本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)：

阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)是一種革蘭氏陰性、周生鞭毛、能運動、無芽孢的兼性厭氧細菌，1980年前稱為非典型的產(chǎn)黃色素的陰溝腸桿菌，1980年后曾更名為阪崎腸桿菌，2008年重新分類命名，被劃歸于腸桿菌科克羅諾桿菌屬。阪崎克羅諾桿菌廣泛存在于自然界，是通過配方粉危害嬰幼兒健康的重要條件性致病菌，能引起嬰兒嚴(yán)重的臨床癥狀，如腦膿瘍，腦膜炎，壞死性小腸結(jié)腸炎和全身性敗血癥等，致死率高達40％-80％。新生嬰兒或早產(chǎn)兒都存在通過食用污染有阪崎克羅諾桿菌的嬰兒配方粉而感染阪崎克羅諾桿菌菌株的風(fēng)險。與其他食源性致病微生物相比，雖然阪崎克羅諾桿菌感染率不高，但對于特殊人群卻有著較高的致死率，并且該菌的宿主及傳播模型尚并不是十分清楚。因此對于該菌的預(yù)防和檢測尤為重要。

目前，國內(nèi)外針對阪崎克羅諾桿菌的檢測方法仍以常規(guī)培養(yǎng)方法作為標(biāo)準(zhǔn)，但檢測周期較長(達5-7天)，操作相對復(fù)雜，檢測效率較低，難以滿足現(xiàn)代社會對于食源性致病菌檢測過程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。隨后研究人員陸續(xù)開發(fā)出了PCR和熒光PCR技術(shù)的檢測手段，也被納入到我國的“奶粉中克羅諾桿菌的檢測方法”的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但是這兩種方法需要專門的檢測儀器，因此，并不適合廣泛應(yīng)用于基層檢測部門尤其是企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部進行的實時實地檢測。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發(fā)展起來的一種新型恒溫核酸擴增方法，該法針對靶序列的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內(nèi)引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。該技術(shù)具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應(yīng)結(jié)果，以及靈敏度高、特異性強、反應(yīng)時間短、操作便捷、成本低等優(yōu)點。

引物設(shè)計是LAMP技術(shù)中最為關(guān)鍵的一步，常規(guī)做法是將某待檢測生物的公認(rèn)的特異性基因?qū)隠AMP引物設(shè)計的在線網(wǎng)站(http://primerexplorer.jp/e)，設(shè)定相關(guān)參數(shù)生成引物組。也就是說，用戶首先必須確保該靶基因為待測物種的特異序列。以發(fā)明專利ZL201010614700.1和CN 101319249B為例，它們分別針對文獻報道的阪崎克羅諾桿菌的特異基因——OmpA基因和18S rDNA序列，采用LAMP技術(shù)進行阪崎克羅諾桿菌檢測。然而，所謂“公認(rèn)的特異性基因”往往基于滯后的知識，并未基于不斷增長的微生物基因組數(shù)據(jù)進行必要的更新，導(dǎo)致基于該靶基因序列獲得的引物在實際應(yīng)用中不一定能確保其特異性。本發(fā)明用表1展示了現(xiàn)有技術(shù)中存在的引物特異性不夠、通用性也不能確保的問題。也就是說，現(xiàn)有技術(shù)方法中所使用的阪崎克羅諾桿菌特異序列實際上并非阪崎克羅諾桿菌所特有，即，有可能將非阪崎克羅諾桿菌錯誤地認(rèn)定為阪崎克羅諾桿菌。類似的問題也存在于通用性的確認(rèn)。因此，行業(yè)內(nèi)亟需一種能夠確保特異性和通用性的阪崎克羅諾桿菌檢測方法，同時滿足基層檢測部門對快速、便捷的需求，能夠方便地在企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部開展實時實地檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有LAMP技術(shù)引物設(shè)計中存在的引物通用性和特異性不足的缺陷，充分利用目前公共數(shù)據(jù)資源中豐富的微生物基因組序列信息以及相應(yīng)的序列分析工具，設(shè)計用于特異性識別阪崎克羅諾桿菌的引物組，并在此基礎(chǔ)上形成高靈敏度、高特異性檢測試劑盒。本發(fā)明基于GenBank數(shù)據(jù)庫中的微生物基因組數(shù)據(jù)資源(截至2013年8月5日數(shù)據(jù))進行阪崎克羅諾桿菌LAMP引物的設(shè)計，提供了一種快速恒溫擴增檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物組及試劑盒。采用本發(fā)明的檢測方法檢測阪崎克羅諾桿菌，具有高靈敏度和高特異性，檢測時間短，結(jié)果判定簡單，操作便捷，成本低的優(yōu)點。

本發(fā)明提出一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌菌株的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)從待測樣品中提取基因組DNA；

(2)以所述基因組DNA為模板，以能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組為引物，在酶反應(yīng)體系下，進行恒溫擴增反應(yīng)；

(3)通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在阪崎克羅諾桿菌。

本發(fā)明恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌菌株的方法，從待測樣品中提取基因組DNA，以其為模板，以阪崎克羅諾桿菌特異性擴增引物組為引物，進行恒溫擴增反應(yīng)，然后，通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在阪崎克羅諾桿菌。其中，所述酶反應(yīng)體系包括但不限于DNA聚合酶反應(yīng)體系。

本發(fā)明中，所述阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列為GI號為156932229的阪崎克羅諾桿菌的1077500～1080076bp位序列。

本發(fā)明中，所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組為所述基因組(GI號為156932229)的1077500～1080076bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分。其中，所述阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列是指僅為阪崎克羅諾桿菌基因組所特有的，而其它微生物基因組所不包含的堿基序列。

其中，所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異堿基序列的引物組包括但不限于選自以下各引物組A～L之任意一組，或選自與該引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為45％及以上的引物組之任意一組。

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’(SEQ ID NO：2)；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’(SEQ ID NO：3)；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’(SEQ ID NO：4)；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-GTTCGATCTCCAGCTTACGAAG-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-GACATGAGTATCCACCAGGC-3’(SEQ ID NO：6)；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-GCGAGAGGTAACGAACGCAGTGGCGAGATTTCATATTGCCGC-3’(SEQ ID NO：7)；

下游內(nèi)引物BIP_B：5’-AGTTGCTGGTGAGCTTCGGCAGAAGTACAGGCCAGGGTAA-3’(SEQ ID NO：8)；

引物組C：

上游外引物F3_C：5’-GGATACATCCCATTGGCT-3’(SEQ ID NO：9)；

下游外引物B3_C：5’-CGTCTGGAGTTATTGCAATT-3’(SEQ ID NO：10)；

上游內(nèi)引物FIP_C：5’-AAGCAAGCAGAATACTCCCAGCTGCCAGGTCAATATTTGC-3’(SEQ ID NO：11)；

下游內(nèi)引物BIP_C：5’-CATCAACTTTTGTATCATGTGCCTGTCTCGATTTAAACACGCC-3’(SEQ ID NO：12)；

引物組D：

上游外引物F3_D：5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’(SEQ ID NO：13)；

下游外引物B3_D：5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’(SEQ ID NO：14)；

上游內(nèi)引物FIP_D：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’(SEQ ID NO：15)；

下游內(nèi)引物BIP_D：

5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’(SEQ ID NO：16)；

引物組E：

上游外引物F3_E：5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’(SEQ ID NO：17)；

下游外引物B3_E：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’(SEQ ID NO：18)；

上游內(nèi)引物FIP_E：5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’(SEQ ID NO：19)；

下游內(nèi)引物BIP_E：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’(SEQ ID NO：20)；

引物組F：

上游外引物F3_F：5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’(SEQ ID NO：21)；

下游外引物B3_F：5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’(SEQ ID NO：22)；

上游內(nèi)引物FIP_F：5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’(SEQ ID NO：23)；

下游內(nèi)引物BIP_F：5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’(SEQ ID NO：24)；

引物組G：

上游外引物F3_G：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’(SEQ ID NO：25)；

下游外引物B3_G：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’(SEQ ID NO：26)；

上游內(nèi)引物FIP_G：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’(SEQ ID NO：27)；

下游內(nèi)引物BIP_G：

5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’(SEQ ID NO：28)；

引物組H：

上游外引物F3_H：5’-AAGGCTTACTCTTGAACCA-3’(SEQ ID NO：29)；

下游外引物B3_H：5’-TGGGACTCCGAAACAATC-3’(SEQ ID NO：30)；

上游內(nèi)引物FIP_H：

5’-CACATATAACCAGGATGACCGTTATTAAGGTGTCAGGATAGTGG-3’(SEQ ID NO：31)；

下游內(nèi)引物BIP_H：5’-GCTAAGCGTCAATTTCGGGTGCGCTTATTTGAACCGTAT-3’(SEQ ID NO：32)；

引物組I：

上游外引物F3_I：5’-GGCAGAAACAGCCTGTTCA-3’(SEQ ID NO：33)；

下游外引物B3_I：5’-TGGCTGGGGAACTTTCTCAT-3’(SEQ ID NO：34)；

上游內(nèi)引物FIP_I：5’-CCTGTCCAGGCATTACGTGATGAGCATCTACACTGACAGGCAC-3’(SEQ ID NO：35)；

下游內(nèi)引物BIP_I：5’-TAAACGCGCCGCAGAGACTGTTATGCTGGGTGTTGGCG-3’(SEQ ID NO：36)；

引物組J：

上游外引物F3_J：5’-ATAAGGCCCATAAGTGCG-3’(SEQ ID NO：37)；

下游外引物B3_J：5’-AGGTATGGAAAAACAGTCAC-3’(SEQ ID NO：38)；

上游內(nèi)引物FIP_J：5’-TTGGCGTCCGTATAGCGTTACCAGTAAGAACGGTGGAT-3’(SEQ ID NO：39)；

下游內(nèi)引物BIP_J：5’-CATCACCATAACATTCATAACACCGTTTCTGGTCTTGGAGGAAT-3’(SEQ ID NO：40)；

引物組K：

上游外引物F3_K：5’-GTCCCACTTTGAGATGCA-3’(SEQ ID NO：41)；

下游外引物B3_K：5’-GACTATTCAACTGCCTGTT-3’(SEQ ID NO：42)；

上游內(nèi)引物FIP_K：5’-GCCCCTTTAGTCTCAGCAAATTTATCAGTGCTCCCTATCG-3’(SEQ ID NO：43)；

下游內(nèi)引物BIP_K：5’-CTGCAATTGTTTCAGGAATCAGTGGAAACGAGACAATTTCGGT-3’(SEQ ID NO：44)；

引物組L：

上游外引物F3_L：5’-TCATTGCCTGTAATTGCG-3’(SEQ ID NO：45)；

下游外引物B3_L：5’-TGAAAGATCTCATGCCAAC-3’(SEQ ID NO：46)；

上游內(nèi)引物FIP_L：5’-GTGCATTTCTGGCTCTCATTGTTTAGTAACGCAACGACG-3’(SEQ ID NO：47)；

下游內(nèi)引物BIP_L：

5’-CTCGTAAAATGTGTAAGCAAGATGGGGCTAAACGCAATACATTCA-3’(SEQ ID NO：48)。

本發(fā)明中，所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異堿基序列的引物組還可以包括與前述各引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為45％及以上的引物組，該引物組包括但不限于以下引物組M～R之任一引物組：

引物組M：

上游外引物F3_M：5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’(SEQ ID NO：49)；

下游外引物B3_M：5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’(SEQ ID NO：50)(與引物F3_C互補鏈5’-AGCCAATGGGATGTATCC-3’同源性50％)；

上游內(nèi)引物FIP_M：5’-GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’(SEQ ID NO：51)；

下游內(nèi)引物BIP_M：5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’(SEQ ID NO：52)；

引物組N：

上游外引物F3_N：5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’(SEQ ID NO：53)(與引物F3_D5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’同源性50％)；

下游外引物B3_N：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’(SEQ ID NO：54)；

上游內(nèi)引物FIP_N：5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’(SEQ ID NO：55)；

下游內(nèi)引物BIP_N：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’(SEQ ID NO：56)；

引物組O：

上游外引物F3_O：5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’(SEQ ID NO：57)(與引物F3_E5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’同源性50％)；

下游外引物B3_O：5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’(SEQ ID NO：58)；

上游內(nèi)引物FIP_O：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’(SEQ ID NO：59)；

下游內(nèi)引物BIP_O：

5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’(SEQ ID NO：60)；

引物組P：

上游外引物F3_P：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’(SEQ ID NO：61)(與引物B3_F的互補鏈5’-TTAAGCCGGTTAATTTGCTC-3’同源性45％)；

下游外引物B3_P：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’(SEQ ID NO：62)；

上游內(nèi)引物FIP_P：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’(SEQ ID NO：63)；

下游內(nèi)引物BIP_P：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’(SEQ ID NO：64)；

引物組Q：

上游外引物F3_Q：5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’(SEQ ID NO：65)；

下游外引物B3_Q：5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’(SEQ ID NO：66)(與引物F3_G的互補鏈5’-CACAACTGAGTGAGCAAATT-3’同源性50％)；

上游內(nèi)引物FIP_Q：5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’(SEQ ID NO：67)；

下游內(nèi)引物BIP_Q：5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’(SEQ ID NO：68)；

引物組R：

上游外引物F3_R：5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’(SEQ ID NO：69)；

下游外引物B3_R：5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’(SEQ ID NO：70)(與引物F3_H的互補鏈5’-TGGTTCAAGAGTAAGCCTT-3’同源性47％)；

上游內(nèi)引物FIP_R：5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’(SEQ ID NO：71)；

下游內(nèi)引物BIP_R：5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’(SEQ ID NO：72)。

本發(fā)明方法中，所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組可以包含或不包含環(huán)引物。所述環(huán)引物可以是一條或多條，包括引物L(fēng)F和/或LB。所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下引物組A’，D’，E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’之任意一組；或選自與所述引物組A’，D’，E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為45％及以上的引物組之任意一組：

引物組A’：

上游外引物F3_A：5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’；

下游外引物B3_A：5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_A：5’-ATGTCTTTCCCTGCATTTTCCA-3’(SEQ ID NO：73)；

引物組D’：

上游外引物F3_D：5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’；

下游外引物B3_D：5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_D：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_D：

5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_D：5’-GAGTTATTGCAATTACTCTCTCTCG-3’(SEQ ID NO：74)；

和/或，下游環(huán)引物L(fēng)B_D：5’-CTCAGCTTCTGCCTGTACAA-3’(SEQ ID NO：75)；

引物組E’：

上游外引物F3_E：5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’；

下游外引物B3_E：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_E：5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_E：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_E：5’-TCTCAAATTCAGCCATTCTTCCTG-3’(SEQ ID NO：76)；

引物組F’：

上游外引物F3_F：5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’；

下游外引物B3_F：5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_F：5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’；

下游內(nèi)引物BIP_F：5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_F：5’-AGTTGATGTTAACCGGGCAAT-3’(SEQ ID NO：77)；

引物組G’：

上游外引物F3_G：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；

下游外引物B3_G：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_G：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_G：

5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_G：5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’(SEQ ID NO：78)；

引物組M’：

上游外引物F3_M：5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’；

下游外引物B3_M：5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_M：GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’；

下游內(nèi)引物BIP_M：5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_M：5’-TACGTAGTTCTCCCATGTCCTGGA-3’(SEQ ID NO：79)；

引物組N’：

上游外引物F3_N：5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’；

下游外引物B3_N：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_N：5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_N：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_N：5’-CGCAAAGCGTCTGGAGTTATTGC-3’(SEQ ID NO：80)；

和/或，下游環(huán)引物L(fēng)B_N：5’-TTCAGCCATTCTTCCTGCAGCA-3’(SEQ ID NO：81)；

引物組O’：

上游外引物F3_O：5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’；

下游外引物B3_O：5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_O：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’；下游內(nèi)引物BIP_O：5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_O：5’-CTGGAGTTATTGCAATTACTCTCTC-3’(SEQ ID NO：82)；

引物組P’：

上游外引物F3_P：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；

下游外引物B3_P：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_P：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_P：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_P：5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’(SEQ ID NO：83)；

引物組Q’：

上游外引物F3_Q：5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’；

下游外引物B3_Q：5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_Q：5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_Q：5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_Q：5’-GCAGGAAGAATGGCTGAATTTG-3’(SEQ ID NO：84)；

和/或，下游環(huán)引物L(fēng)B_Q：5’-CTCTTGTGCCTGCAATAATGC-3’(SEQ ID NO：85)；

引物組R’：

上游外引物F3_R：5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’；

下游外引物B3_R：5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_R：5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’；

下游內(nèi)引物BIP_R：5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_R：5’-CAGTAAAGGTTGAATGACAGTGATG-3’(SEQ ID NO.86)。

在具體實施方案中，例如，上述引物組D’，N’或Q’中，可以只包含一條上游環(huán)引物，或只包含一條下游環(huán)引物，或同時包含一條上游環(huán)引物和一條下游環(huán)引物。

本發(fā)明方法中，在一具體實施方案(含環(huán)引物)中，所述恒溫擴增的酶反應(yīng)體系為：1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜堿。在另一具體實施方案(不含環(huán)引物)中，所述恒溫擴增的酶反應(yīng)體系為：1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜堿。環(huán)引物有助于提高反應(yīng)效率。例如，1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液可以選用1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液中的MgSO₄和酶反應(yīng)體系中的鎂離子Mg²⁺做合并處理。

本發(fā)明方法中，所述恒溫擴增反應(yīng)的反應(yīng)程序為①60～65℃孵育10～90min，優(yōu)選地為20～90min，優(yōu)選地為10～60min；②80℃終止反應(yīng)2～20min。本發(fā)明不限制通過其他適宜反應(yīng)程序來實現(xiàn)本發(fā)明檢測方法。

本發(fā)明方法中，檢測方法包括但不限于電泳檢測、濁度檢測或顯色檢測等。所述電泳檢測，優(yōu)選為凝膠電泳檢測法，可以是瓊脂糖凝膠，也可以是聚丙烯酰胺凝膠。電泳檢測結(jié)果中，如電泳圖呈現(xiàn)特征性階梯狀條帶，則待測樣品呈阪崎克羅諾桿菌陽性，含有阪崎克羅諾桿菌；如電泳圖不呈現(xiàn)特征性階梯狀條帶，則待測樣品呈阪崎克羅諾桿菌陰性。所述濁度檢測，是用肉眼觀察或濁度儀檢測濁度，檢測管出現(xiàn)混濁，則待測樣品呈阪崎克羅諾桿菌陽性，含有阪崎克羅諾桿菌；如未見混濁，則待測樣品為阪崎克羅諾桿菌陰性。也可以經(jīng)離心后肉眼觀察反應(yīng)管底是否有沉淀，若反應(yīng)管底有沉淀，則待測樣品呈阪崎克羅諾桿菌陽性，含有阪崎克羅諾桿菌；如反應(yīng)管底沒有沉淀，則待測樣品呈阪崎克羅諾桿菌陰性。

所述顯色檢測，是在反應(yīng)管中加入顯色劑，包括但不限于鈣黃綠素(50μM)或SYBR Green I(30-50×)，或羥基萘酚藍(即HNB，120-150μM)。當(dāng)采用鈣黃綠素或SYBR Green I作為顯色劑時，如反應(yīng)后顏色為橙色，則待測樣品為阪崎克羅諾桿菌陰性；如反應(yīng)后顏色為綠色，則待測樣品為阪崎克羅諾桿菌陽性，含有阪崎克羅諾桿菌。當(dāng)采用羥基萘酚藍作為顯色劑時，如反應(yīng)后顏色為紫羅蘭色，則待測樣品為阪崎克羅諾桿菌陰性；如反應(yīng)后顏色為天藍色，則待測樣品為阪崎克羅諾桿菌陽性。所述顯色檢測，除了上述通過肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果外，也可以通過檢測儀器進行實時或終點檢測反應(yīng)結(jié)果，通過合理的設(shè)定陰性反應(yīng)的閾值，當(dāng)待測樣品反應(yīng)的結(jié)果低于或等于該閾值時，則待測樣品為阪崎克羅諾桿菌陰性；當(dāng)待測樣品反應(yīng)的結(jié)果大于該閾值時，則待測樣品為阪崎克羅諾桿菌陽性。所述檢測儀器包括但不限于熒光分光光度計、熒光定量PCR儀、恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀和Genie II等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)等。

所述顯色檢測中，若采用鈣黃綠素或羥基萘酚藍作為顯色劑，可以在恒溫擴增反應(yīng)之前加入，也可以在恒溫擴增反應(yīng)完成之后加入，優(yōu)選地為恒溫擴增反應(yīng)之前加入，可以有效的減少反應(yīng)污染的可能性。若采用SYBR Green I作為顯色劑，則在恒溫擴增反應(yīng)完成之后加入。若采用鈣黃綠素作為顯色劑，則在酶反應(yīng)體系中加入50μM鈣黃綠素的同時，加入0.6-1mM[Mn²⁺]，例如，0.6-1mM的MnCl₂。

本發(fā)明還提供了用于恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌菌株的方法中的引物。所述引物包括能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異堿基序列的引物組，其包括但不限于，所述引物的序列為GI號為156932229的阪崎克羅諾桿菌基因組的1077500～1080076bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分。

其中，所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下各引物組之任意一組，或選自與所述各引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為45％及以上的任一引物組。其中，所述引物組包括但不限于以下引物組A～L之任意一個引物組。所述與前述引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為45％及以上的引物組包括但不限于以下引物組M～R之任意一個引物組。

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’；

下游外引物B3_A：5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-GTTCGATCTCCAGCTTACGAAG-3’；

下游外引物B3_B：5’-GACATGAGTATCCACCAGGC-3’；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-GCGAGAGGTAACGAACGCAGTGGCGAGATTTCATATTGCCGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_B：5’-AGTTGCTGGTGAGCTTCGGCAGAAGTACAGGCCAGGGTAA-3’；

引物組C：

上游外引物F3_C：5’-GGATACATCCCATTGGCT-3’；

下游外引物B3_C：5’-CGTCTGGAGTTATTGCAATT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_C：5’-AAGCAAGCAGAATACTCCCAGCTGCCAGGTCAATATTTGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_C：5’-CATCAACTTTTGTATCATGTGCCTGTCTCGATTTAAACACGCC-3’；

引物組D：

上游外引物F3_D：5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’；

下游外引物B3_D：5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_D：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_D：

5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；

引物組E：

上游外引物F3_E：5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’；

下游外引物B3_E：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_E：5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_E：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；

引物組F：

上游外引物F3_F：5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’；

下游外引物B3_F：5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_F：5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’；

下游內(nèi)引物BIP_F：5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’；

引物組G：

上游外引物F3_G：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；

下游外引物B3_G：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_G：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_G：

5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；

引物組H：

上游外引物F3_H：5’-AAGGCTTACTCTTGAACCA-3’；

下游外引物B3_H：5’-TGGGACTCCGAAACAATC-3’；

上游內(nèi)引物FIP_H：

5’-CACATATAACCAGGATGACCGTTATTAAGGTGTCAGGATAGTGG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_H：5’-GCTAAGCGTCAATTTCGGGTGCGCTTATTTGAACCGTAT-3’；

引物組I：

上游外引物F3_I：5’-GGCAGAAACAGCCTGTTCA-3’；

下游外引物B3_I：5’-TGGCTGGGGAACTTTCTCAT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_I：5’-CCTGTCCAGGCATTACGTGATGAGCATCTACACTGACAGGCAC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_I：5’-TAAACGCGCCGCAGAGACTGTTATGCTGGGTGTTGGCG-3’；

引物組J：

上游外引物F3_J：5’-ATAAGGCCCATAAGTGCG-3’；

下游外引物B3_J：5’-AGGTATGGAAAAACAGTCAC-3’；

上游內(nèi)引物FIP_J：5’-TTGGCGTCCGTATAGCGTTACCAGTAAGAACGGTGGAT-3’；

下游內(nèi)引物BIP_J：

5’-CATCACCATAACATTCATAACACCGTTTCTGGTCTTGGAGGAAT-3’；

引物組K：

上游外引物F3_K：5’-GTCCCACTTTGAGATGCA-3’；

下游外引物B3_K：5’-GACTATTCAACTGCCTGTT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_K：5’-GCCCCTTTAGTCTCAGCAAATTTATCAGTGCTCCCTATCG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_K：

5’-CTGCAATTGTTTCAGGAATCAGTGGAAACGAGACAATTTCGGT-3’；

引物組L：

上游外引物F3_L：5’-TCATTGCCTGTAATTGCG-3’；

下游外引物B3_L：5’-TGAAAGATCTCATGCCAAC-3’；

上游內(nèi)引物FIP_L：5’-GTGCATTTCTGGCTCTCATTGTTTAGTAACGCAACGACG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_L：

5’-CTCGTAAAATGTGTAAGCAAGATGGGGCTAAACGCAATACATTCA-3’；

引物組M：

上游外引物F3_M：5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’；

下游外引物B3_M：5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_M：5’-GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’；

下游內(nèi)引物BIP_M：5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’；

引物組N：

上游外引物F3_N：5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’；

下游外引物B3_N：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_N：5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_N：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；

引物組O：

上游外引物F3_O：5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’；

下游外引物B3_O：5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_O：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_O：

5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；

引物組P：

上游外引物F3_P：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；

下游外引物B3_P：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_P：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_P：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；

引物組Q：

上游外引物F3_Q：5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’；

下游外引物B3_Q：5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_Q：5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_Q：5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’；

引物組R：

上游外引物F3_R：5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’；

下游外引物B3_R：5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_R：5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’；

下游內(nèi)引物BIP_R：5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’。

本發(fā)明用于所述恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌方法中的引物中，所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組還可以包含或不包含一條或多條環(huán)引物；所述環(huán)引物為LF和/或LB。所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下引物組A’，D’，E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’之任意一組；或選自與所述引物組A’，D’，E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為45％及以上的引物組之任意一組：

引物組A’：

上游外引物F3_A：5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’；

下游外引物B3_A：5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_A：5’-ATGTCTTTCCCTGCATTTTCCA-3’；

引物組D’：

上游外引物F3_D：5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’；

下游外引物B3_D：5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_D：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_D：

5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_D：5’-GAGTTATTGCAATTACTCTCTCTCG-3’；

和/或，下游環(huán)引物L(fēng)B_D：5’-CTCAGCTTCTGCCTGTACAA-3’；

引物組E’：

上游外引物F3_E：5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’；

下游外引物B3_E：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_E：5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_E：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_E：5’-TCTCAAATTCAGCCATTCTTCCTG-3’；

引物組F’：

上游外引物F3_F：5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’；

下游外引物B3_F：5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_F：5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’；

下游內(nèi)引物BIP_F：5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_F：5’-AGTTGATGTTAACCGGGCAAT-3’；

引物組G’：

上游外引物F3_G：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；

下游外引物B3_G：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_G：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_G：

5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_G：5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’；

引物組M’：

上游外引物F3_M：5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’；

下游外引物B3_M：5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_M：5’-GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’；

下游內(nèi)引物BIP_M：5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_M：5’-TACGTAGTTCTCCCATGTCCTGGA-3’；

引物組N’：

上游外引物F3_N：5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’；

下游外引物B3_N：5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_N：5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_N：5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_N：5’-CGCAAAGCGTCTGGAGTTATTGC-3’；

和/或，下游環(huán)引物L(fēng)B_N：5’-TTCAGCCATTCTTCCTGCAGCA-3’；

引物組O’：

上游外引物F3_O：5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’；

下游外引物B3_O：5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_O：5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_O：

5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_O：5’-CTGGAGTTATTGCAATTACTCTCTC-3’；

引物組P’：

上游外引物F3_P：5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’；

下游外引物B3_P：5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_P：5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_P：5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_P：5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’；

引物組Q’：

上游外引物F3_Q：5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’；

下游外引物B3_Q：5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_Q：5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’；

下游內(nèi)引物BIP_Q：5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_Q：5’-GCAGGAAGAATGGCTGAATTTG-3’；

和/或，下游環(huán)引物L(fēng)B_Q：5’-CTCTTGTGCCTGCAATAATGC-3’；

引物組R’：

上游外引物F3_R：5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’；

下游外引物B3_R：5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_R：5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’；

下游內(nèi)引物BIP_R：5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’；

下游環(huán)引物L(fēng)B_R：5’-CAGTAAAGGTTGAATGACAGTGATG-3’。

在具體實施方案中，上述引物組D’，N’或Q’中，可以只包含一條上游環(huán)引物，或只包含一條下游環(huán)引物，或同時包含一條上游環(huán)引物和一條下游環(huán)引物。在一具體實施方案中，所述引物分別為FIP、BIP、F3、B3、LF和LB所示的引物或與前述引物序列或其互補鏈序列中單條引物同源性為45％及以上的引物。

本發(fā)明還提供一種用于上述恒溫檢測克阪崎羅諾桿菌菌株方法中的試劑盒，其包括所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異堿基序列的引物組。本發(fā)明試劑盒中，所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組，包括但不限于以基因組(GI號:156932229)的1077500～1080076bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分作為所述引物序列；所述引物包括但不限于所述引物組A、引物組B、……、引物組K、引物組L之任意一個引物組等。還包括但不限于以與前述引物序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為45％及以上的引物組作為引物；包括但不限于引物組M、引物組N、……、引物組Q、引物組R等。

本發(fā)明試劑盒中，所述能擴增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組可以包含或不包含一條或多條環(huán)引物；環(huán)引物作為可選組分。所述環(huán)引物為LF和/或LB。包含環(huán)引物L(fēng)F和/或LB的引物組包括但不限于引物組A’、D’、E’、F’、G’、M’、N’、O’、P’、Q’、R’等。在具體實施方案中，本發(fā)明試劑盒中可以包含0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB環(huán)引物。在一具體實施方案中，引物組的序列分別為FIP、BIP、F3、B3、LF和LB所示的引物、或與前述序列或其互補鏈序列單條引物同源性為45％及以上的引物。

本發(fā)明試劑盒中，還包括Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP溶液、Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)和甜菜堿中的一種或多種。在一具體實施方案中，本發(fā)明試劑盒酶反應(yīng)體系包含1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L的甜菜堿。例如，1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液可以選用1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液中的MgSO₄和酶反應(yīng)體系中的鎂離子Mg²⁺做合并處理。

本發(fā)明試劑盒中，還包含陽性對照模板。在一具體實施方案中，所述陽性對照模板包括但不限于阪崎克羅諾桿菌的全基因組DNA、部分基因組DNA，或包含阪崎克羅諾桿菌全基因組DNA或部分基因組DNA的載體。

本發(fā)明試劑盒中，還包含陰性對照模板，所述陰性對照模板包括但不限于雙蒸水。

本發(fā)明試劑盒中，還包含顯色劑，顯色劑包括但不限于鈣黃綠素，SYBR Green I或羥基萘酚藍。當(dāng)顯色劑為鈣黃綠素時，試劑盒中還包含[Mn²⁺]，例如，MnCl₂。

本發(fā)明試劑盒中，還包含雙蒸水。

本發(fā)明試劑盒中，還包含核酸抽提試劑。

本發(fā)明還提出了一種載體，所述載體包含選自引物組A～L、M～R、A’，D’，E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’之任意一組引物。該載體由于包含了具有阪崎克羅諾桿菌特異性的DNA序列，因此可應(yīng)用于微生物分類學(xué)、比較基因組學(xué)、進化等研究領(lǐng)域，以及微生物檢測等應(yīng)用領(lǐng)域。該載體可以是但不限于質(zhì)粒載體(如pBR322、pUC18、pUC19、pBluescript M13、Ti質(zhì)粒等)、病毒載體(如λ噬菌體等)和人造染色體載體(如細菌人造染色體BAC、酵母人造染色體YAC等)。例如，包含引物組A之任意一條引物的載體pBR322-A、包含引物組B之任意一條引物的載體pBR322-B、……包含引物組R’之任意一條引物的載體pBR322-R’等。包含引物組A之任意一條引物的載體λ噬菌體-A、包含引物組B之任意一條引物的載體λ噬菌體-B、……包含引物組R’之任意一條引物的載體λ噬菌體-R’等。

本發(fā)明還提出了選自引物組A～L、M～R、A’，D’，E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’之任意一組的引物在恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述試劑盒在恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述載體在恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明為食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域提供了一種簡單快速靈敏的檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物/引物組、檢測試劑/試劑盒，對我國的食品安全具有較大意義。本發(fā)明有益效果包括：采用本發(fā)明阪崎克羅諾桿菌檢測方法具有特異性強、靈敏度高、檢測時間短、結(jié)果判定簡單、操作便捷、成本低等優(yōu)點。與目前常用檢測方法相比，本發(fā)明采用的恒溫擴增法，可以在恒溫條件下進行，只需采用簡單的恒溫裝置，不需要PCR實驗中的昂貴儀器，不需要對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測等步驟，因而，非常適于廣泛應(yīng)用于社會各界包括基層食品安全檢測部門推廣使用，即使在分子生物學(xué)專業(yè)知識和技能基礎(chǔ)相對不足的環(huán)境下也可充分應(yīng)用?；诒绢I(lǐng)域常識可將上述各優(yōu)選條件進行任意組合，均屬本發(fā)明保護范圍。

附圖說明

圖1表明本發(fā)明實施例7阪崎克羅諾桿菌恒溫檢測方法的特異性。

圖2表明本發(fā)明實施例8阪崎克羅諾桿菌檢測方法的靈敏度。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實施例1-6阪崎克羅諾桿菌恒溫反應(yīng)體系和檢測方法

按照以下(1)～(3)步驟進行檢測：

(1)基因組DNA的提取

用于檢測的阪崎克羅諾桿菌菌種來源中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號CICC21560(＝ATCC29544)。取1mL細菌培養(yǎng)物使用北京天根生物工程公司的細菌核酸提取試劑盒提取基因組DNA，DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.8，濃度為288ng/μL。

(2)以待測阪崎克羅諾桿菌基因組DNA為模板，分別采用自配的試劑盒(見表2，表3)，并按照表3中所述條件，配制反應(yīng)體系，以阪崎克羅諾桿菌特異性擴增引物組為引物，進行恒溫擴增反應(yīng)。實施例1～6中的引物分別為引物組A，A’，D’(2條環(huán)引物)，D’(1條環(huán)引物)，P’，R。

(3)按照表3中所述條件，通過電泳檢測、濁度檢測或顯色檢測，進行擴增結(jié)果確認(rèn)。由表3可以看出，本發(fā)明檢測方法及其所采用的引物組及反應(yīng)體系能夠很好地對阪崎克羅諾桿菌特異性片段進行擴增并得到檢測結(jié)果。此外，當(dāng)采用檢測儀進行檢測時，縮短反應(yīng)時間至10min時也有很好的檢測效果(如實施例6)。因此，本發(fā)明可以應(yīng)用于檢測樣本中是否含有阪崎克羅諾桿菌。

按上述實施例方法，分別用引物組B～L，引物組M～Q，引物組E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，Q’，R’，也能夠很好地對阪崎克羅諾桿菌特異性片段進行擴增并得到檢測結(jié)果。

實施例7阪崎克羅諾桿菌特異性檢測

收集非阪崎克羅諾桿菌28株(表4和圖1中的1～22，24～29)，將這些菌株與阪崎克羅諾桿菌菌株(表4和圖1中的23)分別進行培養(yǎng)，取1mL菌液，采用試劑盒IA，提取細菌DNA，并參照實施例1的反應(yīng)體系和條件，分別進行LAMP擴增和加入顯色劑觀察。

其檢測結(jié)果如表4和圖1所示，圖1中，1-22分別為金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌金黃亞種、表皮葡萄球菌、馬紅球菌、蠟樣芽孢桿菌、蕈樣芽孢桿菌、單核增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、腸沙門氏菌腸亞種、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌(含肉毒梭菌A型基因)、致病性大腸埃希氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌，24-29分別為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、弗氏弧菌和霍亂弧菌，NTC：陰性對照，23：阪崎克羅諾桿菌。圖1中，僅有阪崎克羅諾桿菌菌株擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物呈現(xiàn)為亮綠色，為陽性結(jié)果，如第23號管所示。而其他非阪崎克羅諾桿菌菌株及陰性對照擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物均呈現(xiàn)為橙色，為陰性結(jié)果，如第1～22號管以及NTC陰性對照管所示。

由圖1和表4結(jié)果可以看出，本發(fā)明檢測試劑盒及檢測方法具有良好的阪崎克羅諾桿菌菌株特異性，即，只有阪崎克羅諾桿菌菌株擴增陽性，其他非阪崎克羅諾桿菌菌株為陰性。

配制檢測試劑盒，試劑盒中采用的引物分別為引物組B～L，引物組M～R，引物組A’，D’，E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’，按上述特異性檢測方法，分別得到同樣的檢測結(jié)果，即，非阪崎克羅諾桿菌菌株及陰性對照擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物為陰性結(jié)果，阪崎克羅諾桿菌菌株擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物為陽性結(jié)果。

此外，按照表1中所述方法，分別對引物組A～L，引物組M～R，引物組A’，D’，E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’的特異性進行理論分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各條引物最多允許2個錯配的情況下，各引物組各條引物不能同時比對到非阪崎克羅諾桿菌上，表明各引物組的特異性均較好。

實施例8靈敏度檢測

按實施例2的方法提取細菌CICC 21560的DNA，采用試劑盒IIB，并按照50ng、5ng、500pg、50pg、5pg、500fg、50fg DNA梯度加入反應(yīng)體系，其他反應(yīng)條件參照表3實施例2的方法分別進行LAMP擴增和加入顯色劑觀察。如圖2所示，1-7分別為50ng、5ng、500pg、50pg、5pg、500fg和50fg，NTC：陰性對照。圖2中50ng、5ng、500pg、50pg、5pg、500fg處理的反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)為亮綠色，為陽性結(jié)果，50fg處理和陰性對照的反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)為橙色，為陰性結(jié)果。檢測結(jié)果表明，每個反應(yīng)管中最低含500fg(約相當(dāng)于100個細菌)的DNA時仍可被檢出，靈敏度較高。

按上述檢測方法，其他步驟及條件同上，分別用引物組A～L，引物組M～R，引物組D’，E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’，每個反應(yīng)管中低至5pg～500fg的DNA仍可被檢出，檢測靈敏度較高。

實施例9通用性檢測

按照表1中所述方法，分別對引物組A～L，引物組M～R，引物組A’，D’，E’，F(xiàn)’，G’，M’，N’，O’，P’，Q’，R’的通用性進行理論分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各引物組的引物區(qū)域與三株阪崎克羅諾桿菌(GI號分別為156932229，449306535和389839000)的基因組序列完全匹配，理論上可以用于上述三株阪崎克羅諾桿菌菌株的檢測，表明各引物組的通用性均較好。

表1阪崎克羅諾桿菌的現(xiàn)有檢測方法中引物的通用性和特異性分析

注：a)將專利中引物F3和B3間的序列與阪崎克羅諾桿菌的三個基因組(GI號分別為156932229、449306535和389839000)進行Bowtie比對，確定檢測區(qū)域在GI號156932229基因組中的位置(星號*表示引物F3和B3間的序列可比對到GI號156932229基因組中的7個重復(fù)區(qū)域，本表中僅列出1個區(qū)域)。專利ZL201310287426.5中四套引物的擴增區(qū)域無法定位，文本中也沒有給出擴增靶基因為何種基因。b)將檢測區(qū)域序列在公共數(shù)據(jù)庫資源中進行Blast比對，引物區(qū)域完全匹配為通用性好。c)將檢測區(qū)域序列在公共數(shù)據(jù)庫資源中進行Blast比對，引物區(qū)域匹配程度越高，特異性越差。

表2恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒種類及主要組成成分

表3實施例1-6本發(fā)明恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法中的反應(yīng)條件及檢測結(jié)果

表4試驗所用菌株及檢測結(jié)果

注：a)CGMCC：中國普通微生物菌種保藏中心，CICC：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CMCC：中國醫(yī)學(xué)細菌菌種保藏管理中心。b)+：陽性結(jié)果，-：陰性結(jié)果。