本發(fā)明屬于煙草化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從煙草中首次提取得到的異吲哚生物堿化合物。同時(shí)，本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法和在抗煙草花葉病毒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙草是世界上化學(xué)成分最為復(fù)雜的植物，次生代謝產(chǎn)物非常豐富，經(jīng)過(guò)幾十年的研究，人們目前從煙草中鑒定出來(lái)的單體化學(xué)物質(zhì)就超過(guò)3000多種，而且還有許多成分尚未鑒定出來(lái)。煙草除主要用于卷煙抽吸用途外，還可從中提取多種有利用價(jià)值的化學(xué)成分，從中發(fā)現(xiàn)有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的先導(dǎo)性化合物。吲哚生物堿是指分子中含吲哚環(huán)的天然生物堿類(lèi)化合物。吲哚生物堿類(lèi)化合物分布較廣，在植物體廣泛存在；而且許多化合物具有突出的活性，是天然藥物和生物農(nóng)藥的重要來(lái)源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從云南烤煙煙葉中分離得到了一種新的芳構(gòu)化異吲哚生物堿化合物，該化合物至今尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，值得一提的是該化合物具有顯著的抗煙草花葉病病毒活性。

本發(fā)明的目的在于提供一種新的異吲哚生物堿化合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備所述異吲哚生物堿化合物的方法。

本發(fā)明的目的還在于提供所述異吲哚生物堿化合物在抗煙草花葉病毒中的應(yīng)用。

除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

本發(fā)明第一方面從煙草中分離出一種新的異吲哚生物堿化合物，其分子式為C₁₃H₁₅NO₆，具有下述結(jié)構(gòu)式：

化合物命名為：4,6-二羥基-2-(2-羥乙基)-5-(3-羥基丙酮基)-異吲哚-1-酮；英文名為：4,6-dihydroxy-2-(2-hydroxyethyl)-5-(3-hydroxypropan)-isoindolin-1-one。

本發(fā)明第二方面制備所述異吲哚生物堿化合物的方法，該方法包括以下步驟：

(1)浸膏提取:以煙葉為原料，將煙葉粉碎或切成小段，用重量百分濃度80％～100％的甲醇或乙醇，或重量百分濃度60％～90％的丙酮為提取溶劑，提取溶劑：煙葉的重量比＝2～4:1，浸泡24h～72h，提取3～5次，合并提取液、過(guò)濾濃縮成浸膏；

(2)硅膠柱層析：浸膏用重量比2～4倍量的160～300目硅膠干法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析；以氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，合并相同的部分，收集各部分洗脫液并濃縮；

(3)高壓液相色譜分離純化：洗脫液的7:3部分進(jìn)一步用高壓液相色譜分離純化即得所需的異吲哚生物堿化合物。

優(yōu)選地，其還包括以下進(jìn)一步提純的步驟：將在所述高壓液相色譜分離之后得到的所述的異吲哚生物堿化合物再次溶于純甲醇，并以純甲醇為流動(dòng)相，通過(guò)凝膠柱進(jìn)行層析分離，得到進(jìn)一步提純的所述的異吲哚生物堿化合物。

優(yōu)選地，步驟(3)中，所述的高壓液相色譜分離純化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色譜柱，流速為20mL/min，流動(dòng)相為36wt％的甲醇，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為298nm，每次進(jìn)樣200μL，收集29.5min的色譜峰，多次累加后蒸干。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述的浸膏在經(jīng)硅膠柱層析粗分前，用重量1.5～3倍量的純甲醇或純乙醇或純丙酮溶解后，用重量0.8～1.2倍的80～100目硅膠拌樣。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述的梯度洗脫，氯仿-丙酮溶液體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2。

本發(fā)明第二方面提供所述的異吲哚生物堿化合物在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用。

表-1.化合物的¹H NMR和¹³C NMR數(shù)據(jù)(溶劑為CDCl₃)

以上述方法制備得到的異吲哚生物堿化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)以下方法進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明化合物為黃色膠狀物，由高分辨質(zhì)譜可知其準(zhǔn)分子離子峰[M+Na]⁺為304.0790，可推測(cè)其分子式為C₁₃H₁₅NO₆，化合物的不飽和度為7。紫外光譜在210、260和298nm有吸收峰，說(shuō)明化合物中有芳環(huán)結(jié)構(gòu)。紅外光譜在1688,1660,1612,1576,1452cm^-1存在強(qiáng)吸收峰，證實(shí)化合物中存在羥基、羰基和芳環(huán)功能團(tuán)。根據(jù)化合物的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)(C-1-C-7a；H₂-3,和H-7)(表-1)可初步推測(cè)化合物1為異吲哚-1-酮結(jié)構(gòu)。根據(jù)H₂-3(δ_H 4.20)和C-1(δ_C 166.3)、C-3a(δ_C136.3)、C-4(δ_C 153.1)、C-7a(δ_C 116.8)；H-7(δ_H 6.63)和C-1(δ_C 166.3)、C-3a(δ_C 136.3)、C-7a(δ_C 116.8)的HMBC相關(guān)(圖-3)可進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明化合物為異吲哚-1-酮結(jié)構(gòu)?；衔锏哪负说玫酱_定后，其它基團(tuán)可歸屬為取代基，包括一個(gè)3-羥基丙酮基(C-1'–C-3'，H₂-2'，H₂-3')，一個(gè)和氮原子相連的羥乙基(C-1”、C-2”，H₂-1”，H₂-2”)和兩個(gè)酚羥基(11.05s、10.84)。根據(jù)H₂-2'和C-4、C-5和C-6的HMBC相關(guān)可證實(shí)3-羥基丙酮基取代在苯環(huán)的C-5位；羥乙基取代在異吲哚環(huán)的氮原子上和由H₂-1”和C-1、C-3，以及H₂-3和C-1”的HMBC相關(guān)確定，根據(jù)酚羥基氫(δ_H 11.05)和C-3a、C-4、C-5，以及(δ_H 10.84)和C-4、C-5、C-6的HMBC相關(guān)可證實(shí)兩個(gè)酚羥基取代在C-4和C-6位。至此，本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)的到確定，并命名為4,6-二羥基-2-(2-羥乙基)-5-(3-羥基丙酮基)-異吲哚-1-酮。

化合物的紅外、紫外和質(zhì)譜數(shù)據(jù)：UV(MeOH)λ_max nm(logε)210(4.18)、268(3.52)、和306(3.08)；IR(KBr)ν_max 3386、2938、1688、1660、1612、1576、1452、1358、1246、1167、1062、973、和852cm^-1；正離子模式ESIMS m/z 304[M+Na]⁺，正離子模式HRESIMS m/z 304.0790[M+Na]⁺(計(jì)算值為304.0797，C₁₃H₁₅NNaO₆,)。

采用半葉法進(jìn)行了本發(fā)明化合物的抗煙草花葉病毒活性測(cè)試，結(jié)果明本化合物的相對(duì)抑制率為56.8％，超過(guò)對(duì)照寧南霉素的相對(duì)抑制率31.5％，說(shuō)明化合物有很好的抗煙草花葉病毒活性。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明化合物是首次被分離出來(lái)的，通過(guò)上述核磁共振和質(zhì)譜測(cè)定方法確定為異吲哚生物堿化合物，并表征了其具體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)新穎，至今尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。

2、活性檢測(cè)結(jié)果揭示，本發(fā)明的異吲哚生物堿化合物在制備抗輪狀病毒藥物中有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單活性較好，可作為抗花葉病毒藥物研發(fā)的先導(dǎo)性化合物用于抗花葉病毒藥物制劑研發(fā)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明異吲哚生物堿化合物的核磁共振碳譜；

圖2為本發(fā)明異吲哚生物堿化合物的核磁共振氫譜；

圖3為本發(fā)明異吲哚生物堿化合物的主要HMBC相關(guān)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

制備異吲哚生物堿化合物C₁₃H₁₅NO₆，包括浸膏提取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離，具體采用以下步驟：

1.浸膏提?。喝熑~粉碎，用高濃度甲醇(wt％：95％)或高濃度乙醇(wt％：95％)或高濃度丙酮(wt％：70％)為提取溶劑，提取溶劑：煙草(重量比)＝3:5，浸泡54h，提取4次，合并提取液、過(guò)濾濃縮成浸膏。

2.硅膠柱層析：浸膏用重量2.5倍量的純甲醇或純乙醇或純丙酮溶解后用重量1.2倍的80～100目硅膠拌樣，用重量3倍量的250目硅膠干法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析；以體積配比為(1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2)的氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，合并相同的部分，收集各部分洗脫液并濃縮。

3.高壓液相色譜分離：柱層析洗脫液的7:3部分進(jìn)一步用高壓液相色譜分離純化即得所述的異吲哚生物堿化合物，高壓液相色譜分離純化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色譜柱，流速為20mL/min，流動(dòng)相為36wt％的甲醇，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為298nm，每次進(jìn)樣200μL，收集29.5min的色譜峰，多次累加后蒸干。

高壓液相色譜法分離純化后的物質(zhì)，一個(gè)優(yōu)選的后處理方案為，所得化合物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用凝膠柱層析分離，以進(jìn)一步分離純化。

本發(fā)明所用煙葉原料不受地區(qū)和品種限制，均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，下面以來(lái)源于云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司不同產(chǎn)地的煙葉原料，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例2

煙草樣品來(lái)源于云南玉溪，品種為玉溪K326。將煙草取樣2.0kg粉碎以95％的甲醇提取 5次，每次提取24h，提取液合并，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏105g。浸膏用重量2.0倍量的純甲醇溶解后用120g的100目粗硅膠拌樣，0.6kg的160目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)合并相同的部分，得到8個(gè)部分，其中體積配比為7:3的氯仿-丙酮洗脫部分用安捷侖1100半制備高效液相色譜分離，以36wt％的甲醇為流動(dòng)相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制備柱為固定相，流速為20ml/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為298nm，每次進(jìn)樣200μL，收集29.5min的色譜峰，多次累加后蒸干；所得產(chǎn)物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。

實(shí)施例3

煙草樣品來(lái)源于云南大理，品種為云煙200，將煙草取樣3.5kg切碎，以95wt％的乙醇提取4次，每次提取48h，提取液合并，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏250g。浸膏用重量2.0倍量的純甲醇溶解后用250g的80目粗硅膠拌樣，1.2kg的200目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)合并相同的部分，得到8個(gè)部分，其中體積配比為7:3的氯仿-丙酮洗脫部分用安捷侖1100半制備高效液相色譜分離，以36wt％的甲醇為流動(dòng)相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制備柱為固定相，流速為20ml/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為298nm，每次進(jìn)樣200μL，收集29.5min的色譜峰，多次累加后蒸干；所得產(chǎn)物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。

實(shí)施例4

煙草樣品來(lái)源于云南昆明，品種為紅花大金元，將煙草取樣5kg粉碎，以75％的丙酮用超聲提取3次，每次提取72h，提取液合并，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏380g。浸膏用重量比1.6倍量的純甲醇溶解后用400g的90目粗硅膠拌樣，2.4kg的180目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)合并相同的部分，得到8個(gè)部分，其中體積配比為7:3的氯仿-丙酮洗脫部分用安捷侖1100半制備高效液相色譜分離，以36％的甲醇為流動(dòng)相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制備柱為固定相，流速為20ml/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為298nm，每次進(jìn) 樣200μL，收集29.5min的色譜峰，多次累加后蒸干；所得產(chǎn)物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。

實(shí)施例5

------化合物結(jié)構(gòu)的鑒定

以上述方法制備得到的異吲哚生物堿化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)以下方法進(jìn)行測(cè)定。化合物為黃色膠狀物，由高分辨質(zhì)譜可知其準(zhǔn)分子離子峰[M+Na]⁺為304.0790，可推測(cè)其分子式為C₁₃H₁₅NO₆，化合物的不飽和度為7。紫外光譜在210、260和298nm有吸收峰，說(shuō)明化合物中有芳環(huán)結(jié)構(gòu)。紅外光譜在1688,1660,1612,1576,1452cm^-1存在強(qiáng)吸收峰，證實(shí)化合物中存在羥基、羰基和芳環(huán)功能團(tuán)。根據(jù)化合物的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)(C-1-C-7a；H₂-3,和H-7)(表-1)可初步推測(cè)化合物1為異吲哚-1-酮結(jié)構(gòu)。根據(jù)H₂-3(δ_H 4.20)和C-1(δ_C 166.3)、C-3a(δ_C136.3)、C-4(δ_C 153.1)、C-7a(δ_C 116.8)；H-7(δ_H 6.63)和C-1(δ_C 166.3)、C-3a(δ_C 136.3)、C-7a(δ_C 116.8)的HMBC相關(guān)(圖-3)可進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明化合物為異吲哚-1-酮結(jié)構(gòu)。化合物的母核得到確定后，其它基團(tuán)可歸屬為取代基，包括一個(gè)3-羥基丙酮基(C-1'–C-3'，H₂-2'，H₂-3')，一個(gè)和氮原子相連的羥乙基(C-1”、C-2”，H₂-1”，H₂-2”)和兩個(gè)酚羥基(11.05s、10.84)。根據(jù)H₂-2'和C-4、C-5和C-6的HMBC相關(guān)可證實(shí)3-羥基丙酮基取代在苯環(huán)的C-5位；羥乙基取代在異吲哚環(huán)的氮原子上和由H₂-1”和C-1、C-3，以及H₂-3和C-1”的HMBC相關(guān)確定，根據(jù)酚羥基氫(δ_H 11.05)和C-3a、C-4、C-5，以及(δ_H10.84)和C-4、C-5、C-6的HMBC相關(guān)可證實(shí)兩個(gè)酚羥基取代在C-4和C-6位。至此，本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)的到確定，并命名為4,6-二羥基-2-(2-羥乙基)-5-(3-羥基丙酮基)-異吲哚-1-酮。

實(shí)施例6

取實(shí)施例3制備的化合物，為黃色膠狀物。測(cè)定方法與實(shí)施例5相同，確認(rèn)實(shí)施例3制備的化合物為所述的異吲哚生物堿化合物——4,6-二羥基-2-(2-羥乙基)-5-(3-羥基丙酮基)-異吲哚-1-酮。

實(shí)施例7

取實(shí)施例4制備的化合物，為黃色膠狀物。測(cè)定方法與實(shí)施例5相同，確認(rèn)實(shí)施例4制備的化合物為所述的4,6-二羥基-2-(2-羥乙基)-5-(3-羥基丙酮基)-異吲哚-1-酮。

實(shí)施例8

取實(shí)施例1-4制備的任一異吲哚生物堿化合物進(jìn)行抗煙草花葉病毒活性試驗(yàn)，試驗(yàn)情況如下：

采用半葉法，在藥劑的質(zhì)量濃度均為50mg/L時(shí)對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行抗煙草花葉病毒活性測(cè)定。在5～6齡烤煙的植株上，選取適用于測(cè)試的葉片(葉行正常，無(wú)病無(wú)蟲(chóng))，先將葉片均勻撒上細(xì)金剛砂，用毛筆將備用的煙草花葉病毒源(3.0×10^-3)均勻抹在撒有金剛砂的葉片上，待所有中選的葉片接毒結(jié)束后，立即放在盛有藥液的培養(yǎng)皿中處理20min，取出，擦去葉片上水珠和藥液，將兩個(gè)半葉復(fù)原排放在鋪有衛(wèi)生紙保濕的玻璃缸中，并蓋上玻璃蓋，控溫(23±2)℃，放在溫室自然光照射，2～3d即可見(jiàn)枯斑.每個(gè)處理都設(shè)另一半葉為對(duì)照，另外設(shè)有1組為商品寧南霉素的處理作為對(duì)比，按下公式計(jì)算相對(duì)抑制率。

XI％＝(CK-T)/CK×100％

X：相對(duì)抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒葉的枯斑數(shù)(個(gè))，T浸泡于藥液中半片接毒葉的枯斑數(shù)(個(gè))。

結(jié)果明本化合物的相對(duì)抑制率為56.8％，超過(guò)對(duì)照寧南霉素的相對(duì)抑制率31.5％，說(shuō)明化合物有很好的抗煙草花葉病毒活性。