本發(fā)明屬于抗血栓藥物領(lǐng)域，涉及rip3抑制劑在制備抗血小板血栓藥物中的用途。

背景技術(shù)：

眾所周知，血小板在止血和血栓形成過程中舉足輕重。一旦血管出現(xiàn)損傷，血小板即可黏附至內(nèi)皮下的蛋白成分，同時發(fā)生活化，從而觸發(fā)血小板內(nèi)致密顆粒的釋放及血栓素a2（txa2）的合成。釋放出的可溶性血小板激動劑（如二磷酸腺苷（adp）、凝血酶及txa2）進(jìn)一步募集循環(huán)中的血小板，并通過結(jié)合至血小板表面的g蛋白偶聯(lián)受體（gprotein-coupledreceptor，gpcr）使聚集反應(yīng)更加穩(wěn)定，從而形成不可逆的血小板血栓，達(dá)到凝血、止血的效果。

adp作為致密顆粒中的重要組分，在低濃度激動劑引起的血小板活化的信號放大效應(yīng)中起主要介導(dǎo)作用。adp通過p2y1及p2y12受體分別激動gq及gi信號通路。p2y1受體在adp誘導(dǎo)的血小板活化中起著微弱卻至關(guān)重要的始動作用，p2y12受體不但接續(xù)并完善由p2y1起始的血小板聚集，更重要的是，參與其他激動劑（如txa2、凝血酶等）誘導(dǎo)的血小板聚集。因此，當(dāng)血小板受到低濃度激動劑的刺激時，adp的作用尤為重要。

txa2或凝血酶刺激血小板均可導(dǎo)致adp自致密顆粒中釋放。雖然txa2通過血栓素a2/前列腺素h2（tp）受體激活血小板，而凝血酶通過蛋白酶活化受體（protease-activatedreceptors，pars）激活血小板，但是兩者均與gq及g13通路偶聯(lián)，而致密顆粒的釋放恰恰需要gq及g13通路的活化。從血小板中去除gq或g13不僅顯著抑制了致密顆粒的釋放，亦可影響體內(nèi)初級止血以及動脈血栓的形成。作為穩(wěn)定的txa2類似物，u46619可以誘導(dǎo)adp的二相釋放，而磷脂酰肌醇-3-激酶（pi3k）的激活對adp的二相釋放同樣發(fā)揮重要作用。去除pi3k的下游分子akt1或akt2可以減弱血小板的活化及致密顆粒的釋放。另外，pi3k可經(jīng)由gpcr結(jié)合到gβγ。由此可見，pi3k-akt信號通路在gpcr激動劑誘導(dǎo)的血小板釋放過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

受體相互作用蛋白激酶（receptor-interactingproteinkinase，rip）是一類具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，包含7個成員（即rip1-7），其在n末端均含有一段高度同源的激酶結(jié)構(gòu)域（kinasedomain，kd），并且具有不同的c末端。其中，含有518個氨基酸的rip3蛋白是rip激酶家族中分子量最小的蛋白質(zhì)，其n末端包含的kd對其激酶活性及自身磷酸化均至關(guān)重要，而c末端包含的rip同型相互作用基序（riphomotypicinteractionmotif，rhim）可介導(dǎo)rip3與其他壞死性凋亡（necroptosis）相關(guān)蛋白的相互作用?，F(xiàn)有研究大多關(guān)注rip3對細(xì)胞凋亡和程序性壞死的調(diào)控作用，但其在止血和血栓形成中的地位尚屬未知。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明首次通過實驗探究了rip3在止血和血栓形成過程中的作用，發(fā)現(xiàn)rip3不僅在體外實驗中參與血小板的調(diào)節(jié)，而且在體內(nèi)的止血和血栓形成過程中也發(fā)揮重要作用，可以作為抗血栓的新靶點。通過調(diào)節(jié)adp的釋放，rip3選擇性地影響了血栓素a2（txa2）及凝血酶介導(dǎo)的血小板活化，表明rip3抑制劑可以參與血小板血栓形成過程，進(jìn)而抑制血栓形成，可以開發(fā)成新型抗血栓藥物，極具科研和經(jīng)濟(jì)價值。因此，本發(fā)明提供了rip3抑制劑在制備抗血小板血栓藥物中的用途。

目前，關(guān)于rip3抑制劑的研究報道尚不多見，主要集中于以下三類：（1）無機(jī)物類抑制劑；（2）小分子有機(jī)物類抑制劑；以及（3）核酸和蛋白質(zhì)類抑制劑。

無機(jī)物類抑制劑通常為金屬離子的氯化物（如hg2cl2）、氟化物（如bef2）和磷酸鹽（如cu3(po4)2），對常見的蛋白激酶均能夠產(chǎn)生抑制作用。但由于其毒性較大、選擇性較差，適用范圍比較受限。

小分子有機(jī)物類抑制劑是rip3抑制劑中最重要的一類，包含了較為繁多的結(jié)構(gòu)類型，逐漸成為國內(nèi)外制藥企業(yè)的關(guān)注熱點。小分子有機(jī)物類抑制劑直接作用于rip3中n末端的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性結(jié)構(gòu)域，起到抑制rip3的作用，其主要包括如下類型：氨基苯并噻唑類抑制劑（如gsk’872、gsk’843）、二芳基馬來酰亞胺類抑制劑（如enzastaurin、sb216763等）、二芳基脲類抑制劑（如sorafenib）、苯氨基喹唑啉類抑制劑（如vandetanib、erlotinib等）、異喹啉磺胺類抑制劑（如fasudil）、吡啶并咪唑類抑制劑（如vemurafenib）和十字孢堿類抑制劑（如staurosporine）等。

在核酸和蛋白質(zhì)類抑制劑中，多聚核苷酸類抑制劑通過由自身核酸序列編碼的蛋白質(zhì)作用于rip3中n末端的kd，發(fā)揮rip3抑制作用。除了通過核酸序列編碼相應(yīng)的蛋白質(zhì)以外，rip3抗體同樣可以直接作用于rip3中n末端的kd，從而抑制rip3的活性。因此，作為能夠有效抑制rip3活性的一類物質(zhì)，核酸和蛋白質(zhì)類抑制劑同樣可以發(fā)揮抗血小板血栓的功能。

本發(fā)明首次通過實驗探究了rip3與止血和血栓形成過程之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rip3不僅在體外實驗中參與血小板的調(diào)節(jié)，而且在體內(nèi)的止血和血栓形成過程中也發(fā)揮重要作用，可以作為抗血栓的新靶點，為抗血栓藥物研發(fā)提供了新方向。

附圖說明

圖1為wt與rip3^-/-小鼠的尾出血時間示意圖。

圖2為通過實時顯微術(shù)記錄的wt與rip3^-/-小鼠體內(nèi)fecl3誘導(dǎo)的腸系膜動脈血栓形成的典型性圖像，圖像右下角標(biāo)注了fecl3致?lián)p后的時間。

圖3為通過fecl3損傷測定的wt與rip3^-/-小鼠體內(nèi)腸系膜動脈的阻塞時間示意圖。

圖4為白細(xì)胞和血小板的免疫印跡法示意圖。

圖5為來源于分別采用wt和rip3^-/-小鼠供體骨髓衍生細(xì)胞重新填充的rip3^-/-（wt→rip3^-/-）和wt（rip3^-/-→wt）小鼠的血小板內(nèi)rip3表達(dá)的示意圖。

圖6為通過fecl3損傷測定的采用wt或rip3^-/-小鼠供體骨髓衍生細(xì)胞重新填充的wt和rip3^-/-小鼠體內(nèi)腸系膜動脈的阻塞時間示意圖。

圖7為來源于wt（n=27）和rip3^-/-小鼠（n=26）的全血中檢測到的血小板計數(shù)示意圖。

圖8為wt和rip3^-/-小鼠血小板的電子顯微鏡分析圖。

圖9為不同基因型小鼠的ag和dg的定量示意圖。

圖10為采用特異性抗體通過流式細(xì)胞儀檢測的wt和rip3^-/-小鼠血小板膜表面主要糖蛋白表達(dá)的示意圖。

圖11為rip3在血小板聚集中的作用示意圖。

圖12為響應(yīng)低劑量u46619或凝血酶的rip3^-/-血小板的atp分泌示意圖。

圖13為不足以誘導(dǎo)聚集的、低濃度的adp（0.25μm）翻轉(zhuǎn)rip3缺失對325nmu46619或0.008u/ml凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用的示意圖。

圖14為采用指定劑量的u46619或凝血酶刺激的小鼠血小板中p-選擇素暴露的流式細(xì)胞儀分析示意圖。

圖15為采用凝血酶（0.008u/ml）、adp（2.5mm）、膠原（0.5μg/ml）或載體（對照）刺激的wt和rip3^-/-血小板中txb2生產(chǎn)的示意圖。

圖16為rip3在akt、gsk3β、erk和p38mapk磷酸化中的作用的示意圖。

圖17為采用抑制劑（sb216763）或載體（dmso）預(yù)處理后觀察到的u46619或凝血酶刺激wt和rip3^-/-血小板聚集的示意圖。

圖18為與采用載體（對照）或者指定劑量的u46619或凝血酶刺激的wt和rip3^-/-血小板結(jié)合的pe-jon/a（ab）的流式細(xì)胞儀分析示意圖。

圖19為與采用凝血酶或載體刺激的wt和rip3^-/-血小板結(jié)合的fitc標(biāo)記的纖維蛋白原的流式細(xì)胞儀分析示意圖。

圖20為rip3抑制劑抑制u46619和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的示意圖。

圖21為通過實時顯微術(shù)記錄的注射有g(shù)sk'872或載體（dmso）的c57d小鼠體內(nèi)fecl3誘導(dǎo)的腸系膜動脈血栓形成的典型性圖像，每一個圖像的右下角都標(biāo)出fecl3致?lián)p后的時間。

圖22為通過fecl3損傷測定的注射有g(shù)sk'872或載體的c57d小鼠體內(nèi)腸系膜動脈的阻塞時間示意圖。

具體實施方式

以下將結(jié)合附圖和具體實施例來進(jìn)一步解釋和說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實施例一：gsk’872的抗血栓形成實驗。

1、試劑與材料：

阿司匹林、a3p5p、牛血清白蛋白（bsa）、戊巴比妥鈉、rgds（arg-gly-asp-ser）、sb216763購自sigma-aldrich公司；calcein-am購自同仁化學(xué)研究所；u46619購自calbiochem公司；凝血酶、膠原、adp以及chrono-lume購自chronolog公司；fitc標(biāo)記的小鼠p-selectin（wug.e9）、pe標(biāo)記的小鼠integrinαiibβ3（jon/a）、抗小鼠gpib抗體購自emfretanalytics公司；pe標(biāo)記抗小鼠cd41購自biolegend公司；fitc標(biāo)記小鼠纖維蛋白原購自abcam公司；txb2酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自enzolifesciences公司；抗小鼠rip3抗體購自prosci公司；抗磷酸化akt（thr308）、抗磷酸化akt（ser473）、抗總akt、抗磷酸化erk1/2（thr202/tyr204）、抗磷酸化gsk3β（ser9）、抗人rip3以及抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自cellsignalingtechnology公司；mrs2395由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院丁忠仁教授惠贈；rip3抑制劑gsk’872購自德國merckmillipore公司。

2、實驗用小鼠：

rip3基因敲除小鼠以c57b6為背景，由北京生命科學(xué)研究院王曉東教授提供。應(yīng)用與rip3基因敲除小鼠具有相同遺傳背景的野生型（wt）小鼠作為對照。全部動物實驗均經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

3、尾出血時間：

采用2%戊巴比妥鈉將6至8周齡的小鼠麻醉，快速自鼠尾末端切去3mm，立即浸入到37℃恒溫水浴的等滲pbs中，計數(shù)尾出血時間。出血終止以60s內(nèi)無再次出血為標(biāo)準(zhǔn)，tbt＞600s為觀察終點。

4、洗滌血小板：

健康成人志愿者自肘正中靜脈采血，并按照li,z.,zhang,g.,lebreton,g.c.,etal.,twowavesofplateletsecretioninducedbythromboxanea2receptorandacriticalroleforphosphoinositide3-kinase[j],j.biol.chem.,2003,278:30725-30731中報道的方法洗滌血小板，獻(xiàn)血者均知情同意并簽署協(xié)議書。實驗方案經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合赫爾辛基宣言。

按照同樣的方法洗滌小鼠血小板。小鼠全身麻醉后，自下腔靜脈采血，1/7體積的acd抗凝。全血離心200g×11min，以獲得富血小板血漿（prp）。prp中的血小板以cgs洗滌2次，每次離心600g×2min。末次離心后棄上清，以modifiedtyrode’sbuffer（mtb）重懸。室溫靜置2h后用于實驗。

5、電鏡：

洗滌血小板以2.5%戊二醛于4℃固定過夜。室溫離心600g×2min以收集細(xì)胞沉淀。細(xì)胞沉淀以pbs洗滌，以1.0%鋨酸室溫固定1h，梯度丙酮脫水，70%丙酮-飽和醋酸鈾于4℃過夜，包埋并制備超薄切片。hitachih600透射電鏡觀察血小板形態(tài)及顆粒內(nèi)容物。wt組及rip3基因敲除組各選擇20個血小板（來自5個不同視野）進(jìn)行觀察并拍照。

6、體內(nèi)血栓成像：

按照ni,h.,papalia,j.m.,degen,j.l.,etal.,controlofthrombusembolizationandfibronectininternalizationbyintegrinalphaiibbeta3engagementofthefibrinogengammachain[j],blood,2003,102:3609-3614中報道的方法制備fecl3誘導(dǎo)的腸系膜微血管栓塞模型。自供體小鼠分離血小板，洗滌并以calcein-am（5μg/ml）標(biāo)記。雄性受體小鼠戊巴比妥鈉麻醉，按照5×10⁶/g劑量球后注射相應(yīng)基因型的calcein標(biāo)記的血小板，放置于37℃預(yù)溫的平板上。腹前正中切口，顯露腸系膜血管床，在熒光顯微鏡（leica公司）下觀察并選擇合適的血管，在適當(dāng)部位放置3mm²左右的5%fecl3浸潤的濾紙片，計時，觀察血流中斷及血栓形成的情況。在抑制劑實驗中，先將抑制劑通過眼球后靜脈注射吸收后，再進(jìn)行血栓形成實驗。

7、全身照射及骨髓移植：

雄性wt及rip3基因敲除小鼠（10周齡）接受co⁶⁰來源的8gy劑量的全身照射。收集來自雄性wt及rip3基因敲除小鼠（8周齡）股骨及脛骨的骨髓細(xì)胞，并按照1×10⁷/只小鼠給予注射（接受照射后6h內(nèi)完成），放入ivc專用動物房，給予酸化水、co⁶⁰輻照飼料及墊料，每日觀察生存情況；3~4周后存活小鼠測定全血細(xì)胞計數(shù)，若恢復(fù)正常即可用于下一步實驗。移植是否成功通過westernblotting檢測受體小鼠血小板中rip3蛋白的表達(dá)來確定。

8、血小板聚集及釋放實驗：

血小板的聚集及釋放通過chrono-loglumi血小板聚集儀記錄。洗滌血小板（3×10⁸/ml）由不同激動劑刺激。10μl螢光素/螢光素酶在刺激前2min內(nèi)加入到240μl血小板懸液中。在某些實驗中，血小板懸液預(yù)先給予不同抑制劑于37℃預(yù)處理。聚集及釋放曲線持續(xù)記錄5至10min。

9、txa2合成的檢測：

txa2的合成用其穩(wěn)定的代謝物txb2來表示。血小板用如前所述的不同激動劑刺激，txb2的合成用txb2酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行檢測。

10、流式細(xì)胞術(shù)：

洗滌血小板（3×10⁸/ml）分別加入不同濃度激動劑進(jìn)行刺激，并同時加入fitc標(biāo)記的小鼠p-selectin（wug.e9）或pe標(biāo)記的小鼠integrinαiibβ3（jon/a），室溫避光放置15min；加入pbs終止反應(yīng)，通過cytomics^tmfc500mcl流式細(xì)胞儀（beckmancoulter公司）檢測熒光陽性細(xì)胞群體比例以及平均熒光強(qiáng)度。

11、纖維蛋白原結(jié)合實驗：

洗滌血小板分別加入不同濃度凝血酶或其溶劑以及fitc標(biāo)記小鼠纖維蛋白原（135μg/ml），同時以rgds處理管（2mm，37℃，5min）作為陰性對照，以排除非特異結(jié)合。于37℃避光放置30min，每管內(nèi)加入350μlpbs終止反應(yīng)，上機(jī)檢測結(jié)合熒光標(biāo)記纖維蛋白原的細(xì)胞群體陽性率及平均熒光強(qiáng)度。

12、westernblotting：

洗滌血小板（轉(zhuǎn)速1000rpm），以凝血酶或u46619刺激，根據(jù)聚集曲線在不同時間點加入2x細(xì)胞裂解液（含2mmpmsf、2mmnaf、2mmna3vo4以及蛋白酶抑制劑）終止反應(yīng)，冰上裂解，制樣。樣本以免疫印跡法檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)。

13、統(tǒng)計學(xué)分析：

全部數(shù)據(jù)均來源于至少3次相互獨立的實驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用prismversion5.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行非配對studentt檢驗，p<0.05作為差異性顯著界值。

14、實驗結(jié)果：

（1）rip3基因敲除小鼠表現(xiàn)出止血功能受損以及血栓形成受抑的傾向：

為了研究rip3在體內(nèi)止血過程中的作用，按照estevez,b.,etal.,limkinase-1selectivelypromotesglycoproteinib-ix-mediatedtxa2synthesis,plateletactivation,andthrombosis[j],blood,2013,121:4586-4594中報道的方法，對rip3基因敲除小鼠進(jìn)行尾出血時間的檢測。rip3基因敲除小鼠在其生命周期中并未表現(xiàn)出顯著的出血傾向或發(fā)生血栓栓塞事件，但是其尾出血時間的中位值（410s）較wt小鼠（223s）顯著延長。使用雙尾mann-whitney檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，表明2組動物之間具有顯著性差異（^***p<0.0001），結(jié)果如圖1所示。此外，有44.4%的rip3基因敲除小鼠在為期10分鐘的觀察時間內(nèi)不能停止出血。以上數(shù)據(jù)表明rip3在初期止血過程中具有重要作用。

應(yīng)用fecl3損傷導(dǎo)致的腸系膜微動脈血栓模型來探索rip3在體內(nèi)血栓形成過程中的作用。血栓形成過程在熒光顯微鏡下實時監(jiān)測，結(jié)果如圖2所示。rip3基因敲除小鼠微動脈的阻塞時間（19.9±1.1min）較wt小鼠（13.5±1.2min）延遲（^**p=0.0012），結(jié)果如圖3所示。以上數(shù)據(jù)說明rip3在體內(nèi)參與血栓形成過程。

（2）rip3表達(dá)于血小板并參與調(diào)節(jié)小鼠血栓形成：

由于血小板在止血和血栓形成過程中起重要作用，因此首先需要檢測血小板內(nèi)是否有rip3的表達(dá)。采用免疫印跡法進(jìn)行檢測，其具體方法如下：在室溫下，將洗滌后的血小板再懸浮于裂解緩沖液（包含0.15mnh4cl、10mmnahco3和1mmedta）中10min，通過600g×5min離心采用0.9%生理鹽水洗滌白細(xì)胞，采用sds-page上樣緩沖液裂解洗滌后的血小板和白細(xì)胞，并采用針對rip3和cd45（白細(xì)胞標(biāo)記物）的抗體通過免疫印跡法探測血小板和白細(xì)胞，針對β-actin的印跡被用作泳道內(nèi)參照，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，人與小鼠的血小板內(nèi)有rip3的表達(dá)，同時證實了在rip3基因敲除小鼠的血小板中無rip3的表達(dá)。

除了血小板以外，尚有其他因素參與體內(nèi)止血和血栓形成過程，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞。為了確定究竟是內(nèi)皮細(xì)胞還是血小板在rip3基因敲除小鼠的止血和血栓形成缺陷中起主要作用，對wt及rip3基因敲除小鼠分別進(jìn)行骨髓移植，來源于wt和rip3^-/-小鼠的血小板被用作對照物，而β-actin被用作泳道內(nèi)參照。接受wt小鼠骨髓細(xì)胞移植的rip3基因敲除小鼠（wt→rip3^-/-）的血小板內(nèi)rip3表達(dá)水平與wt小鼠相仿，而接受rip3基因敲除小鼠骨髓細(xì)胞移植的wt小鼠（rip3^-/-→wt）的血小板無rip3表達(dá)，結(jié)果如圖5所示。

關(guān)于血管阻塞時間，rip3^-/-→wt小鼠（18.4±1.2min）比wt→rip3^-/-小鼠（12.5±0.9min）顯著延長（^**p=0.0047），而接受rip3基因敲除小鼠骨髓細(xì)胞移植的rip3基因敲除小鼠（rip3^-/-→rip3^-/-）（17.8±1.8min）也比接受wt小鼠骨髓細(xì)胞移植的wt小鼠（wt→wt）（12.6±1.2min）長（^*p=0.035），結(jié)果如圖6所示。此外，wt→wt及wt→rip3^-/-小鼠的血管阻塞時間與wt相仿，而rip3^-/-→rip3^-/-及rip3^-/-→wt小鼠的血管阻塞時間與rip3^-/-小鼠相近。以上數(shù)據(jù)表明，血小板而非內(nèi)皮細(xì)胞的rip3缺陷是rip3基因敲除小鼠血栓形成受抑的主要原因。

此外，與wt小鼠相比，rip3基因敲除小鼠在紅細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)及血紅蛋白濃度等方面均無顯著差異，而血小板計數(shù)甚至略有升高（^*p<0.05，如圖7所示）。無論細(xì)胞計數(shù)分析抑或電鏡觀察結(jié)果（如圖8所示）均顯示rip3基因敲除小鼠的血小板大小及形態(tài)與正常情況無差異。兩種基因型小鼠的α-顆粒（ag）和致密顆粒（dg）的數(shù)量（如圖9所示）以及血小板膜表面主要糖蛋白（gp）cd42b（gpibα）和cd41（αiib亞基）的表達(dá)（如圖10所示）亦無差異。

（3）rip3缺失導(dǎo)致凝血酶及u46619誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)受抑：

檢測激動劑誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)，以確定rip3在其中所發(fā)揮的作用。在持續(xù)攪拌的條件下，于37℃采用不同濃度的u46619、凝血酶（thrombin）、膠原（collagen）和adp刺激來源于wt和rip3^-/-小鼠的洗滌后的血小板，使用比濁集合度計監(jiān)測血小板聚集，結(jié)果如圖11所示。rip3基因敲除小鼠的血小板對于低濃度的u46619（^****p<0.0001）及凝血酶（^*p=0.016，^**p=0.0071）誘導(dǎo)的聚集呈現(xiàn)出顯著的反應(yīng)降低，增加激動劑的劑量則可以糾正這一缺陷，但在膠原及adp誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)中則未見顯著差異。上述數(shù)據(jù)表明，rip3選擇性地參與由低濃度u46619或凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的信號放大過程。

（4）rip3缺失導(dǎo)致凝血酶及u46619誘導(dǎo)的血小板adp釋放受抑：

如前所述，自血小板致密顆粒中釋放的adp在提高血小板對低濃度激動劑的敏感性及放大血小板聚集反應(yīng)中發(fā)揮非常重要的作用。rip3缺失僅在應(yīng)用低濃度刺激劑時導(dǎo)致血小板聚集受抑，由此可以假設(shè)rip3影響了刺激劑誘導(dǎo)的adp釋放環(huán)節(jié)。為了驗證這一假設(shè)，檢測刺激劑誘導(dǎo)的atp釋放作為致密顆粒釋放的指標(biāo)。采用不同濃度的u46619或凝血酶刺激來源于wt和rip3^-/-小鼠的洗滌后的血小板，在螢光素/螢光素酶試劑（80nm）的存在下與血小板聚集同時記錄atp分泌。如圖12所示，rip3基因敲除血小板中低濃度u46619誘導(dǎo)的二相釋放反應(yīng)缺失，在低濃度凝血酶誘導(dǎo)的atp釋放中亦可觀察到同樣的現(xiàn)象。上述結(jié)果表明，rip3缺失可導(dǎo)致凝血酶及u46619誘導(dǎo)的血小板致密顆粒釋放受抑。

為了進(jìn)一步確定致密顆粒釋放的adp在刺激劑誘導(dǎo)的血小板活化過程中的作用，采用特異性拮抗劑a3p5p和mrs2395分別阻斷相應(yīng)的adp受體p2y1和p2y12，結(jié)果如圖13所示。a3p5p和mrs2395在wt及rip3^-/-血小板中均可抑制u46619誘導(dǎo)的二相聚集與釋放，亦可抑制低濃度凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集與釋放。上述結(jié)果表明，在低濃度u46619和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集中，致密顆粒釋放的adp發(fā)揮非常重要的作用。

（5）adp釋放受抑與rip3基因敲除血小板聚集功能降低有關(guān)：

adp誘導(dǎo)的rip3基因敲除血小板聚集反應(yīng)并未受到抑制，表明rip3信號通路在adp誘導(dǎo)的整合素活化及血小板聚集中并非必需，由此假設(shè)rip3缺失對于u46619或凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用是其抑制adp釋放的結(jié)果。為了驗證這一假設(shè)，檢測補(bǔ)充外源性adp是否可以糾正u46619及凝血酶在rip3基因敲除血小板中引起的聚集受抑。補(bǔ)充單獨應(yīng)用不足以誘導(dǎo)血小板發(fā)生聚集的低濃度adp后即可糾正低濃度u46619及凝血酶在rip3基因敲除血小板中引起的聚集受抑。上述結(jié)果表明，adp釋放受抑與rip3基因敲除血小板聚集功能降低有關(guān)，而rip3在血小板活化中的初步功能是介導(dǎo)u46619或凝血酶刺激導(dǎo)致的adp釋放。

（6）rip3基因敲除血小板α-顆粒的釋放及txa2的產(chǎn)生：

各種刺激劑誘導(dǎo)的顆粒釋放及txa2的產(chǎn)生在刺激信號的放大中起到重要作用，并可進(jìn)一步使血管損傷部位血小板的活化趨于穩(wěn)定。因此，進(jìn)一步檢測rip3基因敲除血小板α-顆粒的釋放，結(jié)果如圖14所示。從中可以發(fā)現(xiàn)，在u46619刺激的血小板中僅能檢測到極為微量的α-顆粒釋放，而在凝血酶刺激的wt及rip3^-/-血小板中也沒有觀察到α-顆粒釋放的顯著性差異。

通過檢測txa2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物txb2，進(jìn)一步探討rip3是否參與介導(dǎo)txa2的合成，結(jié)果如圖15所示。在凝血酶及膠原刺激的wt及rip3^-/-血小板中，沒有觀察到txa2合成的顯著性差異，但在adp誘導(dǎo)的rip3^-/-血小板中，txb2的合成卻顯著高于wt血小板（^*p<0.05）。

（7）rip3參與調(diào)節(jié)血小板akt磷酸化：

由于pi3k/akt信號通路被證實參與u46619誘導(dǎo)的血小板的二相釋放，因此推測rip3可能通過pi3k/akt通路來調(diào)節(jié)致密顆粒的釋放。在37℃和1000rpm攪拌速度下，采用100nmu46619或0.006u/ml凝血酶在指定的時間內(nèi)刺激洗滌后的血小板。將血小板溶解，并通過westernblotting采用anti-phospho-akt（thr³⁰⁸/ser⁴⁷³）、anti-phospho-gsk3β（ser⁹）、anti-phospho-erk、anti-phospho-p38或anti-β-actin（作為泳道內(nèi)參照）抗體進(jìn)行探測，結(jié)果如圖16所示。從中可以發(fā)現(xiàn)，akt作為pi3k下游分子，其活化的指標(biāo)（308位蘇氨酸與473位絲氨酸的磷酸化）在凝血酶及u46619刺激的rip3基因敲除血小板中顯著降低。此外，pi3k抑制劑在wt及rip3基因敲除血小板中均可降低凝血酶及u46619誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)。gsk3β（一種絲/蘇氨酸激酶）也可為akt的激酶活性所磷酸化。gsk3的磷酸化可負(fù)反饋調(diào)控依賴于pi3k/akt信號通路的致密顆粒釋放。與akt的活化相一致，gsk3β的磷酸化程度在rip3基因敲除血小板中也有所降低。

為了進(jìn)一步證實akt在rip3信號通路中的作用，在加入凝血酶或u46619刺激之前，向rip3基因敲除血小板中給予gsk3β拮抗劑sb216763預(yù)處理，該試劑可解救akt的功能受抑。sb216763可使u46619或凝血酶誘導(dǎo)的rip3基因敲除血小板聚集程度提高至與單獨應(yīng)用u46619或凝血酶刺激的wt血小板相若，結(jié)果如圖17所示。上述結(jié)果表明，rip3在血小板中是參與介導(dǎo)akt活化的上游分子。

除了pi3k/akt信號通路外，erk的活化也參與調(diào)節(jié)刺激劑誘導(dǎo)的血小板釋放。u46619或凝血酶誘導(dǎo)的erk磷酸化在rip3基因敲除血小板中減低，表明erk的活化亦受到rip3的調(diào)控。

（8）rip3缺失導(dǎo)致u46619及凝血酶誘導(dǎo)的整合素αiibβ3活化受抑：

由于整合素αiibβ3的活化為體外血小板聚集反應(yīng)所必需，因此探討rip3在整合素αiibβ3活化過程中的作用。u46619及凝血酶誘導(dǎo)的整合素αiibβ3活化的程度在rip3基因敲除血小板中減弱（如圖18所示）。低濃度凝血酶誘導(dǎo)的纖維蛋白原結(jié)合在rip3基因敲除血小板也顯著降低（如圖19所示）。以上結(jié)果表明，rip3參與刺激劑誘導(dǎo)的整合素αiibβ3的活化。

（9）rip3抑制劑抑制血小板聚集和小鼠體內(nèi)動脈血栓形成：

在37℃下，采用不同濃度的rip3抑制劑gsk'872或載體（dmso）孵育洗滌后的人血小板30min，然后采用u46619和凝血酶刺激，并用比濁集合度計監(jiān)測血小板聚集。rip3抑制劑與血小板作用后，可劑量依賴地抑制u46619和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，結(jié)果如圖20所示。

應(yīng)用fecl3損傷導(dǎo)致的腸系膜微動脈血栓模型來探索rip3抑制劑在體內(nèi)血栓形成過程中的作用，并在熒光顯微鏡下實時監(jiān)測血栓形成過程，結(jié)果如圖21所示。另外，rip3抑制劑作用的小鼠微動脈的阻塞時間較對照小鼠明顯延遲（如圖22所示，^**p<0.01）。以上結(jié)果表明，rip3可以作為抗血栓的新靶點，并為研究抗栓治療策略提供新思路。rip3抑制劑能夠抑制血栓形成，有望成為高效、特異、副作用小的新一代抗血栓藥物。