本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥中間體的制備方法，具體涉及一種鹵醇脫鹵酶催化合成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的制備方法。

背景技術(shù)：

阿托伐他汀(atorvastatin，商品名立普妥，Lipitor)是世界上第一個(gè)年銷售額超過(guò)百億美元的藥品。它通過(guò)抑制羥甲基戊二酰CoA還原酶，阻礙肝臟中膽固醇合成的限速步驟來(lái)降低血液中膽固醇的含量。最近又有大量的臨床研究結(jié)果表明：他汀類藥物除了是最有效的降低膽固醇的藥物，而且對(duì)骨質(zhì)疏松癥、老年癡呆癥、心臟病和糖尿病等各種疾病都有顯著療效，如果進(jìn)一步開發(fā)新適應(yīng)癥，他汀類藥物無(wú)疑將會(huì)有更大的的臨床應(yīng)用范圍。作為他汀類藥物的關(guān)鍵手性中間體的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(ATS-5)，市場(chǎng)的需求量會(huì)越來(lái)越大。

目前合成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法主要有不對(duì)稱合成法和微生物轉(zhuǎn)化法等。發(fā)酵法制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯還處于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段，并且存在效率低的問(wèn)題；不對(duì)稱合成技術(shù)是使用一種對(duì)映體催化劑，與一種底物進(jìn)行反應(yīng)，使之只形成一個(gè)對(duì)映體的手性化合物的不對(duì)稱合成方法。其中又可分為化學(xué)催化不對(duì)稱還原和生物催化不對(duì)稱還原。

不對(duì)稱合成又稱為手性合成，它以具有手性活性中心的物質(zhì)作為原料，在保留活性中心的前提下通過(guò)化學(xué)方法或者生物方法，合成新的手性化合物。化學(xué)不對(duì)稱法合成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯需要手性底物作為原料，使用的手性催化劑大多含重金屬且合成技術(shù)復(fù)雜，重金屬也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，治理污染導(dǎo)致成本偏高，最終產(chǎn)物的光學(xué)純度也低于生產(chǎn)要求，因此不適用于制藥行業(yè)。

生物催化與化學(xué)法相比，生物催化法具有反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物化學(xué)純度和光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)。目前報(bào)道的生物催化酶主要有鹵醇脫鹵酶。鹵醇脫鹵酶是一類通過(guò)分子內(nèi)親核取代機(jī)制催化鄰鹵醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物的脫鹵酶，可以高效高選擇地催化環(huán)氧化物和鄰鹵醇之間的轉(zhuǎn)化，因而可以用來(lái)合成具有光學(xué)純的環(huán)氧化物，具有傳統(tǒng)化學(xué)合成法所無(wú)法比擬的優(yōu)越性。鹵醇脫鹵酶不需要任何輔助酶就能催化底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(ATS-4)將脫去鹵元素成環(huán)氧化合物，環(huán)氧化合物受氰基進(jìn)攻后轉(zhuǎn)化為(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，如下式所述。

但是，現(xiàn)有的鹵醇脫鹵酶催化法仍然存在以下不足：(1)鹵醇脫鹵酶不能重復(fù)使用，從而導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，(2)在攪拌催化過(guò)程中，酶在反應(yīng)體系中停留時(shí)間較長(zhǎng)，攪拌槳對(duì)固定化鹵醇脫鹵酶的打散改了越高，從根本上影響了酶的催化活性，導(dǎo)致酶的利用率不高，(3)反應(yīng)結(jié)束后，需要采用活性炭等將鹵醇脫鹵酶從反應(yīng)體系中吸附出來(lái)，一方面，會(huì)有少量鹵醇脫鹵酶殘留在反應(yīng)液中，且在后續(xù)精餾過(guò)程中也很難去除，從而影響了產(chǎn)品的品質(zhì)；另一方面，活性炭在吸附鹵醇脫鹵酶的同時(shí)也會(huì)吸附一部分(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(ATS-5)，從而影響產(chǎn)品的收率，尤其是增加了后處理的復(fù)雜程度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種鹵醇脫鹵酶催化合成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的制備方法，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快，酶在體系中停留時(shí)間短，酶利用率高，成本低，產(chǎn)物得率高，光學(xué)純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

一種鹵醇脫鹵酶催化合成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的制備方法，包括如下步驟：

1)配制鹵醇脫鹵酶溶液，將吸附樹脂加入到鹵醇脫鹵酶溶液中，并在15-30℃下攪拌3-5h，使得鹵醇脫鹵酶吸附到吸附樹脂上；

2)將戊二醛水溶液滴入到步驟1)的鹵醇脫鹵酶溶液中，在溫度為20-35℃下，攪拌反應(yīng)3-5h，得固定液，將吸附樹脂從酶溶液中分離出來(lái)，洗滌得到固定化鹵醇脫鹵酶；

3)稱取210g蒸餾水、1.5-2.5g氰化鈉，逐一加入到不銹鋼反應(yīng)釜中，并調(diào)節(jié)pH至7.5-8.5；

4)加入40-50g底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(ATS-4)，并升溫，待溫度為45-55℃時(shí)加入吸附樹脂固定鹵醇脫鹵酶，調(diào)節(jié)pH至6.90-7.05，用氣相色譜實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率；

5)待步驟4)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50％時(shí)，將混合液與固定化鹵醇脫鹵酶過(guò)濾分離，固定化鹵醇脫鹵酶再加入反應(yīng)釜，混合液進(jìn)入分層裝置，上層進(jìn)入精餾裝置中，精餾裝置下部得到(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，未反應(yīng)的原料從上部流回入反應(yīng)釜中繼續(xù)反應(yīng)，如此循環(huán)反應(yīng)，得到高轉(zhuǎn)化率的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(ATS-5)。。

具體地，步驟1)所述的鹵醇脫鹵酶溶液的濃度為10-30mg/mL。

具體地，步驟1)所述的吸附樹脂為弱酸陽(yáng)離子樹脂、弱堿陽(yáng)離子樹脂或大孔吸附樹脂。

具體地，步驟1)所述的吸附樹脂與鹵醇脫鹵酶的質(zhì)量比為10:1-40:1。

具體地，步驟2)所述的戊二醛水溶液的體積分?jǐn)?shù)為0.5-1.5％，戊二醛水溶液與酶溶液的體積比為1:25。

具體地，步驟4)中加入的鹵醇脫鹵酶的量為(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯質(zhì)量的1/3-1/2。

具體地，步驟5)所述的循環(huán)反應(yīng)時(shí)間為1h，轉(zhuǎn)化率為98.8％-99.4％。

本發(fā)明具有如下的有益效果：

(1)本發(fā)明將轉(zhuǎn)化率為50％的反應(yīng)體系導(dǎo)入精餾裝置，使得酶在反應(yīng)體系停留時(shí)間大大縮短，減少了的酶的降解，有利于酶的回收再利用，酶的利用率得到提高。

(2)本發(fā)明轉(zhuǎn)化率高，可達(dá)98.8％-99.4％；沒有副反應(yīng)存在，制得的產(chǎn)物光學(xué)純度高。

(3)本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快，成本低，操作穩(wěn)定性好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯制備方法的反應(yīng)流程圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)在結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

實(shí)施例1

1)配制濃度為20mg/mL的鹵醇脫鹵酶溶液，將40g吸附樹脂加入到200mL的鹵醇脫鹵酶溶液中，并在20℃下攪拌3-5h，使得鹵醇脫鹵酶吸附到吸附樹脂上；

2)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的戊二醛水溶液滴入到步驟1)的鹵醇脫鹵酶溶液中，戊二醛水溶液與酶溶液的體積比為1:25，在溫度為20℃下，攪拌反應(yīng)3-5h，得固定液，將吸附樹脂從酶溶液中分離出來(lái)，洗滌得到固定化鹵醇脫鹵酶；

3)稱取210g蒸餾水、1.5g氰化鈉，逐一加入到不銹鋼反應(yīng)釜中，并調(diào)節(jié)pH至7.5；

4)加入45g底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(ATS-4)，并升溫，待溫度為50℃時(shí)加入15g吸附樹脂固定鹵醇脫鹵酶，調(diào)節(jié)pH為6.90，用氣相色譜實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率；

5)待步驟2)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50％時(shí)，將混合液與固定化鹵醇脫鹵酶過(guò)濾分離，固定化鹵醇脫鹵酶再加入反應(yīng)釜，混合液進(jìn)入分層裝置，上層進(jìn)入精餾裝置中，精餾裝置下部得到(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，未反應(yīng)的原料從上部流回入反應(yīng)釜中繼續(xù)反應(yīng)，循環(huán)反應(yīng)1h后，得到轉(zhuǎn)化率為99％的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。

實(shí)施例2-6與實(shí)施例1基本相同，不同之處如表1。

表1

以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實(shí)施例為啟示，通過(guò)上述的說(shuō)明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完全可以在不偏離本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進(jìn)行多樣的變更以及修改。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于說(shuō)明書上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來(lái)確定其技術(shù)性范圍。