980))混合而制備，然后以含水劑，凍干劑或其它經(jīng)干燥的配制劑形式保存?？山邮艿妮d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對受體無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽，組氨酸及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于約10個殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
所述配制劑還可根據(jù)所治療的具體情況而包含一種以上活性成分，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性但相互無負(fù)面影響的那些。這些分子以對所需目的有效的量在組合中適當(dāng)?shù)卮嬖凇?br> 活性成分也可容納在微膠囊中，或容納在膠體性質(zhì)的藥物運(yùn)送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)中，或者容納在大乳劑(macroemulsions)中，所述微膠囊可以通過諸如凝聚(coacervation)技術(shù)或界面聚合作用來制備，例子分別有羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)見Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版Osol，A.編(1980)。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可以通過除菌濾膜過濾而輕易實現(xiàn)。
也可制備緩釋制劑。緩釋制劑的適當(dāng)實例包括含有抗體的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。盡管聚合物如乙烯-乙酸乙酯和乳酸-羥基乙酸能持續(xù)釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。當(dāng)膠囊化的抗體長時間停留在體內(nèi)時，它們會由于暴露在37℃潮濕環(huán)境中而變性或凝聚，從而導(dǎo)致生物活性損失，且免疫原性可能會改變?？梢愿鶕?jù)相關(guān)機(jī)理來設(shè)計穩(wěn)定化的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚的機(jī)理是通過硫代二硫鍵互換而形成了分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制濕度、采用合適的添加劑和開發(fā)特異性聚合物基質(zhì)組合物，來達(dá)到穩(wěn)定化。
制品本發(fā)明另一實施方案是一種制品，其包含可用于治療上述疾病的材料。所述制品包括一個容器和位于該容器表面的或與該容器相連的標(biāo)簽或包裝插頁。適當(dāng)?shù)娜萜饔衅孔樱∑?，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器內(nèi)可以含有一種能有效治療所述疾病的組合物，并可具有無菌存取口(例如該容器可以是靜脈點(diǎn)滴袋(intravenous solution bag)或帶有能通過皮下注射針穿刺的塞子的小瓶)。所述組合物中至少一種活性制劑是本發(fā)明的抗體。標(biāo)簽或包裝插頁將指明，所述組合物是用于治療特定疾病，如癌癥。所述制品可包含第一個容器，其中容納含有抗體的組合物；以及(b)第二個容器，其中容納含有另一種細(xì)胞毒制劑的組合物。本發(fā)明這一實施方案中的制品還可進(jìn)一步包含一種包裝插頁，它指示所述第一種和第二種抗體組合物可以用于治療癌癥?；蛘呋蛄硗?，所述制品還可進(jìn)一步包含第二個(或第三個)容器，其中容納可藥用緩沖液，如用于注射的抑菌水(BWFI)，磷酸鹽緩沖液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。還可包括具有商業(yè)需要以及符合用戶需要的材料，包括其它緩沖液，稀釋劑，濾器，針頭，和注射器。
以下實施例旨在舉例說明本發(fā)明的實踐，并非限制本發(fā)明。本文引用的所有專利和科學(xué)文獻(xiàn)都全文引用作為參考。
實施例實施例1.制備CD18抗體片段材料和方法質(zhì)粒構(gòu)建對照質(zhì)粒pS1130經(jīng)設(shè)計可以以雙順反子形式表達(dá)抗-CD18F(ab’)2，并且該質(zhì)粒是基于Carter等(1992)Bio/Technology 10163-167所述的載體。所述設(shè)計將輕鏈和帶有C-末端亮氨酸拉鏈的重鏈片段的轉(zhuǎn)錄置于單個phoA啟動子的控制下。轉(zhuǎn)錄終止于重鏈-亮氨酸拉鏈編碼序列下游的λt0轉(zhuǎn)錄終止子(Scholtissek and Grosse(1987)Nucleic Acids Res.15(7)3185)。每一條鏈的前面是熱穩(wěn)定腸毒素II信號序列(STII)，它指導(dǎo)所述多肽分泌到周質(zhì)中(Lee等(1983)Infect.Immun.42264-268；Picken等(1983)Infect.Immun.42269-275)。亮氨酸拉鏈與重鏈片段的C-末端相連，從而促進(jìn)兩條Fab’臂的二聚體化。
含有兩種不同翻譯單元的雙-啟動子質(zhì)粒pxCD18-7T3可以使輕鏈和重鏈分時分別轉(zhuǎn)錄。在pS1130中，輕鏈仍然受phoA啟動子控制。但是在pxCD18-7T3中，輕鏈編碼序列之后是λt0轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子下游添加了TacII啟動子，以便控制重鏈片段/C-末端亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄(DeBoer，等(1983)Proc.Natl.Acad Sci.USA 8021-25)。該編碼序列之后跟著第二個λt0轉(zhuǎn)錄終止子。用STII信號序列的靜默密碼子變異體指導(dǎo)所述兩條鏈的轉(zhuǎn)錄(Simmons and Yansura(1996)Nature Biotechnology 14629-634)。
單啟動子對照質(zhì)粒與雙啟動子質(zhì)粒的比較見圖1。pxCD18-7T3的表達(dá)盒序列見圖2(SEQ ID NO3)，兩種翻譯單元的氨基酸序列見圖3(SEQ IDNO4)。
發(fā)酵用于發(fā)酵的宿主菌株是大腸桿菌W3110的衍生物，命名為59A7。59A7的完整基因型是W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC2degP41(ΔpstI-Kanr)IN(rrnD-rrnE)1 ilvG2096(Valr)Δprc prc-suppressor。將59A7宿主細(xì)胞用pS1130或pxCD18-7T3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，選出成功的轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行培養(yǎng)。在雙-啟動子質(zhì)粒的情況下，使另一種質(zhì)粒pMS421與pxCD18-7T3共轉(zhuǎn)化。所述另一種質(zhì)粒，pMS421，是一種基于pSC101的質(zhì)粒，它提供lacIq來改進(jìn)TacII啟動子的控制，它還賦予對壯觀霉素和鏈霉素的抗性。
對每一次10-升發(fā)酵而言，將單個小瓶解凍，其中含有1.5ml培養(yǎng)物的10-15％DMSO溶液，將其加入含有500ml LB培養(yǎng)基的1L搖瓶中，所述培養(yǎng)基中添加了0.5ml四環(huán)素溶液(5mg/ml)和2.5ml1M磷酸鈉溶液。將該種子培養(yǎng)物于30℃培養(yǎng)將近16小時，然后用于接種10-升發(fā)酵罐。
發(fā)酵罐最初用將近6.5升培養(yǎng)基開始發(fā)酵，所述培養(yǎng)基中包含約4.4g葡萄糖，100ml 1M硫酸鎂，10ml痕量元素溶液(100ml氫氯酸，27g六水氯化鐵，8g七水硫酸鋅，7g六水氯化鈷，7g鉬酸二氫鈉，8g五水硫酸銅，2g硼酸，5g一水硫酸錳，終體積1升)，20ml四環(huán)素溶液(5mg/ml，于乙醇中)，10ml Fermax Adjuvant 27(或一些等效消泡劑)，1袋HCD鹽(37.5g硫酸銨，19.5g磷酸氫二鉀，9.75g二水磷酸二氫鈉，7.5g二水檸檬酸鈉，11.3g磷酸二氫鉀)，以及200g NZ Amine A(一種蛋白水解物)。發(fā)酵在30℃進(jìn)行，通以10slpm氣流，pH控制在7.0±0.2(有些情況中偶爾超出該范圍)。改變發(fā)酵罐的背壓(back pressure)和攪拌速率，以便控制發(fā)酵罐中的氧轉(zhuǎn)移率，并因此控制細(xì)胞呼吸率。
從搖瓶中取出含有細(xì)胞的培養(yǎng)基，接種發(fā)酵罐，然后進(jìn)行培養(yǎng)，按照計算機(jī)的運(yùn)算向發(fā)酵罐中補(bǔ)加濃縮的葡萄糖溶液，直至培養(yǎng)物達(dá)到較高細(xì)胞密度。另外還根據(jù)pH控制的需要向發(fā)酵罐中補(bǔ)加氫氧化銨(58％溶液)和硫酸(24％溶液)。在有些情況中還補(bǔ)加消泡劑來控制泡沫。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到將近40 OD550的細(xì)胞密度時，向發(fā)酵罐中加入100ml 1M硫酸鎂。另外，當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到將近20 OD550的細(xì)胞密度時，開始以2.5ml/min的速度向發(fā)酵罐中補(bǔ)加濃縮鹽(由將近10g硫酸銨，26g磷酸氫二鉀，13g二水磷酸二氫鈉，2g二水檸檬酸鈉和15g磷酸二氫鉀，在1L水中構(gòu)成)，并且一直持續(xù)，直到將近1250ml被加入發(fā)酵液中。發(fā)酵通常持續(xù)72-80小時。
在發(fā)酵期間，一旦達(dá)到為該發(fā)酵預(yù)設(shè)的溶解氧濃度，就根據(jù)溶解氧探針信號補(bǔ)加濃縮的葡萄糖溶液，以便將溶解氧濃度控制在預(yù)設(shè)值。結(jié)果，在這種控制方案中，對發(fā)酵罐操作參數(shù)(如攪拌速率或背壓，其影響發(fā)酵中的氧轉(zhuǎn)移能力)的控制相對應(yīng)地控制了細(xì)胞的氧攝取速率或代謝速率。
用質(zhì)譜儀監(jiān)控發(fā)酵所排出的氣體的組成，從而能計算發(fā)酵中氧攝取和二氧化碳排放(evolution)的速率。
當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到近220OD550的細(xì)胞密度時，將攪拌速率從最初的1000rpm經(jīng)過近12個小時而降低到近725rpm。在pxCD18-7T3系統(tǒng)(其中用TacII啟動子控制重鏈表達(dá))的發(fā)酵中，在培養(yǎng)物達(dá)到220OD550細(xì)胞密度的近12個小時之后，加入50ml 200mM IPTG來誘導(dǎo)重鏈合成。
產(chǎn)物分析為了評估發(fā)酵中產(chǎn)生的抗體片段的量，使用了多種蛋白分析試驗。為了確定已裝配好的抗-CD18 F(ab’)2-亮氨酸拉鏈復(fù)合物的量，使用了蛋白G分析。Derrich and Wigley(1992)Nature 359752-4。為了制備該分析中用到的樣品，首先對完整發(fā)酵液進(jìn)行超聲處理，用50mM硫酸鎂將其稀釋2.4X。加入聚1，2-亞乙基亞胺(PEI)至終濃度為0.1％。保溫20分鐘之后，將樣品在微量離心機(jī)中以近14,000xg離心近20分鐘。然后將上清用磷酸鹽緩沖液稀釋2X，用HP1090或HP1100 HPLC系統(tǒng)將稀釋液裝載到蛋白G柱(PorosG/M柱)上。進(jìn)行7分鐘的分析，期間，首先將柱用10mM PO4/300mM NaCl(pH8)平衡。然后注入樣品，將柱用平衡緩沖液淋洗將近5.5分鐘(2.1×30mm的柱使用將近3ml緩沖液)，然后用30mM PO4/150mM NaCl/0.01％TFA(pH1.9)進(jìn)行洗脫。
為了證實蛋白G結(jié)果確實代表裝配好的F(ab’)2復(fù)合物，還通過多個層析步驟對產(chǎn)物進(jìn)行純化，所述步驟包括離子交換，以及在用固相胃蛋白酶除去亮氨酸拉鏈部分之后再進(jìn)行一步額外的離子交換和苯基sepharose HIC柱層析。純化的產(chǎn)物通過多種常規(guī)方法進(jìn)行鑒定，如陽離子交換試驗，毛細(xì)區(qū)帶電泳非凝膠篩分試驗，以及SDS-PAGE凝膠電泳。
為了評估發(fā)酵中產(chǎn)生的輕鏈和重鏈的總量，使用了另一種反相HPLC試驗。用于該試驗的樣品按照上文蛋白G試驗中所述來制備。將可溶性裂解物樣品稀釋在6M胍-HCl，50mM TRIS，pH9中(通常100μl樣品用650μl胍溶液稀釋)。然后加入50μl 2M二硫蘇糖醇(剛解凍的)。加入200μl乙腈并濾過0.2μm濾膜，然后裝載HPLC。
在反相方法中，使用Hewlett-PackardTM1100 HPLC以及PerseptivePorosTMR-1反相柱。分析中，將該柱加熱至60-80℃，監(jiān)控278nm處的紫外吸收。該柱用包含0.1％三氟乙酸的28％乙腈-水溶液平衡。然后取25μl樣品上柱，用20分鐘內(nèi)從28％到38％乙腈的線性梯度洗脫，然后用17分鐘在95％乙腈中再生并在28％乙腈中再平衡。輕鏈和重鏈的相關(guān)峰通過與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較來鑒定，并用質(zhì)譜分析予以證實?？瞻装l(fā)酵使用了相同的宿主、但所用的質(zhì)粒不合重鏈和輕鏈序列，用類似的方式制備它的樣品，通過分析確定適于所述分析物的基線。峰面積用Hewlett-PackardTM1100軟件進(jìn)行積分，將標(biāo)準(zhǔn)值插入空白發(fā)酵樣品中，制得校準(zhǔn)曲線，以便定量樣品中各種鏈的相對含量。
不溶性裂解物樣品也進(jìn)行類似的分析，方法是，從細(xì)胞裂解物獲得不溶性沉淀，將其重新懸浮在950μl 6M胍/HCl，50mM TRIS，pH 9+50μl 2M二硫蘇糖醇中。進(jìn)行超聲處理(5-10個脈沖)，這一般是為了使沉淀重新溶解，然后取100μl重新懸浮的沉淀，在650μl胍溶液+50μl 2M二硫蘇糖醇+200mM乙腈中稀釋。然后該樣品按照與可溶性裂解物樣品相同的方法進(jìn)行過濾和分析。
結(jié)論用pS1130單啟動子系統(tǒng)或pxCD18-7T3雙-啟動子系統(tǒng)進(jìn)行了一系列抗-CD18 F(ab’)2發(fā)酵。用方法和材料章節(jié)中描述的蛋白分析試驗測量和計算已裝配好的抗-CD18 F(ab’)2復(fù)合物的產(chǎn)量。如圖4(柱代表發(fā)酵產(chǎn)量，g/L)所示，在59A7菌株中采用phoA-tac雙-啟動子載體，使已裝配好的F(ab’)2的產(chǎn)量從鑒定出的最佳pS1130/59A7轉(zhuǎn)化體的近2.5g/L增加到4.6±0.5g/L，增幅近2倍。
為了進(jìn)一步舉例說明雙-啟動子系統(tǒng)的改進(jìn)特性，建立了在單啟動子系統(tǒng)(pS1130/59A7)和雙-啟動子系統(tǒng)(pxCD18-7T3/59A7)情況下，完整重鏈、可溶性輕鏈以及已裝配好的F(ab’)2復(fù)合物的表達(dá)圖譜，結(jié)果分別見圖5和6。很明顯，在首先表達(dá)輕鏈并將其分泌至周質(zhì)空間、隨后在一段延長的時間段內(nèi)產(chǎn)生重鏈的雙-啟動子系統(tǒng)中，在誘導(dǎo)了重鏈表達(dá)之后幾乎立刻開始F(ab’)2裝配(圖6)；但在單啟動子系統(tǒng)中，輕鏈和重鏈誘導(dǎo)之后的起始F(ab’)2裝配相對較弱(圖5)。在不受任何具體理論限制的前提下，這些結(jié)果提示，F(xiàn)(ab’)2裝配是低效率的，直到周質(zhì)中積累了顯著量的可溶性輕鏈時，效率才提高。
進(jìn)一步比較所述兩個系統(tǒng)的裝配效力，將其定義為F(ab’)2復(fù)合物中的重鏈與所合成的重鏈總量的比例。如圖7所示，雙-啟動子系統(tǒng)比傳統(tǒng)的單啟動子系統(tǒng)更有效地進(jìn)行裝配，尤其是在重鏈合成的起始階段(前10個小時)。對兩個系統(tǒng)中的重鏈表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，雙-啟動子系統(tǒng)的應(yīng)用還增加了所合成的重鏈的總量，參見圖7。
上述結(jié)果表明，通過使輕鏈和重鏈分時分別合成，可以顯著增加裝配好的抗-CD18 F(ab’)2的產(chǎn)量。這一新系統(tǒng)以及這些發(fā)現(xiàn)在表達(dá)并裝配多個蛋白單位的其它系統(tǒng)中有著廣泛的應(yīng)用。
實施例2.制備抗-組織因子IgGl該實施例描述了在大腸桿菌系統(tǒng)中制備全長抗體的繼續(xù)努力。當(dāng)采用強(qiáng)TIR’s同時共表達(dá)輕鏈和全長重鏈時，表達(dá)并積累了顯著量的前體多肽，導(dǎo)致成熟輕鏈和重鏈的量較小，且正確裝配的全長抗體的量較小。該實施例顯示，前體的積累可以通過輕鏈和重鏈的分時分別表達(dá)來克服。將每條鏈置于不同啟動子控制下，可以通過在不同時間點(diǎn)表達(dá)不同的鏈，而解除對分泌的阻斷。這種方法比同時表達(dá)更容許應(yīng)用較強(qiáng)的TIR’s，這可能導(dǎo)致每條鏈以更高水平分泌。這種能使每條鏈的表達(dá)水平提高的表達(dá)構(gòu)建方式，有利于增加正確裝配的全長抗體的產(chǎn)量。
材料和方法質(zhì)粒構(gòu)建對照質(zhì)粒paTF130的表達(dá)盒，從5’-3’依次包含(1)phoA啟動子(Kikuchi等，Nucleic Acids Res.9(21)5671-5678(1981))；(2)trp Shine-Dalgarno(Yanofsky等，Nucleic Acids Res.96647-6668(1981))；(3)STII信號序列的TIR變異體(TIR相對強(qiáng)度～7)(Simmons and Yansura，Nature Biotechnology14629-634(1996))；(4)抗-組織因子輕鏈編碼序列；(5)λt0終止子(Scholtissekand Grosse，Nucleic Acids Res.153185(1987))；(6)第二個phoA啟動子；(7)第二個trp Shine-Dalgarno；(8)STII信號序列的第二種靜默密碼子變異體(TIR相對強(qiáng)度～3)；(9)抗-組織因子全長重鏈的編碼序列；和(10)第二個λt0終止子。將該表達(dá)盒克隆到大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的框架中。Sutcliffe(1978)ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.4377-90。通過將每一基因置于其自身phoA啟動子的控制下，實現(xiàn)了該質(zhì)粒中輕鏈和重鏈的分別轉(zhuǎn)錄；但是，由于兩個phoA啟動子在相同條件下被誘導(dǎo)，使兩種鏈同時表達(dá)。
另一種方案是，設(shè)計pxTF-7T3FL載體，以便能利用兩個不同(而不是兩個相同)的啟動子分時分別表達(dá)各個鏈。在該質(zhì)粒中，輕鏈仍受phoA啟動子控制。但采用tacII啟動子(DeBoer，et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8021-25(1983))控制重鏈的轉(zhuǎn)錄。正如本領(lǐng)域所知，phoA和tacII啟動子在完全不同的條件下被誘導(dǎo)。paTF130與pxTF-7T3FL的比較見圖8。pxTF-7T3FL的核酸序列及其編碼的多肽序列分別見圖9和圖10。
表達(dá)誘導(dǎo)，樣品制備和分析在每種構(gòu)建體的相同規(guī)模表達(dá)中，采用大腸桿菌菌株33D3作為宿主細(xì)胞，它具有基因型(W3110 kanRfhuA(tonA)ptr3 phoA E15 lacIq lacL8ompT(nmpc-fepE)deg P)。轉(zhuǎn)化后，選出轉(zhuǎn)化體，挑取并接種到補(bǔ)加了羧芐青霉素(50ug/ml)的5ml Luria-Bertani培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)輪(wheel)中30℃過夜。將每份培養(yǎng)物稀釋(1∶50)至C.R.A.P.磷酸鹽-限制型培養(yǎng)基(3.57g(NIH4)2SO4，0.71g檸檬酸鈉-2H2O，1.07g KCl，5.36g酵母提取物(certified)，5.36g HycaseSF-Sheffield，用KOH將pH調(diào)整到7.3，用SQ H2O使qs至872ml，高壓滅菌；冷卻至55℃，添加110ml 1M MOPS pH 7.3，11ml 50％葡萄糖，7ml 1M MgSO4)。然后向誘導(dǎo)培養(yǎng)物中加入50ug/ml羧芐青霉素，除非特別指明，所有搖瓶誘導(dǎo)都在2ml體積中進(jìn)行。
在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行接種之后，根據(jù)每種樣品所采用的啟動子以及啟動子誘導(dǎo)所需的時間來改變條件。paTF130是一種用phoA啟動子控制輕鏈和重鏈基因的轉(zhuǎn)錄的載體，對它的誘導(dǎo)是在30℃振蕩～24小時，期間培養(yǎng)基中不進(jìn)行任何添加。該樣品中的磷酸鹽充分耗竭導(dǎo)致控制輕鏈和重鏈轉(zhuǎn)錄的phoA啟動子被同時誘導(dǎo)。pxTF-7T3FL是用phoA啟動子控制輕鏈表達(dá)而用tacII啟動子控制重鏈表達(dá)的啟動子，對它的誘導(dǎo)首先在與paTF130相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。30℃振蕩～16小時后，添加磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)至終濃度1mM。近45分鐘后，向培養(yǎng)基中添加IPTG至終濃度1mM，以便誘導(dǎo)tacII啟動子。在30℃振蕩條件下繼續(xù)誘導(dǎo)～8小時。paTF130系統(tǒng)代表了輕鏈和重鏈的轉(zhuǎn)錄同時被誘導(dǎo)的情況。另一方面，將pxTF-7T3FL系統(tǒng)在設(shè)計用于分時分別表達(dá)每條鏈的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，所述分別表達(dá)是首先誘導(dǎo)控制輕鏈轉(zhuǎn)錄的phoA啟動子，然后誘導(dǎo)控制重鏈轉(zhuǎn)錄的tacII啟動子。
從誘導(dǎo)過的培養(yǎng)物制備非還原型全細(xì)胞裂解物，方法如下(1)將1OD600-ml沉淀物在微量試管中離心；(2)將每份沉淀重新懸浮在90ul TE(10mM Tris pH 7.6，1mM EDTA)中；(3)向每份樣品中添加10ul 100mM碘乙酸(Sigma I-2512)以封閉任何游離半胱氨酸并阻止二硫鍵重排(disulfideshuffing)；(4)向每份樣品中添加20ul 10％SDS。將樣品渦旋，加熱到約90℃持續(xù)～3分鐘，然后再渦旋。待樣品冷卻到室溫后，加入～750ul丙酮使蛋白沉淀。將樣品渦旋，在室溫中靜置約15分鐘。將每份樣品在微量離心管中離心5分鐘后，吸出上清，將每份蛋白沉淀重懸在50ul dH20+50ul 2XNOVEX樣品緩沖液中。然后在約90℃將樣品加熱～3-5分鐘，充分渦旋，并冷卻到室溫。最后離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到干凈試管中。
還原型樣品采用類似于上述非還原型樣品的步驟來制備，不同的是在步驟(2)的細(xì)胞重懸液中添加10ul 1M DTT，并省略步驟(3)中添加IAA(碘乙酸)的步驟。將蛋白沉淀重懸在2X樣品緩沖液+dH2O之時，還添加濃度為100mM的還原劑。
制備好以后，每份樣品取5ul裝載至帶有10個孔的1.0mm NOVEX預(yù)制型12％Tris-Glycine SDS-PAG中，在～120伏特電泳1.5-2小時。用所得凝膠進(jìn)行免疫印跡分析。
在免疫印跡分析中，將SDS-PAGE凝膠電印跡至硝酸纖維素膜(NOVEX)上。然后用1X NET(150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris pH 7.4，0.05％Triton X-100)+0.5％明膠中室溫中將膜封閉30分鐘-1小時。在封閉步驟之后，將非還原型樣品的膜置于1X NET+0.5％明膠+抗-Fab抗體(過氧化物酶-偶聯(lián)型山羊IgG級分，對抗人IgG Fab；CAPPEL’55223)中，將還原型樣品的膜置于1X NET+0.5％明膠+抗-Fab抗體+抗-Fc抗體(Jackson ImmunoResearch Labs#109-035-008)中。將抗-Fab抗體根據(jù)其含量(lot)稀釋到1∶50,000-1∶1,000,000不等，將抗-Fc抗體稀釋到1∶1,000,000。將膜在所述抗體溶液中室溫?fù)u動過夜。次日早晨，將膜在1X NET+0.5％明膠中洗滌最少3×10分鐘，然后在TBS(20mM Tris pH 7.5，500mM NaCl)中洗滌1×15分鐘。被抗體結(jié)合的蛋白帶通過用Amersham Pharmacia Biotech ECL檢測并將膜在X-線膠片上曝光來觀察。
結(jié)果構(gòu)建了用于制備抗-組織因子IgGl的質(zhì)粒paTF130和pxTF-7T3FL，將它們轉(zhuǎn)化到33D3菌株中，如前文所述進(jìn)行誘導(dǎo)。然后制備非還原型和還原型全細(xì)胞裂解樣品，并通過免疫印跡進(jìn)行分析。結(jié)果見圖11A和圖11B。通過利用TIR’s(7輕鏈，3重鏈)，控制這些基因的多個啟動子被同時誘導(dǎo)，導(dǎo)致分泌受阻，用paTF130的還原型樣品證實了這一點(diǎn)(圖11A)。重鏈和輕鏈前體的積累在該泳道中非常明顯。極少量成熟輕鏈和成熟重鏈被檢測出，大部分蛋白以前體形式積累。但是，一旦重鏈和輕鏈被分時分別表達(dá)(如在pxTF-7T3FL中那樣)，則可積累顯著量的成熟輕鏈(圖11A)。盡管在該樣品中仍能檢測到少量輕鏈前體，但這一水平看來并不對輕鏈或重鏈的分泌造成任何問題。此外，分時表達(dá)導(dǎo)致成熟重鏈的有效分泌，分泌水平顯著高于用paTF130獲得的水平，并且沒有關(guān)于前體積累的跡象。
有效分泌與全長抗體裝配的相關(guān)性用非還原樣品來顯示(圖11B)。兩種樣品中都檢測到全長抗體；但含量相差很大。如箭頭所示，在paTF130樣品中僅檢測到微弱的全長帶。這條帶在pxTF-7T3FL樣品中變得非常明顯。
實施例3.制備抗-組織因子F(ab’)2在該實施例中，用單啟動子質(zhì)粒pCYC56作對照。pCYC56結(jié)構(gòu)類似于pS1130，不同的是其插入序列編碼抗-組織因子抗體的輕鏈和重鏈片段。構(gòu)建雙啟動子質(zhì)粒pxTF-7T3，它與實施例1的雙啟動子質(zhì)粒pxCD18-7T3相似，用它實現(xiàn)抗-組織因子輕鏈和重鏈的分時分別表達(dá)。將質(zhì)粒pMS421的lacI序列插入pxTF-7T3中，產(chǎn)生新的雙啟動子pJVG3IL。lacI的加入消除了與pMS421進(jìn)行共表達(dá)的需要。
這些發(fā)酵中所用的宿主菌株是大腸桿菌W3110的衍生物，命名為60H4。60H4的完整基因型為W3110 ΔfhuAΔmanA phoAΔE15Δ(argF-lac)169 deoC2 degP41(ΔpstI-Kanr)IN(rrnD-rrnE)1 ilvG2096(Valr)Δprc prc-suppressor。將60H4宿主細(xì)胞用pCYC56，pJVG3IL，或者pxTF-7T3與pMS421的組合來轉(zhuǎn)化，選出成功的轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行培養(yǎng)。
用類似于實施例1中抗-CD18 F(ab’)2的條件進(jìn)行發(fā)酵，原則上區(qū)別在于，發(fā)酵耗時從近72小時到114小時不等，當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到OD550 220后，用IPTG將重鏈誘導(dǎo)近4-12小時。
也采用抗-CD18 F(ab’)2的蛋白G實驗分析抗-組織因子F(ab’)2產(chǎn)物，不同的是，采用抗-組織因子F(ab’)2標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。
用上述啟動子系統(tǒng)進(jìn)行了一系列抗-組織因子F(ab’)2發(fā)酵。裝配好的抗-組織因子F(ab’)2復(fù)合物的產(chǎn)量從單啟動子系統(tǒng)的1g/L增加到雙啟動子系統(tǒng)的2.6±0.3g/L(n＝13)，所用質(zhì)粒為pJVG3IL。
上述結(jié)果表明，通過將輕鏈和重鏈分時分別合成，可以使裝配好的抗-組織因子F(ab’)2的產(chǎn)量顯著增加。
盡管上文描述了具體實施方式
，但應(yīng)理解本發(fā)明不限于此。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以中不違背本發(fā)明總體精神的前提下對所公開的實施方案進(jìn)行各種改動。所有這些改動都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種在宿主細(xì)胞中制備功能性抗體或其片段的方法，所述宿主細(xì)胞被兩種不同的翻譯單元轉(zhuǎn)化，所述翻譯單元分別編碼所述抗體或其片段的輕鏈和重鏈，所述方法包括以下步驟a)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，所用的培養(yǎng)條件適合于依次表達(dá)所述輕鏈和重鏈，從而分時分別產(chǎn)生所述輕鏈和重鏈；和b)使所述輕鏈和重鏈裝配，形成功能性抗體或其片段。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞，每種翻譯單元還包含編碼原核分泌信號或其變體的核苷酸序列，該序列與所述輕鏈或重鏈的N’-末端可操作相連。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述兩種不同翻譯單元受不同啟動子的控制。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述兩種不同翻譯單元位于單個重組載體上。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述分泌信號選自STII，OmpA，PhoE，LamB，MBP或PhoA。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述分泌信號是STII。
7.權(quán)利要求3的方法，其中每種翻譯單元的啟動子選自phoA，TacI，TacII，lpp，lac-lpp，lac，ara，trp，trc或T7啟動子。
8.權(quán)利要求7的方法，其中一種啟動子是phoA啟動子，另一種啟動子是TacII啟動子。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體片段選自Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)(ab’)2-亮氨酸拉鏈，F(xiàn)v或dsFv。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體特異于選自VEGF，IgE，CD11，CD18或組織因子(TF)的抗原。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體是抗-CD18抗體或抗-TF抗體。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是嵌合抗體。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是人的抗體。
15.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述宿主細(xì)胞是來自大腸桿菌菌株的原核細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述大腸桿菌菌株經(jīng)過遺傳改造，能過度表達(dá)至少一種選自DsbA，DsbC，DsbG或FkpA的侶伴蛋白。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述大腸桿菌菌株有內(nèi)源性蛋白酶活性缺陷。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述大腸桿菌菌株的基因型包含Δprcprc-suppressor。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體的重鏈為全長鏈。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述輕鏈?zhǔn)紫缺磉_(dá)，所述全長重鏈隨后表達(dá)。
21.一種依次表達(dá)抗體或其片段的輕鏈和重鏈的系統(tǒng)，它包含被重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述載體包含分別編碼所述輕鏈和重鏈的兩種不同翻譯單元，每種翻譯單元與一種不同的啟動子相連，其中在適當(dāng)?shù)臈l件下，所述兩種翻譯單元是分時分別活化的，使得輕鏈和重鏈被依次表達(dá)。
22.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，所述每種翻譯單元還包含編碼原核分泌信號的核苷酸序列，該序列與編碼所述輕鏈或重鏈的核酸的5’-末端可操作相連。
23.權(quán)利要求22的系統(tǒng)，其中所述分泌信號選自STII，OmpA，PhoE，LamB，MBP或PhoA。
24.權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中所述分泌信號為STII。
25.權(quán)利要求24的系統(tǒng)，其中在兩種翻譯單元中分別使用兩種STII變體，來提供約7份輕鏈，3份重鏈的翻譯強(qiáng)度組合。
26.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述每種翻譯單元與不同的誘導(dǎo)型啟動子可操作相連。
27.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述誘導(dǎo)型啟動子選自phoA，TacI，TacII，lpp，lac-lpp，lac，ara，trp，trc或T7啟動子。
28.權(quán)利要求27的系統(tǒng)，其中一種啟動子是phoA啟動子，另一種啟動子是TacII啟動子。
29.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述抗體片段選自Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)(ab’)2-亮氨酸拉鏈，F(xiàn)v或dsFv。
30.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述抗體特異于選自VEGF，IgE，CD11，CD18或組織因子(TF)的抗原。
31.權(quán)利要求30的系統(tǒng)，其中所述抗體是抗-CD18抗體或抗-TF抗體。
32.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述抗體是嵌合抗體。
33.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述抗體是人源化抗體。
34.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述抗體是人的抗體。
35.權(quán)利要求21或22的系統(tǒng)，其中所述宿主細(xì)胞是來自大腸桿菌菌株的原核細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35的系統(tǒng)，其中所述大腸桿菌菌株經(jīng)過遺傳改造，能過度表達(dá)至少一種選自DsbA，DsbC，DsbG或FkpA的侶伴蛋白。
37.權(quán)利要求35的系統(tǒng)，其中所述大腸桿菌菌株有內(nèi)源性蛋白酶活性缺陷。
38.權(quán)利要求37的系統(tǒng)，其中所述大腸桿菌菌株的基因型包含Δprcprc-suppressor。
39.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述抗體的重鏈為全長鏈。
40.權(quán)利要求39的系統(tǒng)，其中所述輕鏈?zhǔn)紫缺磉_(dá)，所述全長重鏈隨后表達(dá)。
41.一種用于在宿主細(xì)胞中制備功能性抗體或其片段的重組載體，所述載體包含a)第一種啟動子，它位于第一種編碼分泌信號的翻譯單元之前，所述第一種分泌信號與輕鏈可操作相連，和b)第二種啟動子，它位于第二種編碼分泌信號的翻譯單元之前，所述第二種分泌信號與重鏈可操作相連，所述第一種啟動子和第二種啟動子在不同條件下被誘導(dǎo)。
42.權(quán)利要求41的重組載體，其中所述第一種和第二種啟動子選自phoA，TacI，TacII，lpp，lac-lpp，lac，ara，trp，trc或T7啟動子。
43.權(quán)利要求42的重組載體，其中所述第一種啟動子是phoA啟動子，所述第二種啟動子是TacII啟動子。
44.權(quán)利要求41的重組載體，其中所述分泌信號選自STII，OmpA，PhoE，LamB，MBP或PhoA。
45.權(quán)利要求44的重組載體，其中所述分泌信號是STII。
46.權(quán)利要求41的重組載體，其中所述抗體片段選自Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或dsFv。
47.權(quán)利要求46的重組載體，其中所述抗體片段與一種二聚體化結(jié)構(gòu)域融合。
48.權(quán)利要求41的重組載體，其中所述抗體特異于選自VEGF，IgE，CD11，CD18或組織因子(TF)的抗原。
49.權(quán)利要求48的重組載體，其中所述抗體是抗-CD18抗體。
50.權(quán)利要求49的重組載體，其中所述抗體是抗-CD18 F(ab’)2-亮氨酸拉鏈融合體。
51.權(quán)利要求50的重組載體，其中所述抗體具有SEQ ID NO1所示輕鏈。
52.權(quán)利要求50的重組載體，其中所述抗體具有SEQ ID NO2所示重鏈。
53.權(quán)利要求50的重組載體，它是包含SEQ ID NO3所示核酸序列的pxCD18-7T3載體。
54.權(quán)利要求48的重組載體，其中所述抗體是抗-TF抗體。
55.權(quán)利要求54的重組載體，所述抗體具有SEQ ID NO4所示輕鏈。
56.權(quán)利要求54的重組載體，所述抗體具有SEQ ID NO5所示重鏈。
57.權(quán)利要求54的重組載體，它是包含SEQ ID NO6所示核酸序列的pxTF-7T3FL載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在宿主細(xì)胞系統(tǒng)，例如原核和真核的表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)并產(chǎn)生重組抗體的方法和組合物。本發(fā)明具體涉及分時分別表達(dá)抗體輕鏈和重鏈的重組系統(tǒng)?？贵w產(chǎn)物，包括抗體片段，可用于生物學(xué)研究、診斷以及醫(yī)學(xué)治療的各個方面。
文檔編號C12P21/02GK1549821SQ02816887
公開日2004年11月24日 申請日期2002年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月27日
發(fā)明者達(dá)納·C·安德森, 勞拉·C·西蒙斯, C 西蒙斯, 達(dá)納 C 安德森 申請人:杰南技術(shù)公司