1.一種快速恒溫檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)從待測(cè)樣品中提取基因組DNA;
(2)以所述基因組DNA為模板,以能擴(kuò)增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組作為引物,在酶反應(yīng)體系下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng);
(3)通過(guò)判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性,確定待測(cè)樣品中是否存在阪崎克羅諾桿菌;
其中,所述阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列為GI號(hào)為156932229的阪崎克羅諾桿菌基因組的1077500~1080076bp位序列。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述能擴(kuò)增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組序列為GI號(hào)為156932229的阪崎克羅諾桿菌基因組1077500~1080076bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈的一部分。
3.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述能擴(kuò)增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下引物組A~L之任意一組;或選自與所述引物組A~L序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為45%及以上的引物組之任意一組;
引物組A:
上游外引物F3_A:5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’(SEQ ID NO:1);
下游外引物B3_A:5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’(SEQ ID NO:2);
上游內(nèi)引物FIP_A:5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’(SEQ ID NO:3);
下游內(nèi)引物BIP_A:5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’(SEQ ID NO:4);
引物組B:
上游外引物F3_B:5’-GTTCGATCTCCAGCTTACGAAG-3’(SEQ ID NO:5);
下游外引物B3_B:5’-GACATGAGTATCCACCAGGC-3’(SEQ ID NO:6);
上游內(nèi)引物FIP_B:5’-GCGAGAGGTAACGAACGCAGTGGCGAGATTTCATATTGCCGC-3’(SEQ ID NO:7);
下游內(nèi)引物BIP_B:5’-AGTTGCTGGTGAGCTTCGGCAGAAGTACAGGCCAGGGTAA-3’(SEQ ID NO:8);
引物組C:
上游外引物F3_C:5’-GGATACATCCCATTGGCT-3’(SEQ ID NO:9);
下游外引物B3_C:5’-CGTCTGGAGTTATTGCAATT-3’(SEQ ID NO:10);
上游內(nèi)引物FIP_C:5’-AAGCAAGCAGAATACTCCCAGCTGCCAGGTCAATATTTGC-3’(SEQ ID NO:11);
下游內(nèi)引物BIP_C:5’-CATCAACTTTTGTATCATGTGCCTGTCTCGATTTAAACACGCC-3’(SEQ ID NO:12);
引物組D:
上游外引物F3_D:5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’(SEQ ID NO:13);
下游外引物B3_D:5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’(SEQ ID NO:14);
上游內(nèi)引物FIP_D:5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’(SEQ ID NO:15);
下游內(nèi)引物BIP_D:
5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’(SEQ ID NO:16);
引物組E:
上游外引物F3_E:5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’(SEQ ID NO:17);
下游外引物B3_E:5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’(SEQ ID NO:18);
上游內(nèi)引物FIP_E:5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’(SEQ ID NO:19);
下游內(nèi)引物BIP_E:5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’(SEQ ID NO:20);
引物組F:
上游外引物F3_F:5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’(SEQ ID NO:21);
下游外引物B3_F:5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’(SEQ ID NO:22);
上游內(nèi)引物FIP_F:5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’(SEQ ID NO:23);
下游內(nèi)引物BIP_F:5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’(SEQ ID NO:24);
引物組G:
上游外引物F3_G:5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’(SEQ ID NO:25);
下游外引物B3_G:5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’(SEQ ID NO:26);
上游內(nèi)引物FIP_G:5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’(SEQ ID NO:27);
下游內(nèi)引物BIP_G:
5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’(SEQ ID NO:28);
引物組H:
上游外引物F3_H:5’-AAGGCTTACTCTTGAACCA-3’(SEQ ID NO:29);
下游外引物B3_H:5’-TGGGACTCCGAAACAATC-3’(SEQ ID NO:30);
上游內(nèi)引物FIP_H:
5’-CACATATAACCAGGATGACCGTTATTAAGGTGTCAGGATAGTGG-3’(SEQ ID NO:31);
下游內(nèi)引物BIP_H:5’-GCTAAGCGTCAATTTCGGGTGCGCTTATTTGAACCGTAT-3’(SEQ ID NO:32);
引物組I:
上游外引物F3_I:5’-GGCAGAAACAGCCTGTTCA-3’(SEQ ID NO:33);
下游外引物B3_I:5’-TGGCTGGGGAACTTTCTCAT-3’(SEQ ID NO:34);
上游內(nèi)引物FIP_I:5’-CCTGTCCAGGCATTACGTGATGAGCATCTACACTGACAGGCAC-3’(SEQ ID NO:35);
下游內(nèi)引物BIP_I:5’-TAAACGCGCCGCAGAGACTGTTATGCTGGGTGTTGGCG-3’(SEQ ID NO:36);
引物組J:
上游外引物F3_J:5’-ATAAGGCCCATAAGTGCG-3’(SEQ ID NO:37);
下游外引物B3_J:5’-AGGTATGGAAAAACAGTCAC-3’(SEQ ID NO:38);
上游內(nèi)引物FIP_J:5’-TTGGCGTCCGTATAGCGTTACCAGTAAGAACGGTGGAT-3’(SEQ ID NO:39);
下游內(nèi)引物BIP_J:5’-CATCACCATAACATTCATAACACCGTTTCTGGTCTTGGAGGAAT-3’(SEQ ID NO:40);
引物組K:
上游外引物F3_K:5’-GTCCCACTTTGAGATGCA-3’(SEQ ID NO:41);
下游外引物B3_K:5’-GACTATTCAACTGCCTGTT-3’(SEQ ID NO:42);
上游內(nèi)引物FIP_K:5’-GCCCCTTTAGTCTCAGCAAATTTATCAGTGCTCCCTATCG-3’(SEQ ID NO:43);
下游內(nèi)引物BIP_K:5’-CTGCAATTGTTTCAGGAATCAGTGGAAACGAGACAATTTCGGT-3’(SEQ ID NO:44);
引物組L:
上游外引物F3_L:5’-TCATTGCCTGTAATTGCG-3’(SEQ ID NO:45);
下游外引物B3_L:5’-TGAAAGATCTCATGCCAAC-3’(SEQ ID NO:46);
上游內(nèi)引物FIP_L:5’-GTGCATTTCTGGCTCTCATTGTTTAGTAACGCAACGACG-3’(SEQ ID NO:47);
下游內(nèi)引物BIP_L:
5’-CTCGTAAAATGTGTAAGCAAGATGGGGCTAAACGCAATACATTCA-3’(SEQ ID NO:48)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,與所述引物組A~L序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為45%及以上的引物組包括以下引物組M~R之任意一組:
引物組M:
上游外引物F3_M:5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’(SEQ ID NO:49);
下游外引物B3_M:5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’(SEQ ID NO:50);
上游內(nèi)引物FIP_M:5’-GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’(SEQ ID NO:51);
下游內(nèi)引物BIP_M:5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’(SEQ ID NO:52);
引物組N:
上游外引物F3_N:5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’(SEQ ID NO:53);
下游外引物B3_N:5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’(SEQ ID NO:54);
上游內(nèi)引物FIP_N:5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’(SEQ ID NO:55);
下游內(nèi)引物BIP_N:5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’(SEQ ID NO:56);
引物組O:
上游外引物F3_O:5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’(SEQ ID NO:57);
下游外引物B3_O:5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’(SEQ ID NO:58);
上游內(nèi)引物FIP_O:5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’(SEQ ID NO:59);
下游內(nèi)引物BIP_O:
5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’(SEQ ID NO:60);
引物組P:
上游外引物F3_P:5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’(SEQ ID NO:61);
下游外引物B3_P:5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’(SEQ ID NO:62);
上游內(nèi)引物FIP_P:5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’(SEQ ID NO:63);
下游內(nèi)引物BIP_P:5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’(SEQ ID NO:64);
引物組Q:
上游外引物F3_Q:5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’(SEQ ID NO:65);
下游外引物B3_Q:5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’(SEQ ID NO:66);
上游內(nèi)引物FIP_Q:5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’(SEQ ID NO:67);
下游內(nèi)引物BIP_Q:5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’(SEQ ID NO:68);
引物組R:
上游外引物F3_R:5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’(SEQ ID NO:69);
下游外引物B3_R:5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’(SEQ ID NO:70);
上游內(nèi)引物FIP_R:5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’(SEQ ID NO:71);
下游內(nèi)引物BIP_R:5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’(SEQ ID NO:72)。
5.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述能擴(kuò)增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組還包含一條或多條環(huán)引物;所述環(huán)引物為L(zhǎng)F和/或LB。
6.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述能擴(kuò)增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下引物組A’,D’,E’,F(xiàn)’,G’,M’,N’,O’,P’,Q’,R’之任意一組;或選自與所述引物組A’,D’,E’,F(xiàn)’,G’,M’,N’,O’,P’,Q’,R’序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為45%及以上的引物組之任意一組:
引物組A’:
上游外引物F3_A:5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’;
下游外引物B3_A:5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_A:5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’;
下游內(nèi)引物BIP_A:5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’;
下游環(huán)引物L(fēng)B_A:5’-ATGTCTTTCCCTGCATTTTCCA-3’(SEQ ID NO:73);
引物組D’:
上游外引物F3_D:5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’;
下游外引物B3_D:5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_D:5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’;
下游內(nèi)引物BIP_D:
5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_D:5’-GAGTTATTGCAATTACTCTCTCTCG-3’(SEQ ID NO:74);
和/或,下游環(huán)引物L(fēng)B_D:5’-CTCAGCTTCTGCCTGTACAA-3’(SEQ ID NO:75);
引物組E’:
上游外引物F3_E:5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’;
下游外引物B3_E:5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_E:5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’;
下游內(nèi)引物BIP_E:5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’;
下游環(huán)引物L(fēng)B_E:5’-TCTCAAATTCAGCCATTCTTCCTG-3’(SEQ ID NO:76);
引物組F’:
上游外引物F3_F:5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’;
下游外引物B3_F:5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_F:5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’;
下游內(nèi)引物BIP_F:5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_F:5’-AGTTGATGTTAACCGGGCAAT-3’(SEQ ID NO:77);
引物組G’:
上游外引物F3_G:5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’;
下游外引物B3_G:5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_G:5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_G:
5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_G:5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’(SEQ ID NO:78);
引物組M’:
上游外引物F3_M:5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’;
下游外引物B3_M:5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_M:5’-GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’;
下游內(nèi)引物BIP_M:5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’;
下游環(huán)引物L(fēng)B_M:5’-TACGTAGTTCTCCCATGTCCTGGA-3’(SEQ ID NO:79);
引物組N’:
上游外引物F3_N:5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’;
下游外引物B3_N:5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_N:5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’;
下游內(nèi)引物BIP_N:5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_N:5’-CGCAAAGCGTCTGGAGTTATTGC-3’(SEQ ID NO:80);
和/或,下游環(huán)引物L(fēng)B_N:5’-TTCAGCCATTCTTCCTGCAGCA-3’(SEQ ID NO:81);
引物組O’:
上游外引物F3_O:5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’;
下游外引物B3_O:5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_O:5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’;
下游內(nèi)引物BIP_O:
5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_O:5’-CTGGAGTTATTGCAATTACTCTCTC-3’(SEQ ID NO:82);
引物組P’:
上游外引物F3_P:5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’;
下游外引物B3_P:5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_P:5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_P:5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_P:5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’(SEQ ID NO:83);
引物組Q’:
上游外引物F3_Q:5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’;
下游外引物B3_Q:5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_Q:5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_Q:5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_Q:5’-GCAGGAAGAATGGCTGAATTTG-3’(SEQ ID NO:84);
和/或,下游環(huán)引物L(fēng)B_Q:5’-CTCTTGTGCCTGCAATAATGC-3’(SEQ ID NO:85);
引物組R’:
上游外引物F3_R:5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’;
下游外引物B3_R:5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_R:5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’;
下游內(nèi)引物BIP_R:5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’;
下游環(huán)引物L(fēng)B_R:5’-CAGTAAAGGTTGAATGACAGTGATG-3’(SEQ ID NO.86)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(2)中,所述酶反應(yīng)體系包括:1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液,2-9mmol/L Mg2+,1.0-1.6mmol/L dNTP,0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物,0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物,0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶,0-1.5mol/L的甜菜堿,包括或不包括0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB引物。
8.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋孩?0~65℃孵育10~90min;②80℃終止反應(yīng)2~20min。
9.用于如權(quán)利要求1所述恒溫檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌方法中的引物,其特征在于,所述引物包括能擴(kuò)增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組,其序列為GI號(hào)為156932229的阪崎克羅諾桿菌基因組的1077500~1080076bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈的一部分。
10.如權(quán)利要求9所述的引物,其特征在于,所述能擴(kuò)增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下引物組A~L之任意一組;或選自與所述引物組A~L序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為45%及以上的引物組之任意一組;
引物組A:
上游外引物F3_A:5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’;
下游外引物B3_A:5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_A:5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’;
下游內(nèi)引物BIP_A:5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’;
引物組B:
上游外引物F3_B:5’-GTTCGATCTCCAGCTTACGAAG-3’;
下游外引物B3_B:5’-GACATGAGTATCCACCAGGC-3’;
上游內(nèi)引物FIP_B:5’-GCGAGAGGTAACGAACGCAGTGGCGAGATTTCATATTGCCGC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_B:5’-AGTTGCTGGTGAGCTTCGGCAGAAGTACAGGCCAGGGTAA-3’;
引物組C:
上游外引物F3_C:5’-GGATACATCCCATTGGCT-3’;
下游外引物B3_C:5’-CGTCTGGAGTTATTGCAATT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_C:5’-AAGCAAGCAGAATACTCCCAGCTGCCAGGTCAATATTTGC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_C:5’-CATCAACTTTTGTATCATGTGCCTGTCTCGATTTAAACACGCC-3’;
引物組D:
上游外引物F3_D:5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’;
下游外引物B3_D:5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_D:5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’;
下游內(nèi)引物BIP_D:
5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’;
引物組E:
上游外引物F3_E:5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’;
下游外引物B3_E:5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_E:5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’;
下游內(nèi)引物BIP_E:5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’;
引物組F:
上游外引物F3_F:5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’;
下游外引物B3_F:5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_F:5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’;
下游內(nèi)引物BIP_F:5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’;
引物組G:
上游外引物F3_G:5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’;
下游外引物B3_G:5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_G:5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_G:
5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’;
引物組H:
上游外引物F3_H:5’-AAGGCTTACTCTTGAACCA-3’;
下游外引物B3_H:5’-TGGGACTCCGAAACAATC-3’;
上游內(nèi)引物FIP_H:
5’-CACATATAACCAGGATGACCGTTATTAAGGTGTCAGGATAGTGG-3’;
下游內(nèi)引物BIP_H:5’-GCTAAGCGTCAATTTCGGGTGCGCTTATTTGAACCGTAT-3’;
引物組I:
上游外引物F3_I:5’-GGCAGAAACAGCCTGTTCA-3’;
下游外引物B3_I:5’-TGGCTGGGGAACTTTCTCAT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_I:5’-CCTGTCCAGGCATTACGTGATGAGCATCTACACTGACAGGCAC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_I:5’-TAAACGCGCCGCAGAGACTGTTATGCTGGGTGTTGGCG-3’;
引物組J:
上游外引物F3_J:5’-ATAAGGCCCATAAGTGCG-3’;
下游外引物B3_J:5’-AGGTATGGAAAAACAGTCAC-3’;
上游內(nèi)引物FIP_J:5’-TTGGCGTCCGTATAGCGTTACCAGTAAGAACGGTGGAT-3’;
下游內(nèi)引物BIP_J:
5’-CATCACCATAACATTCATAACACCGTTTCTGGTCTTGGAGGAAT-3’;
引物組K:
上游外引物F3_K:5’-GTCCCACTTTGAGATGCA-3’;
下游外引物B3_K:5’-GACTATTCAACTGCCTGTT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_K:5’-GCCCCTTTAGTCTCAGCAAATTTATCAGTGCTCCCTATCG-3’;
下游內(nèi)引物BIP_K:
5’-CTGCAATTGTTTCAGGAATCAGTGGAAACGAGACAATTTCGGT-3’;
引物組L:
上游外引物F3_L:5’-TCATTGCCTGTAATTGCG-3’;
下游外引物B3_L:5’-TGAAAGATCTCATGCCAAC-3’;
上游內(nèi)引物FIP_L:5’-GTGCATTTCTGGCTCTCATTGTTTAGTAACGCAACGACG-3’;
下游內(nèi)引物BIP_L:
5’-CTCGTAAAATGTGTAAGCAAGATGGGGCTAAACGCAATACATTCA-3’。
11.如權(quán)利要求10所述的引物,其特征在于,與所述引物組A~L序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為45%及以上的引物組包括以下引物組M~R之任意一組:
引物組M:
上游外引物F3_M:5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’;
下游外引物B3_M:5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_M:5’-GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’;
下游內(nèi)引物BIP_M:5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’;
引物組N:
上游外引物F3_N:5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’;
下游外引物B3_N:5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_N:5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGAC-GGCGTGTTTAAATCGAGA-3’;
下游內(nèi)引物BIP_N:5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTA-ATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’;
引物組O:
上游外引物F3_O:5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’;
下游外引物B3_O:5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_O:5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’;
下游內(nèi)引物BIP_O:
5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’;
引物組P:
上游外引物F3_P:5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’;
下游外引物B3_P:5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_P:5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_P:5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’;
引物組Q:
上游外引物F3_Q:5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’;
下游外引物B3_Q:5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_Q:5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_Q:5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’;
引物組R:
上游外引物F3_R:5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’;
下游外引物B3_R:5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_R:5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’;
下游內(nèi)引物BIP_R:5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’。
12.如權(quán)利要求9所述的引物,其特征在于,所述能擴(kuò)增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組還包含一條或多條環(huán)引物;所述環(huán)引物為L(zhǎng)F和/或LB。
13.如權(quán)利要求12所述的引物,其特征在于,所述能擴(kuò)增阪崎克羅諾桿菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下引物組A’,D’,E’,F(xiàn)’,G’,M’,N’,O’,P’,Q’,R’之任意一組;或選自與所述引物組A’,D’,E’,F(xiàn)’,G’,M’,N’,O’,P’,Q’,R’序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為45%及以上的引物組之任意一組:
引物組A’:
上游外引物F3_A:5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’;
下游外引物B3_A:5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_A:5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’;
下游內(nèi)引物BIP_A:5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’;
下游環(huán)引物L(fēng)B_A:5’-ATGTCTTTCCCTGCATTTTCCA-3’;
引物組D’:
上游外引物F3_D:5’-ATCATGTGCCTGAAGTGA-3’;
下游外引物B3_D:5’-TTAACCGGGCAATGATTG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_D:5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCGTTGCTTCTATTGGCGTG-3’;
下游內(nèi)引物BIP_D:
5’-GTTCAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_D:5’-GAGTTATTGCAATTACTCTCTCTCG-3’;
和/或,下游環(huán)引物L(fēng)B_D:5’-CTCAGCTTCTGCCTGTACAA-3’;
引物組E’:
上游外引物F3_E:5’-TGAAGTGATTCGGTTGCT-3’;
下游外引物B3_E:5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_E:5’-GAACAAGCCCGTAATGACCTTCGAGAGAGAGTAATTGCA-3’;
下游內(nèi)引物BIP_E:5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’;
下游環(huán)引物L(fēng)B_E:5’-TCTCAAATTCAGCCATTCTTCCTG-3’;
引物組F’:
上游外引物F3_F:5’-CTGCCTGTACAATCTCAAA-3’;
下游外引物B3_F:5’-GAGCAAATTAACCGGCTTAA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_F:5’-GCTAAAAATTGCTCGCGAATCTCCATTCTTCCTGCAGCAAT-3’;
下游內(nèi)引物BIP_F:5’-TGCTCTTGTGCCTGCAATTTTCACAAACTGTCACCG-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_F:5’-AGTTGATGTTAACCGGGCAAT-3’;
引物組G’:
上游外引物F3_G:5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’;
下游外引物B3_G:5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_G:5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_G:
5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_G:5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’;
引物組M’:
上游外引物F3_M:5’-GCACTGCGTTCGTTACCT-3’;
下游外引物B3_M:5’-GATGTATCCCTTGTTGGTGGAG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_M:GTACAGGCCAGGGTAAATGTACGTCCAGTTGCTGGTGAGCTT-3’;
下游內(nèi)引物BIP_M:5’-TGACCGGTATTTCGACCTGTATGCCAAGTGCGCAGACGAGAT-3’;
下游環(huán)引物L(fēng)B_M:5’-TACGTAGTTCTCCCATGTCCTGGA-3’;
引物組N’:
上游外引物F3_N:5’-CTGAAGTGATTCGGTTGC-3’;
下游外引物B3_N:5’-GCGAATCTCTTAATCGATCA-3’;
上游內(nèi)引物FIP_N:5’-TTTTGAACAAGCCCGTAATGACGGCGTGTTTAAATCGAGA-3’;
下游內(nèi)引物BIP_N:5’-AACCTCAGCTTCTGCCTGTAATTAGTTGATGTTAACCGGG-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_N:5’-CGCAAAGCGTCTGGAGTTATTGC-3’;
和/或,下游環(huán)引物L(fēng)B_N:5’-TTCAGCCATTCTTCCTGCAGCA-3’;
引物組O’:
上游外引物F3_O:5’-TATCATGTGCCTGAAGTGAT-3’;
下游外引物B3_O:5’-GTTAACCGGGCAATGATT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_O:5’-GTAATGACCTTGACGCAAAGCCTATTGGCGTGTTTAAATCG-3’;
下游內(nèi)引物BIP_O:
5’-CAAAATTTAGTTCCTGAGAGGCAACGAAGAATGGCTGAATTTGAG-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_O:5’-CTGGAGTTATTGCAATTACTCTCTC-3’;
引物組P’:
上游外引物F3_P:5’-AATTTGCTCACTCAGTTGTG-3’;
下游外引物B3_P:5’-ATGACCGTTATCGTCAGG-3’;
上游內(nèi)引物FIP_P:5’-GCTTTTCCACAAACGATGGTGGTTGCAATATTTTTACCGGC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_P:5’-TATAGTTCCATCCAAGGCTTACTCGTGTCACCAAAAACCACTAT-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_P:5’-CATTCAACCTTTACTGCGTGG-3’;
引物組Q’:
上游外引物F3_Q:5’-TTTAGTTCCTGAGAGGCAA-3’;
下游外引物B3_Q:5’-TGAGCAAATTAACCGGCT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_Q:5’-GATGTTAACCGGGCAATGATTGGCTTCTGCCTGTACAATC-3’;
下游內(nèi)引物BIP_Q:5’-GATTCGCGAGCAATTTTTAGCTTTTCACAAACTGTCACCG-3’;
上游環(huán)引物L(fēng)F_Q:5’-GCAGGAAGAATGGCTGAATTTG-3’;
和/或,下游環(huán)引物L(fēng)B_Q:5’-CTCTTGTGCCTGCAATAATGC-3’;
引物組R’:
上游外引物F3_R:5’-GCAATTTTTAGCTGCTCTTG-3’;
下游外引物B3_R:5’-GTAAGCCTTGGATGGAACT-3’;
上游內(nèi)引物FIP_R:5’-GTGAGCAAATTAACCGGCTTAAAAGAAGTAATGATCCCGGT-3’;
下游內(nèi)引物BIP_R:5’-GCAATATTTTTACCGGCACCACATATGGCTGGCTTTTCCA-3’;
下游環(huán)引物L(fēng)B_R:5’-CAGTAAAGGTTGAATGACAGTGATG-3’。
14.一種用于恒溫檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括如權(quán)利要求9~13之任一項(xiàng)所述的引物。
15.如權(quán)利要求14所述的試劑盒,其特征在于,其還包括Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP溶液、Mg2+、甜菜堿中的一種或多種。
16.一種用于恒溫檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒的酶反應(yīng)體系包括:1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液,2-9mmol/L Mg2+,1.0-1.6mmol/L dNTP,0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物,0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物,包括或不包括0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB引物,0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶,和0-1.5mol/L的甜菜堿。
17.一種載體,其特征在于,所述載體包含如權(quán)利要求9~13之任一項(xiàng)所述的引物。
18.引物在恒溫檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌中的應(yīng)用,其特征在于,所述引物為如權(quán)利要求9~13之任一項(xiàng)所述的引物。
19.如權(quán)利要求14~16之任一項(xiàng)所述的試劑盒或如權(quán)利要求17所述的載體在恒溫檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌中的應(yīng)用。