本發(fā)明涉及fgf21的類(lèi)似物的衍生物，更具體地涉及在位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181處具有側(cè)鏈的fgf21類(lèi)似物，以及它們的醫(yī)藥用途。

序列表的援引并入

名稱為“序列表(sequencelisting)”的序列表為33kb，創(chuàng)建于2015年12月21日，并且通過(guò)引用并入本文。

背景

fgf21屬于具有代謝作用而非促有絲分裂作用的非典型成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)的fgf19亞族。fgf21結(jié)合并激活fgf受體(fgfr1c、fgfr2c和fgfr3c)，但僅在非信號(hào)傳導(dǎo)共受體β-klotho(bkl)的存在下發(fā)生。bkl的組織特異性表達(dá)決定了fgf21的代謝活性。fgf21轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)飲食誘發(fā)的肥胖癥有抗性，并且壽命延長(zhǎng)。fgf21是能量消耗、葡萄糖和脂質(zhì)代謝的代謝調(diào)節(jié)物，其具有在患有糖尿病和血脂異常的肥胖患者中逆轉(zhuǎn)體重、高血糖和血脂異常的巨大潛力。

fgf21由于蛋白水解而面臨體內(nèi)不穩(wěn)定性的問(wèn)題，并且多達(dá)一半的內(nèi)源性循環(huán)人fgf21是無(wú)活性的。活性的喪失是由于c-末端的降解，這些代謝物中的大多數(shù)終止于p171而非s181。因此，對(duì)于治療性fgf21分子來(lái)說(shuō)，針對(duì)c-末端區(qū)的代謝分解的保護(hù)是需要的。c-末端區(qū)的工程改造可使其免受降解，然而迄今為止，這種工程改造的代價(jià)是工程化fgf21化合物的效力降低或喪失。fgf21的n-末端區(qū)與fgfr結(jié)合，而fgf21的c-末端區(qū)與bkl結(jié)合。c-末端氨基酸的截短導(dǎo)致效力顯著喪失。

在[180c]fgf21的位置180處的peg化導(dǎo)致體外活性大幅下降(j.xu等人,bioconjugatechemistry(2013),24,915-925)。通過(guò)將fc附接至fgf21的c-末端而產(chǎn)生的fc融合蛋白比天然fgf21和fgf21的n-末端fc融合體的效力低得多(hecht等人,plosone2012,7(11),e49345)。

概述

本發(fā)明涉及相比于成熟人fgf21(seqidno:1)在與位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181之一相對(duì)應(yīng)的位置具有側(cè)鏈的fgf21衍生物。本發(fā)明涉及相比于成熟人fgf21(seqidno:1)在與位置180或181之一相對(duì)應(yīng)的位置具有側(cè)鏈的fgf21衍生物。更具體地，所述側(cè)鏈共價(jià)附接至與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180相對(duì)應(yīng)的fgf21類(lèi)似物位置，或共價(jià)附接至與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置181相對(duì)應(yīng)的fgf21類(lèi)似物位置。

更具體地，所述側(cè)鏈共價(jià)附接至與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置170、174或175相對(duì)應(yīng)的fgf21類(lèi)似物位置，或共價(jià)附接至與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置167、171、172或173相對(duì)應(yīng)的fgf21類(lèi)似物位置。

半胱氨酸存在于fgf21類(lèi)似物中的側(cè)鏈附接位置。該側(cè)鏈共價(jià)附接至其所附接的半胱氨酸殘基的硫原子。該側(cè)鏈包含連接體和延長(zhǎng)體(protractor)。該延長(zhǎng)體可為脂防二酸。

所述連接體可包含若干個(gè)連接體元件，如一個(gè)或多個(gè)gglu殘基，和/或一個(gè)或多個(gè)ado殘基(ado為8-氨基-3,6-二氧雜辛酸)，以及/或者一個(gè)或多個(gè)具有*-nh基團(tuán)和*-co基團(tuán)的其他二價(jià)基團(tuán)(di-radical)。所述延長(zhǎng)體和所述連接體經(jīng)由酰胺鍵連接。所述連接體經(jīng)由硫醚鍵連接至fgf21蛋白的180cys或181cys的硫原子。

所述連接體可包含若干個(gè)連接體元件，如一個(gè)或多個(gè)gglu殘基，和/或一個(gè)或多個(gè)ado殘基(ado為8-氨基-3,6-二氧雜辛酸)，和/或一個(gè)或多個(gè)trx元件(trx為氨甲環(huán)酸)，和/或一個(gè)或多個(gè)*-nh-s(＝o)2-(ch2)3-co-*，以及/或者一個(gè)或多個(gè)具有*-nh基團(tuán)和*-co基團(tuán)的其他二價(jià)基團(tuán)。所述延長(zhǎng)體和所述連接體經(jīng)由酰胺鍵連接，而所述連接體經(jīng)由在位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181的半胱氨酸的硫原子通過(guò)硫醚鍵連接至fgf21蛋白。

并入本發(fā)明fgf21衍生物中的fgf21蛋白為成熟人fgf21(seqidno:1)的類(lèi)似物，該類(lèi)似物在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置之一處包含半胱氨酸殘基。

相比于成熟人fgf21(seqidno:1)，本發(fā)明衍生物的fgf21類(lèi)似物可具有總計(jì)至多30個(gè)氨基酸改變，其中在位置180或181之一處的半胱氨酸算作一個(gè)氨基酸改變。最多29個(gè)其他改變可獨(dú)立地為一個(gè)或多個(gè)延伸、一個(gè)或多個(gè)插入、一個(gè)或多個(gè)缺失，和/或一個(gè)或多個(gè)置換。

特別地，在第一方面，本發(fā)明涉及fgf21蛋白的衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酰胺或酯，其中所述蛋白在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基，其中所述衍生物包含經(jīng)由連接體附接至所述cys殘基的延長(zhǎng)體；其中該延長(zhǎng)體選自：

化學(xué)式1a：hooc-(ch2)x-co-*，

化學(xué)式1b：hooc-苯-o-(ch2)x-co-*

化學(xué)式1c：ho-s(＝o)2-(ch2)x-co-*

其中x為8-18范圍內(nèi)的整數(shù)；并且其中所述連接體包含化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中每一種的至少一個(gè)；

其中化學(xué)式2選自：

化學(xué)式2a：*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*，

化學(xué)式2b：*-nh-s(＝o)2-(ch2)3-co-*以及

化學(xué)式2c：*-nh-ch2-環(huán)己烷-co-*，

其中化學(xué)式3為*-nh-(ch2)2-[o-(ch2)2]k-o-[ch2]n-co-*，其中k為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，并且

其中化學(xué)式4選自

*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*和

*-nh-ch(cooh)-(ch2)m-nh-co-ch2-*

其中m為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，并且

其中化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4經(jīng)由酰胺鍵并按所示順序相互連接，在其*-nh端連接至所述延長(zhǎng)體的co-*端，并在其ch2-*端連接至在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基的硫原子。

更特別地，在第一方面，本發(fā)明涉及fgf21蛋白的衍生物，其中所述蛋白包含在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基，以及與成熟人fgf21(seqidno:1)相比的最多30個(gè)氨基酸修飾；其中所述衍生物包含經(jīng)由連接體附接至所述cys殘基的延長(zhǎng)體；其中該延長(zhǎng)體為化學(xué)式1：hooc-(ch2)x-co-*，其中x為10-18范圍內(nèi)的整數(shù)，并且其中所述連接體包含化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中每一種的至少一個(gè)：

化學(xué)式2：*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*，

化學(xué)式3：*-nh-(ch2)2-[o-(ch2)2]k-o-[ch2]n-co-*，以及

化學(xué)式4：*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*，

其中k為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，且m為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)?；瘜W(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4經(jīng)由酰胺鍵并按所示順序相互連接，在其*-nh端連接至所述延長(zhǎng)體的co-*端，并在其ch2-*端連接至在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基的硫原子。

被指定為化合物13至化合物24的本發(fā)明優(yōu)選的fgf21衍生物在實(shí)驗(yàn)部分中公開(kāi)。

被指定為化合物13至化合物18的本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的fgf21衍生物在實(shí)驗(yàn)部分中公開(kāi)。

被指定為化合物35至化合物41的本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的fgf21衍生物在實(shí)驗(yàn)部分中公開(kāi)。

被指定為化合物43至化合物56的本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的fgf21衍生物在實(shí)驗(yàn)部分中公開(kāi)。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基的fgf21類(lèi)似物。優(yōu)選地，該類(lèi)似物與人fgf21(seqidno:1)具有高度的同一性?？赏ㄟ^(guò)與人fgf21(seqidno:1)相比的氨基酸置換或修飾的數(shù)目來(lái)描述同一性的程度。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基，以及與成熟人fgf21(seqidno:1)相比的最多30個(gè)氨基酸修飾的fgf21類(lèi)似物。

在第三方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的fgf21衍生物和類(lèi)似物的醫(yī)藥用途，例如，用于治療和/或預(yù)防所有形式的糖尿病及相關(guān)疾病，如飲食失調(diào)、心血管疾病、糖尿病并發(fā)癥；和/或用于改善脂質(zhì)參數(shù)、改善β-細(xì)胞功能；和/或用于延緩或預(yù)防糖尿病進(jìn)展；以及/或者用于治療和/或預(yù)防肝脂肪變性和非酒精性脂肪性肝病(nafld)。

本發(fā)明的fgf21衍生物是生物活性的。例如，它們非常有效，另外或可替代地，它們與fgf受體非常好地結(jié)合。另外或可替代地，它們具有延長(zhǎng)的藥代動(dòng)力學(xué)譜。例如，它們?cè)陟o脈內(nèi)施用至小鼠和/或小型豬時(shí)具有非常長(zhǎng)的終末半衰期。良好效力與長(zhǎng)半衰期的特別組合可能是非常理想的。

令人感興趣的是，在與成熟人fgf21的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180和181之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含側(cè)鏈的fgf21衍生物全部保留效力。

另外或可替代地，注意到，在與成熟人fgf21的位置180和181之一，特別是位置180相對(duì)應(yīng)的位置處包含側(cè)鏈的fgf21衍生物保留了高效力。

描述

在下文中，希臘字母可用其符號(hào)或相應(yīng)的書(shū)面名稱表示，例如：α＝alpha；β＝beta；ε＝epsilon；γ＝gamma；ω＝omega；等等。此外，希臘字母μ也可用“u”表示，例如在μl＝ul或μm＝um中。

化學(xué)式中的星號(hào)(*)表示附接點(diǎn)。

在第一方面，本發(fā)明涉及fgf21蛋白的衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酰胺或酯，其中所述蛋白在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基，其中所述衍生物包含經(jīng)由連接體附接至所述cys殘基的延長(zhǎng)體；其中該延長(zhǎng)體選自：

化學(xué)式1a：hooc-(ch2)x-co-*，

化學(xué)式1b：hooc-苯-o-(ch2)x-co-*

化學(xué)式1c：ho-s(＝o)2-(ch2)x-co-*

其中x為8-18范圍內(nèi)的整數(shù)；并且其中所述連接體包含化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中每一種的至少一個(gè)；

其中化學(xué)式2選自：

*-nh-ch(cooh)-(ch2)m-co-*，

*-nh-s(＝o)2-(ch2)m-co-*以及

*-nh-(ch2)m-環(huán)己烷-co-*，

其中m單獨(dú)選自1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，

其中化學(xué)式3為*-nh-(ch2)2-[o-(ch2)2]k-o-[ch2]n-co-*，其中k為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，并且

其中化學(xué)式4選自

*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*和

*-nh-ch(cooh)-(ch2)m-nh-co-ch2-*

其中m為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化學(xué)式2選自：

*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*，

*-nh-s(＝o)2-(ch2)3-co-*以及

*-nh-ch2-環(huán)己烷-co-*。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化學(xué)式2為*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化學(xué)式2為*-nh-s(＝o)2-(ch2)3-co-*。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化學(xué)式2為*-nh-ch2-環(huán)己烷-co-*。

如上文提到的，所述衍生物包含經(jīng)由酰胺鍵相互連接的化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中每一種的至少一個(gè)。此外，所述連接體元件按所示順序連接?；瘜W(xué)式2在其*-nh端連接至延長(zhǎng)體的co-*端，而化學(xué)式4在其ch2-*端連接至在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基的硫原子。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及fgf21蛋白的衍生物，其中所述蛋白包含在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基，以及與成熟人fgf21(seqidno:1)相比的最多30個(gè)氨基酸修飾；其中所述衍生物包含經(jīng)由連接體附接至所述cys殘基的延長(zhǎng)體；其中該延長(zhǎng)體為化學(xué)式1：hooc-(ch2)x-co-*，其中x為10-18范圍內(nèi)的整數(shù)，并且其中所述連接體包含化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中每一種的至少一個(gè)：

化學(xué)式2：*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*，

化學(xué)式3：*-nh-(ch2)2-[o-(ch2)2]k-o-[ch2]n-co-*，以及

化學(xué)式4：*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*，

其中k為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，且m為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)?；瘜W(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4經(jīng)由酰胺鍵并按所示順序相互連接，在其*-nh端連接至所述延長(zhǎng)體的co-*端，并在其ch2-*端連接至在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基的巰基基團(tuán)。

fgf21蛋白和類(lèi)似物

實(shí)際上，合成的天然fgf21蛋白具有28個(gè)氨基酸的信號(hào)肽以供分泌。由其余181個(gè)氨基酸組成的成熟fgf21多肽作為seqidno:1包含在序列表中。

本發(fā)明衍生物的fgf21蛋白有時(shí)可被稱為該衍生物的“骨架”或“蛋白骨架”，或“fgf21類(lèi)似物”。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“fgf21蛋白”是指人fgf21(fgf21(1-181))的類(lèi)似物或變體，人fgf21(fgf21(1-181))的序列作為seqidno:1包含在序列表中。具有seqidno:1序列的蛋白還可被稱為“天然”fgf21、“成熟”fgf21和/或“成熟人”fgf21。

在序列表中，seqidno:1的成熟人fgf21的第一個(gè)氨基酸殘基(組氨酸)被指定為第1號(hào)。

fgf21類(lèi)似物的一個(gè)實(shí)例為具有n-末端甲硫氨酸的seqidno:1的蛋白，其也被稱為metfgf21(seqidno:2)。當(dāng)成熟人fgf21在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，n-末端met被添加，參見(jiàn)例如wo2006/050247，表6。在成熟人fgf21(seqidno:1)位置1的組氨酸之前的另一個(gè)n-末端氨基酸殘基被指定為第-1號(hào)位置。seqidno:2的metfgf21的合適命名法的非限制性實(shí)例為metfgf21、[met]fgf21或[-1m]fgf21。

metfgf21顯示出與seqidno:1的成熟人fgf21相當(dāng)?shù)纳锘钚裕⑶页鲇趯?shí)際原因，其常常代替seqidno:1的成熟人fgf21用作參考化合物。metfgf21的氨基酸序列作為seqidno:2包含在序列表中。

本文中，可參考i)成熟fgf21(1-181)中與改變的氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基的編號(hào)(即，成熟人fgf21中的相應(yīng)位置)以及參考ii)實(shí)際改變，來(lái)描述本發(fā)明的fgf21蛋白。

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含氨基酸置換的fgf21蛋白(fgf21類(lèi)似物)，其中野生型氨基酸殘基被半胱氨酸殘基置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180和181之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174和175之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置167、170、171、172、173、174、175和180之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置169、170、173、174、175、180和181之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置170、173、174、175和180之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置170、173、174、175、180和181之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置170、173、174、175和180之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置170、173、174和175之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置170、173、174、180和181之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置170、173、174和180之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置170、173和174之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置180和181之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。

例如，本發(fā)明的fgf21蛋白被定義為在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置180相對(duì)應(yīng)的位置處或在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置181相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置180或181相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置180相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。

本發(fā)明fgf21蛋白的這些cys殘基可分別被指定為cys180和cys181。例如，在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置181相對(duì)應(yīng)的位置處具有cys殘基的本發(fā)明fgf21蛋白可被稱為cys181fgf21和/或181cfgf21，或者[cys181]fgf21和/或[181c]fgf21。

以下是合適的類(lèi)似物命名法的非限制性實(shí)例。

ala[gln121,leu168,cys180]fgf21表示成熟人fgf21的類(lèi)似物，其中丙氨酸已添加至n-末端(即，在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置-1相對(duì)應(yīng)的位置處的ala)，位置121的天然存在的天冬酰胺已被谷氨酰胺置換，位置168的天然存在的甲硫氨酸已被亮氨酸置換，并且位置180的天然存在的丙氨酸已被半胱氨酸置換。

以下是fgf21類(lèi)似物的衍生物的合適命名法的非限制性實(shí)例。s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21表示成熟人fgf21(seqidno:1)的類(lèi)似物的衍生物，其中ala[gln121,leu168,cys180]表示相比于成熟人fgf21(seqidno:1)的氨基酸改變，其中數(shù)字指代成熟fgf21的相應(yīng)位置，并且其中取代基[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙基氨基]-2-氧代乙基]-共價(jià)附接至與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180相對(duì)應(yīng)的位置處的半胱氨酸的硫原子。

本發(fā)明的fgf21蛋白可具有相比于fgf21(seqidno:1)的其他氨基酸改變，但僅限于最多30個(gè)氨基酸改變。這些改變也是相比于成熟人fgf21(1-181)(seqidno:1)的，并且其可獨(dú)立地代表一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、插入、延伸和/或缺失。

在特定實(shí)施方案中，該氨基酸改變?cè)谂cfgf21(seqidno:1)的位置-1、121和168中的一個(gè)或多個(gè)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的fgf21蛋白除半胱氨酸氨基酸置換外還包含-1ala、121gln和168leu。

在實(shí)施方案中，本發(fā)明的fgf21蛋白除167cys、170cys、171cys、172cys、173cys、174cys、175cys、180cys和181cys中的任一個(gè)外還包含-1ala、121gln和168leu。也并入在實(shí)驗(yàn)部分中公開(kāi)的本發(fā)明特定衍生物中的本發(fā)明特定fgf21蛋白為序列表中的seqidno:8、10、12、14、15、16、17、18、19和20。

在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的fgf21蛋白除180cys或181cys中的任一個(gè)外還包含-1ala、121gln和168leu。

也并入在實(shí)驗(yàn)部分中公開(kāi)的本發(fā)明特定衍生物中的本發(fā)明特定fgf21蛋白為序列表中的seqidno:8和seqidno:10。

與成熟人fgf21(seqidno:1)相比，“包含”某些指定改變的蛋白可包含另外的改變。

從以上實(shí)例可以明顯看出，氨基酸殘基可通過(guò)其全稱、其單字母代碼和/或其三字母代碼來(lái)確定。這三種方式完全等效。

表述“等同于...的位置”或“相應(yīng)位置”可用來(lái)參照成熟人fgf21(seqidno:1)表征變異fgf21序列中的改變的位點(diǎn)。等同或相應(yīng)位置，以及改變的編號(hào)，例如通過(guò)簡(jiǎn)單的書(shū)寫(xiě)和目測(cè)來(lái)容易地推斷；以及/或者可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或肽比對(duì)程序，如基于needleman-wunsch算法的“align”。該算法在needleman,s.b.和wunsch,c.d.,(1970),journalofmolecularbiology,48:443-453中描述，而align程序由myers和w.miller在"optimalalignmentsinlinearspace"cabios(computerapplicationsinthebiosciences)(1988)4:11-17中描述。為了比對(duì)，可以使用默認(rèn)的打分矩陣blosum62和默認(rèn)的單位矩陣(identitymatrix)，并可將空位中的第一殘基的罰分設(shè)置為-12，或優(yōu)選-10，而將空位中的其他殘基的罰分設(shè)置為-2，或優(yōu)選-0.5。

在下文插入了這類(lèi)比對(duì)的一個(gè)例子，其中第1號(hào)序列為成熟人fgf21(seqidno:1)，而第2號(hào)序列為類(lèi)似物ala[121q,168l,181c]fgf21(seqidno:10)。所計(jì)算的同一性因此為97.8％。

#1：fgf21

#2：ala[121q,168l,181c]fgf21

#矩陣：eblosum62

#空位罰分：10.0

#延伸罰分：0.5

#長(zhǎng)度：182

#同一性：178/182(97.8％)

#相似性：179/182(98.4％)

#空位：1/182(0.5％)

#得分：952.0

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，fgf衍生物的fgf21蛋白或類(lèi)似物或fgf21骨架與人fgf21(seqidno:1)有至少80％的同一性，如至少85％的同一性，如至少90％的同一性，如與人fgf21(seqidno:1)至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

術(shù)語(yǔ)“蛋白”是指包含一系列通過(guò)酰胺(或肽)鍵相互連接的氨基酸的化合物。

本發(fā)明的蛋白包含至少151個(gè)通過(guò)肽鍵連接的組成氨基酸。在特定實(shí)施方案中，該蛋白包含至少160個(gè)，優(yōu)選至少170個(gè)，更優(yōu)選至少180個(gè)，甚至更優(yōu)選至少181個(gè)，或最優(yōu)選至少182個(gè)氨基酸。在其他特定實(shí)施方案中，該蛋白a)包含181或182個(gè)氨基酸，或b)由181或182個(gè)氨基酸組成。

在更進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，所述蛋白由通過(guò)肽鍵相互連接的氨基酸組成。

可將氨基酸定義為包含胺基團(tuán)和羧酸基團(tuán)并任選地包含一個(gè)或多個(gè)通常被稱為側(cè)鏈的額外基團(tuán)的化合物。例如，該胺基團(tuán)可以為伯氨基或仲氨基基團(tuán)。

氨基酸殘基是并入肽或蛋白中的氨基酸的基團(tuán)。

在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白的氨基酸是α-氨基酸，在α-氨基酸中，伯氨基或仲氨基基團(tuán)的氮原子與α-碳原子鍵合。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白的氨基酸選自編碼氨基酸和非編碼氨基酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白的所有氨基酸都為編碼氨基酸。

編碼氨基酸可以如iupac(國(guó)際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)；參見(jiàn)http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/)推薦規(guī)范的3aa-1部分中的表1中所定義，其中給出了20種編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)、俗稱、學(xué)名、單字母符號(hào)和三字母符號(hào)。

術(shù)語(yǔ)“非編碼氨基酸”是指所有其他氨基酸。非編碼氨基酸的非限制性實(shí)例為編碼氨基酸的d-異構(gòu)體，如d-丙氨酸和d-亮氨酸。

在下文中，未說(shuō)明光學(xué)異構(gòu)體的所有具體氨基酸都應(yīng)被理解為是指l-異構(gòu)體(除非另外說(shuō)明)，例如，除非另有說(shuō)明，當(dāng)提及具體氨基酸谷氨酰胺時(shí)，這是意在指l-谷氨酰胺。在另一方面，當(dāng)通過(guò)更多通式如brutto式或結(jié)構(gòu)式描述氨基酸并且未示出立體化學(xué)時(shí)，這些通式旨在涵蓋所有的立體異構(gòu)體。

根據(jù)本領(lǐng)域的一般做法，本發(fā)明的fgf21蛋白的n-末端在左側(cè)示出，而c-末端在右側(cè)示出。

fgf21衍生物

如本文在fgf21蛋白或類(lèi)似物的情境中所用的，術(shù)語(yǔ)“衍生物”意指化學(xué)修飾的fgf21蛋白或類(lèi)似物，其中數(shù)目明確的取代基已經(jīng)與該蛋白的一個(gè)或多個(gè)具體氨基酸殘基共價(jià)附接。該取代基可被稱為側(cè)鏈。

在特定實(shí)施方案中，所述側(cè)鏈能夠與白蛋白形成非共價(jià)締合，由此促進(jìn)衍生物隨血流的循環(huán)，并且由于fgf21衍生物與白蛋白的締合僅緩慢地分解以釋放活性藥物成分，因此還有延長(zhǎng)該衍生物的作用時(shí)間的效果。

所述側(cè)鏈包含本文中被稱為延長(zhǎng)體的部分。

相對(duì)于側(cè)鏈與蛋白的附接點(diǎn)，所述延長(zhǎng)體可以在側(cè)鏈的遠(yuǎn)端處或遠(yuǎn)端附近。

在更進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，所述側(cè)鏈包含在延長(zhǎng)體與肽附接點(diǎn)之間的部分，該部分可被稱為連接體。該連接體可由一個(gè)或多個(gè)連接體元件組成。

在特定實(shí)施方案中，所述側(cè)鏈和/或延長(zhǎng)體是親脂性的，和/或在生理ph(7.4)下帶負(fù)電荷。

所述側(cè)鏈可以通過(guò)烷基化與fgf21蛋白的半胱氨酸殘基共價(jià)附接。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述側(cè)鏈以鹵代乙酰胺基團(tuán)的形式合成，并且通過(guò)鹵代乙酰胺基團(tuán)激活，該鹵代乙酰胺基團(tuán)在形成也被稱為硫醚鍵的共價(jià)巰基-碳鍵(該過(guò)程被稱為cys烷基化)的條件下與半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)反應(yīng)。因此，衍生物中不存在巰基基團(tuán)，并且側(cè)鏈通過(guò)硫原子連接。在與衍生物相關(guān)地提及巰基基團(tuán)的情況下，其必須被理解為在cys烷基化之前是半胱氨酸的巰基基團(tuán)的一部分的硫原子。

在另一實(shí)施方案中，通過(guò)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)激活側(cè)鏈，該馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)在形成共價(jià)巰基-碳鍵的條件下與半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)反應(yīng)。

對(duì)于本文的目的，術(shù)語(yǔ)延長(zhǎng)體和連接體可包括這些分子的未反應(yīng)的形式以及反應(yīng)的形式。從使用該術(shù)語(yǔ)的語(yǔ)境中可以清楚地看出指的是某一種形式還是另一種形式。

在一個(gè)方面，每個(gè)延長(zhǎng)體包含化學(xué)式1的延長(zhǎng)體或由化學(xué)式1的延長(zhǎng)體組成：

化學(xué)式1：hooc-(ch2)x-co-*，

其中x為10-18范圍內(nèi)的整數(shù)。

在備選實(shí)施方案中，延長(zhǎng)體化學(xué)式1選自由化學(xué)式1a、化學(xué)式1b和化學(xué)式1c限定的延長(zhǎng)體：

化學(xué)式1a：hooc-(ch2)x-co-*，

其中x為8-18范圍內(nèi)的整數(shù)，

化學(xué)式1b：hooc-苯-o-(ch2)x-co-*

其中x為8-18范圍內(nèi)的整數(shù)，以及

化學(xué)式1c：ho-s(＝o)2-(ch2)x-co-*

其中x為8-18范圍內(nèi)的整數(shù)。

對(duì)于每一個(gè)不同的化學(xué)式1結(jié)構(gòu)，由x限定的碳鏈的長(zhǎng)度可在8-18之間不等，而如下所述，不同類(lèi)型的延長(zhǎng)體元件可偏好更短或更長(zhǎng)的形式。

在1a的特定實(shí)施方案中，*-(ch2)x-*指直鏈亞烷基，其中x為10-18范圍內(nèi)的整數(shù)，如14-18或如14-16。

在1a的另一特定實(shí)施方案中，*-(ch2)x-*指其中x為16的直鏈亞烷基。該延長(zhǎng)體可被簡(jiǎn)稱為c18二酸，即具有18個(gè)碳原子的脂肪二羧酸。當(dāng)x＝16時(shí)，該連接體元件的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于化學(xué)式1a：

化學(xué)式1a：hooc-(ch2)16-co-*。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該延長(zhǎng)體為化學(xué)式1b。在1b的實(shí)施方案中，*-(ch2)x-*指直鏈亞烷基，其中x為8-14范圍內(nèi)的整數(shù)。在特定實(shí)施方案中，當(dāng)x＝9時(shí)，該連接體元件的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于化學(xué)式1b。

化學(xué)式1b：hooc-苯-o-(ch2)9-co*

在一個(gè)實(shí)施方案中，該延長(zhǎng)體為化學(xué)式1c。在1c的實(shí)施方案中，*-(ch2)x-*指直鏈亞烷基，其中x為10-18范圍內(nèi)的整數(shù)，如12-18或14-18。在1c的特定實(shí)施方案中，當(dāng)x＝15時(shí)，該連接體元件的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于化學(xué)式1c。

化學(xué)式1c：ho-s(＝o)2-(ch2)15-co-*

命名法與本領(lǐng)域常用的命名法一樣，例如在上式中，*-co-*指羰基(*-c(＝o)-*)。例如，在本文的任何通式(r-co-*)(其中r是如每個(gè)通式所定義的)中，r-co-*指r-c(＝o)-*。苯是指化學(xué)式1b中在c1和c4處分別被o-(ch2)x-*和–cooh取代的環(huán)結(jié)構(gòu)。ho-s(＝o)2表示磺酸。

本發(fā)明衍生物的連接體包含以下連接體元件化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中的至少一個(gè)。元件化學(xué)式2和化學(xué)式3都帶有–nh-和co-端，從而允許它們通過(guò)酰胺鍵彼此相連，以及與延長(zhǎng)體或化學(xué)式4的-co-或-nh-連接。

化學(xué)式4具有–nh-端(能夠與化學(xué)式2或化學(xué)式3形成酰胺鍵)和-nh-co-ch2-端，其在未反應(yīng)形式下是能夠與fgf21類(lèi)似物的半胱氨酸的巰基基團(tuán)反應(yīng)的鹵代乙酰胺。

本發(fā)明衍生物的連接體包含以下連接體元件化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中的至少一個(gè)，

其中化學(xué)式2選自：

*-nh-ch(cooh)-(ch2)m-co-*，

*-nh-s(＝o)2-(ch2)m-co-*，

*-nh-(ch2)m-環(huán)己烷-co-*，并且

其中m單獨(dú)選自1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

其中化學(xué)式3為：*-nh-(ch2)2-[o-(ch2)2]k-o-[ch2]n-co-*，其中k為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，并且

其中化學(xué)式4選自：

*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*和

*-nh-ch(cooh)-(ch2)m-nh-co-ch2-*

其中m單獨(dú)選自1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)式2為*-nh-ch(cooh)-(ch2)m-co-*，其中m為1、2或3。在一個(gè)實(shí)施方案中，m為2或3。

在m為2的實(shí)施方案中，連接體元件化學(xué)式2可被稱為化學(xué)式2a，即*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*。連接體元件*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*可被簡(jiǎn)稱為gglu、gammaglu或γ-glu。在gglu中，氨基酸谷氨酸的γ羧基基團(tuán)用于與另一個(gè)連接體元件連接。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，(每一個(gè))gglu連接體元件均為l型。

在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)式2為*-nh-s(＝o)2-(ch2)m-co-*，其中m為1、2或3。在一個(gè)實(shí)施方案中，m為2或3。連接體元件*-nh-s(＝o)2-(ch2)m-co-*為磺酸衍生物，其中羧基基團(tuán)用于與另一個(gè)連接體元件連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，m為3，因而連接體元件化學(xué)式2可被稱為化學(xué)式2b：*-nh-s(＝o)2-(ch2)3-co-*。

在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)式2為*-nh-(ch2)m-環(huán)己烷-co-*，其中m為1、2或3。在一個(gè)實(shí)施方案中，m為2或3。因此，在化學(xué)式2結(jié)構(gòu)中，環(huán)己烷環(huán)在c1和c4處分別被nh-ch2和co取代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，m為1，因而連接體元件化學(xué)式2可被稱為化學(xué)式2c：*-nh-ch2-環(huán)己烷-co-*。該連接體元件還可被稱為trx。

在化學(xué)式3的連接體元件中，“k”和“n”都可在1至5之間不等。當(dāng)k＝n＝1時(shí)，該連接體元件的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于化學(xué)式3a：

在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)式3為化學(xué)式3a：*-nh-(ch2)2-o-(ch2)2-o-ch2-co-*?；瘜W(xué)式3a的連接體元件可被簡(jiǎn)稱為ado(8-氨基-3,6-二氧雜辛酸)，因?yàn)樗莂do的二價(jià)基團(tuán)。

在化學(xué)式4的連接體元件中，“m”可在1至5之間不等。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)式4為*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*，其中m為1、2、3或4。在一個(gè)實(shí)施方案中，m為2或3。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)化學(xué)式4為*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*并且m＝2時(shí)，該連接體元件的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于化學(xué)式4a：*-nh-(ch2)2-nh-co-ch2-*。

在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)式4為*-nh-ch(cooh)-(ch2)m-nh-co-ch2-*，其中m為1、2、3或4。在一個(gè)實(shí)施方案中，m為2或3。在一個(gè)實(shí)施方案中，m為4或5。

當(dāng)化學(xué)式4為*-nh-ch(cooh)-(ch2)m-nh-co-ch2-*并且m＝4時(shí)，該連接體元件的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于化學(xué)式4b：*-nh-ch(cooh)-(ch2)4-nh-co-ch2-*。

本發(fā)明衍生物的連接體可包含這三種不同類(lèi)型的連接體元件中的一種或多種，并且其還可包含每一種單獨(dú)連接體元件的一個(gè)或多個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該連接體僅包含一個(gè)化學(xué)式4元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，該連接體包含化學(xué)式2和化學(xué)式3中每一種的一個(gè)或多個(gè)，以及僅一個(gè)化學(xué)式4元件。

作為非限制性實(shí)例，所述連接體可由經(jīng)由酰胺鍵并按所示順序相互連接的一個(gè)化學(xué)式2元件、兩個(gè)化學(xué)式3a元件和一個(gè)化學(xué)式4元件組成，在該連接體的*-nh端連接至延長(zhǎng)體的co-*，并且在其co-*端連接至fgf21蛋白的位置180或181處的cys殘基的硫原子。因此，化學(xué)式4元件將化學(xué)式2/化學(xué)式3元件的-co-*端與fgf21半胱氨酸類(lèi)似物的硫原子連接。

在進(jìn)一步的實(shí)例中，所述連接體可由經(jīng)由酰胺鍵并按所示順序相互連接的兩個(gè)化學(xué)式2元件(如兩個(gè)化學(xué)式2a元件)、兩個(gè)化學(xué)式3a元件和一個(gè)化學(xué)式4元件組成?；瘜W(xué)式2元件在其*-nh端連接至延長(zhǎng)體的co-*端，而化學(xué)式4在其ch2-*端連接至fgf21蛋白的cys殘基的硫原子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接體與fgf21蛋白的位置167、169、170、171、172、173、173、174、175、180或181處的cys的巰基基團(tuán)相連接。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該連接體與位置180或181處的cys的硫原子相連接。

自不必說(shuō)，僅為了良好的順序：短語(yǔ)“按所示順序”是指，首先提到的連接體元件(在此為化學(xué)式2)的*-nh端與延長(zhǎng)體的co-*端相連接，而最后提到的連接體元件(在此為化學(xué)式4)的co-*端與fgf21蛋白的所述cys殘基的巰基基團(tuán)相連接。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的衍生物選自：

a.化合物13-24

b.化合物35-41和/或

c.化合物43-56。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該衍生物選自化合物13-24。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該衍生物選自化合物13-18。在一個(gè)實(shí)施方案中，該衍生物選自化合物20-24。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該衍生物選自化合物35-41。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該衍生物選自化合物43-56。在一個(gè)實(shí)施方案中，該衍生物選自化合物43-44和46-54。在一個(gè)實(shí)施方案中，該衍生物選自化合物44、47和50-54。

可使用馬來(lái)酰亞胺衍生的連接體元件來(lái)代替化學(xué)式4，其中p和q可在1至5之間不等：

當(dāng)p＝q＝2時(shí)，該連接體元件的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于n-(2-氨基乙基)-3-(-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)丙酰胺：

本發(fā)明的衍生物可以以具有相同的分子式和鍵合原子順序但僅其原子在空間中的三維朝向不同的不同立體異構(gòu)形式存在。在實(shí)驗(yàn)部分中使用標(biāo)準(zhǔn)的命名法，以名稱以及結(jié)構(gòu)的方式說(shuō)明了本發(fā)明的示例衍生物的立體異構(gòu)現(xiàn)象。除非另外說(shuō)明，否則本發(fā)明涉及所請(qǐng)求保護(hù)的衍生物的所有立體異構(gòu)形式。

功能性質(zhì)

本發(fā)明的fgf21衍生物是生物活性的。例如，它們是非常有效，另外或可替代地，它們與fgf受體非常好地結(jié)合。另外或可替代地，它們具有延長(zhǎng)的藥代動(dòng)力學(xué)譜。例如，它們?cè)陟o脈內(nèi)施用至小鼠和/或小型豬時(shí)具有非常長(zhǎng)的終末半衰期。良好效力與長(zhǎng)半衰期的特別組合可能是非常理想的。

另外或可替代地，在與成熟人fgf21的位置167、169、170、171、172、173、173、174、175、180和181之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含本發(fā)明側(cè)鏈的fgf21衍生物出人意料地具有高效力。

根據(jù)第一方面，所述fgf21衍生物具有fgf21活性。例如，本發(fā)明的fgf21衍生物對(duì)人fgf受體有出人意料的良好效力。

在第一特定實(shí)施方案中，效力和/或活性是指體外效力，即在功能性fgf受體試驗(yàn)中的表現(xiàn)，更具體地是指激活人fgf受體的能力。

例如，可在采用表達(dá)人fgf受體(fgfr1c、fgfr2c或fgfr3c)和bkl的全細(xì)胞的試驗(yàn)中確定體外效力。例如，可采用超表達(dá)人β-klotho(bkl)的hek(人胚腎細(xì)胞)測(cè)量人fgf受體的響應(yīng)。hek293細(xì)胞內(nèi)源性地表達(dá)若干種fgf受體，包括fgfr1c和fgfr3c。在用共受體bkl轉(zhuǎn)染之前，這些細(xì)胞對(duì)fgf21是不響應(yīng)的。fgf受體/bkl復(fù)合體的激活導(dǎo)致mapk/erk信號(hào)途徑的激活和erk的磷酸化。在給定時(shí)間點(diǎn)的磷酸化erk(perk)的水平隨fgf21濃度的升高而升高。這種試驗(yàn)的一個(gè)非限制性實(shí)例在實(shí)施例6中描述。

還可在采用小鼠3t3-l1脂肪細(xì)胞的試驗(yàn)中測(cè)定體外效力。例如，可測(cè)試fgf21類(lèi)似物和衍生物增加葡萄糖向脂肪細(xì)胞中的攝入的能力。分化的3t3-l1脂肪細(xì)胞內(nèi)源性地表達(dá)fgfr1c和bkl。在分化前，3t3-l1細(xì)胞對(duì)fgf21是不響應(yīng)的，因?yàn)榉只瘜?dǎo)致共受體bkl的表達(dá)。fgfr1c受體/bkl復(fù)合體的激活增加了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glut1)的表達(dá)，因此fgf21激動(dòng)劑將以劑量響應(yīng)的方式導(dǎo)致吸收進(jìn)脂肪細(xì)胞中的葡萄糖的量增加。

通常使用ec50值作為藥物效力的量度。ec50值是指通過(guò)參考劑量-響應(yīng)曲線，誘導(dǎo)在基線與最大值之間的一半響應(yīng)的所討論化合物的濃度。通俗地說(shuō)，ec50表示觀察到最大效果的50％時(shí)的濃度。本發(fā)明衍生物的體外效力可以如上所述確定，并且確定所討論的衍生物的ec50。ec50值越低，效力越好。

作為非限制性實(shí)例，采用表達(dá)人β-klotho的hek293細(xì)胞測(cè)量的本發(fā)明fgf21衍生物的效力對(duì)應(yīng)于在0％hsa下低于60nm，優(yōu)選低于20nm，或更優(yōu)選低于10nm的ec50(例如，如實(shí)施例6所述確定的)。

作為非限制性實(shí)例，采用3t3-l1脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝入測(cè)量的本發(fā)明fgf21衍生物的效力對(duì)應(yīng)于低于60nm，優(yōu)選低于20nm，或更優(yōu)選低于10nm的ec50(例如，如實(shí)施例7所述確定的)。

作為非限制性實(shí)例，采用3t3-l1脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝入測(cè)量的本發(fā)明fgf21衍生物的功效emax為至少50％，優(yōu)選至少80％，或更優(yōu)選至少90％(例如，如實(shí)施例7所述確定的)。

作為非限制性實(shí)例，采用3t3-l1脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝入測(cè)量的本發(fā)明fgf21衍生物的效力對(duì)應(yīng)于低于60nm，優(yōu)選低于20nm，或更優(yōu)選低于10nm的ec50(例如，如實(shí)施例7所述確定的)，并且采用3t3-l1脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝入測(cè)量的功效emax為至少80％，或更優(yōu)選至少90％(例如，如實(shí)施例7所述確定的)。

在第二個(gè)特定的實(shí)施方案中，效力和/或活性是指體內(nèi)效力。本發(fā)明的蛋白和衍生物在體內(nèi)是有效的，其可以如本領(lǐng)域所知在任何合適的動(dòng)物模型以及臨床試驗(yàn)中確定。

之前已經(jīng)表明，瘦型小鼠中由fgf21誘導(dǎo)的體重減輕對(duì)在肥胖小鼠中的效果有預(yù)示性，因此，瘦型小鼠被認(rèn)為是良好的篩選模型。瘦型c57bl小鼠是合適的動(dòng)物模型的一個(gè)實(shí)例，因此可在這類(lèi)小鼠中體內(nèi)確定體重減輕效果(例如，如實(shí)施例9所述確定的)。

根據(jù)第二方面，本發(fā)明的衍生物是效果延長(zhǎng)的(protracted)。可以在體外估計(jì)和/或從體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究確定延長(zhǎng)性。在存在血清白蛋白的情況下的體外效力(ec50值)的增加指示對(duì)血清白蛋白的親和性，并且代表了用于預(yù)測(cè)測(cè)試物質(zhì)在動(dòng)物模型中延長(zhǎng)的藥代動(dòng)力學(xué)譜的方法?？蓪⒀娱L(zhǎng)性確定為例如在向例如小鼠或小型豬靜脈內(nèi)施用后的終末半衰期(t1/2)。

作為一個(gè)非限制性實(shí)例，本發(fā)明的衍生物在靜脈內(nèi)施用于小鼠后具有至少1小時(shí)、更優(yōu)選至少3小時(shí)或最優(yōu)選至少10小時(shí)的終末半衰期(例如，如實(shí)施例8所述確定的)。

作為另一個(gè)非限制性實(shí)例，本發(fā)明的衍生物在靜脈內(nèi)施用于小型豬后具有至少2小時(shí)、更優(yōu)選至少10小時(shí)、甚至更優(yōu)選至少20小時(shí)或最優(yōu)選至少50小時(shí)的終末半衰期(例如，如實(shí)施例8所述確定的)。

根據(jù)第三方面，本發(fā)明的衍生物是效果延長(zhǎng)的，并且同時(shí)具有非常好的效力。優(yōu)良的效力/結(jié)合與長(zhǎng)半衰期的特別組合可能是非常理想的。

根據(jù)第四方面，本發(fā)明的衍生物具有良好的生物物理學(xué)性質(zhì)。這些性質(zhì)包括但不限于物理穩(wěn)定性和/或溶解度。這些和其他生物物理學(xué)性質(zhì)可使用蛋白化學(xué)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)量。在特定實(shí)施方案中，這些性質(zhì)與成熟人fgf21相比得到改善。

本發(fā)明衍生物的其他特定實(shí)施方案在實(shí)驗(yàn)部分之前的標(biāo)題為“特定實(shí)施方案”的部分中進(jìn)行了描述。

fgf21化合物的生產(chǎn)和純化

蛋白例如fgf21的生產(chǎn)是本領(lǐng)域公知的?？赏ㄟ^(guò)這樣的方法生產(chǎn)fgf21類(lèi)似物，該方法包括在允許表達(dá)fgf21類(lèi)似物的條件下在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼該分子的dna序列并且能夠表達(dá)fgf21類(lèi)似物的宿主細(xì)胞。若干重組方法可用于fgf21及其類(lèi)似物的生產(chǎn)?？捎糜谠诶绱竽c桿菌(escherichiacoli)和釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)等微生物中生產(chǎn)fgf21的方法的實(shí)例在wo12010553中公開(kāi)。

實(shí)驗(yàn)部分中包括制備本發(fā)明的一些衍生物的方法的具體實(shí)例。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)烷基化在半胱氨酸殘基處衍生出fgf21類(lèi)似物。因此，巰基反應(yīng)性側(cè)鏈，如用鹵代乙酰胺制備的側(cè)鏈，可與該fgf21類(lèi)似物反應(yīng)。可在用胱胺保護(hù)半胱氨酸的巰基基團(tuán)的情況下制備fgf類(lèi)似物。若如此，則在將該類(lèi)似物與巰基反應(yīng)性側(cè)鏈反應(yīng)之前，用例如還原劑如磷化氫還原該類(lèi)似物。

本發(fā)明的fgf21類(lèi)似物和衍生物可通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的程序來(lái)純化，包括但不限于色譜法(例如，離子交換色譜法、親和色譜法、疏水性色譜法、色譜聚焦色譜法和大小排阻色譜法)、電泳程序(例如，制備型等電聚焦(ief))、溶解度差異(例如，硫酸銨沉淀)或萃取(參見(jiàn)例如，proteinpurification,j.-c.janson和larsryden編著,vchpublishers,newyork,1989)。

給藥方式

除非另有說(shuō)明或與上下文明顯矛盾，否則術(shù)語(yǔ)“治療”意在包括預(yù)防和最小化所提及的疾病、病癥或病狀(即，“治療”是指預(yù)防性和治療性施用本發(fā)明fgf21衍生物或包含本發(fā)明fgf21衍生物的組合物)。

給藥途徑可以是有效地將本發(fā)明化合物輸送至身體中的所需或適當(dāng)位置的任何途徑，諸如腸胃外，例如皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥?；蛘?，可口服、經(jīng)肺、經(jīng)直腸、經(jīng)皮、經(jīng)頰、舌下或經(jīng)鼻施用本發(fā)明化合物。

藥物組合物

包含本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酰胺或酯和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物可以如本領(lǐng)域已知的那樣制備。

術(shù)語(yǔ)“賦形劑”寬泛地指除活性治療成分以外的任何組分。賦形劑可以是惰性物質(zhì)、無(wú)活性物質(zhì)和/或非醫(yī)藥活性物質(zhì)。

賦形劑可用于各種目的，例如作為載體、媒介物、稀釋劑、片劑助劑和/或用來(lái)改善活性物質(zhì)的給藥和/或吸收。

藥學(xué)活性成分與各種賦形劑的配制是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy(例如第19版(1995)和任何后續(xù)版本)。

包含本發(fā)明fgf21化合物的可注射組合物可采用制藥產(chǎn)業(yè)的常規(guī)技術(shù)來(lái)制備，該常規(guī)技術(shù)包括將成分適當(dāng)溶解并混合以得到所需的終產(chǎn)物。因此，根據(jù)一種程序，將本發(fā)明fgf21化合物溶解在適當(dāng)ph的合適的緩沖液中，從而最小化或避免沉淀。例如通過(guò)過(guò)濾除菌，將可注射組合物制成無(wú)菌的。還可向該組合物中添加抗微生物劑。

組合物可以是穩(wěn)定化的制劑。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定化的制劑”是指具有提高的物理和/或化學(xué)穩(wěn)定性(優(yōu)選兼具)的制劑。通常，直到到達(dá)失效時(shí)間之前，制劑在使用和儲(chǔ)存期間(符合推薦的使用和儲(chǔ)存條件)必須是穩(wěn)定的。

術(shù)語(yǔ)“物理穩(wěn)定性”是指不改變共價(jià)鍵的物理狀態(tài)及其改變，因而指蛋白質(zhì)由于暴露于熱-機(jī)械應(yīng)力和/或與去穩(wěn)定界面和表面(諸如疏水性表面)相互作用而形成無(wú)生物活性和/或不溶的聚集物和/或形成原纖維(fibrillate)的趨勢(shì)?？稍诓煌瑴囟认卤┞队跈C(jī)械/物理應(yīng)力(例如攪動(dòng))不同的時(shí)間段之后，借助于目測(cè)和/或通過(guò)濁度測(cè)量和/或通過(guò)濃度測(cè)量來(lái)評(píng)估水性蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性。或者，可使用蛋白質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài)的光譜劑或探針例如硫代黃素t或“疏水貼片”探針來(lái)評(píng)估物理穩(wěn)定性。

術(shù)語(yǔ)“化學(xué)穩(wěn)定性”是指蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中共價(jià)鍵的化學(xué)(特別是共價(jià)的)變化，其導(dǎo)致形成相比于完整蛋白質(zhì)可能具有降低的生物效能和/或提高的免疫原性效應(yīng)的化學(xué)降解產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)在暴露于不同環(huán)境條件之后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量化學(xué)降解產(chǎn)物的量，例如通過(guò)sec-hplc、rp-hplc、lcms和/或肽作圖，來(lái)評(píng)估化學(xué)穩(wěn)定性。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有改善的物理穩(wěn)定性的fgf21衍生物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有改善的化學(xué)穩(wěn)定性的fgf21衍生物。

聯(lián)合治療

采用本發(fā)明fgf21衍生物進(jìn)行的治療還可以聯(lián)合一種或多種額外的藥理學(xué)活性物質(zhì)，例如選自抗糖尿病劑、抗肥胖劑、食欲調(diào)節(jié)劑、抗高血壓劑、用于治療和/或預(yù)防由糖尿病導(dǎo)致或與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的藥劑，以及用于治療和/或預(yù)防由肥胖癥導(dǎo)致或與肥胖癥相關(guān)的并發(fā)癥和病癥的藥劑。

這些藥理學(xué)活性物質(zhì)的實(shí)例為：glp-1受體激動(dòng)劑、胰島素、dpp-iv(二肽基肽酶-iv)抑制劑、胰淀素(amylin)激動(dòng)劑和瘦蛋白受體激動(dòng)劑。

藥物適應(yīng)癥

本發(fā)明還涉及用作藥物的本發(fā)明衍生物。

在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的衍生物可用于以下醫(yī)學(xué)治療：

(i)預(yù)防和/或治療所有形式的糖尿病，如高血糖癥、2型糖尿病、糖耐量減低、1型糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病、mody(青年成熟發(fā)作型糖尿病)、妊娠糖尿病，和/或減少hba1c

(ii)延緩或預(yù)防糖尿病進(jìn)展，如2型糖尿病的進(jìn)展，延緩糖耐量減低(igt)進(jìn)展成需要胰島素的2型糖尿病，延緩或預(yù)防胰島素抵抗，和/或延緩無(wú)需胰島素的2型糖尿病進(jìn)展成需要胰島素的2型糖尿??；

(iii)改善β-細(xì)胞功能，如減少β-細(xì)胞凋亡、提高β-細(xì)胞功能和/或β-細(xì)胞質(zhì)量，和/或恢復(fù)β-細(xì)胞的葡萄糖敏感性；

(iv)例如通過(guò)減少食物攝入、增加能量消耗、減輕體重、抑制食欲、誘導(dǎo)飽腹感來(lái)預(yù)防和/或治療飲食失調(diào)，如肥胖癥；治療或預(yù)防暴食癥、神經(jīng)性貪食癥和/或由抗精神病藥或類(lèi)固醇給藥誘發(fā)的肥胖癥；和/或預(yù)防和/或治療肥胖癥的共病，如骨關(guān)節(jié)炎和/或尿失禁；

(v)預(yù)防和/或治療糖尿病并發(fā)癥，如腎??；

(vi)改善脂質(zhì)參數(shù)，如預(yù)防和/或治療血脂異常、降低總血清脂質(zhì)；增加hdl；降低小而密的ldl；降低vldl；降低甘油三酯；降低膽固醇；降低人的脂蛋白a(lp(a))血漿水平；在體外和/或體內(nèi)抑制載脂蛋白a(apo(a))的生成；

(vii)預(yù)防和/或治療心血管疾病，如綜合征x、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、冠心病、再灌注損傷、中風(fēng)、腦缺血、早期心臟病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠狀動(dòng)脈病、高血壓、原發(fā)性高血壓、急性高血壓急癥、心肌病、心功能不全、運(yùn)動(dòng)不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律不齊、心律失常、暈厥、心絞痛、心臟搭橋和/或支架再閉塞、間歇性跛行(閉塞性動(dòng)脈硬化)、舒張期功能障礙和/或收縮期功能障礙；和/或降低血壓，如降低收縮壓；

(viii)預(yù)防和/或治療肝脂肪變性和非酒精性脂肪性肝病(nafld)；以及/或者

(ix)預(yù)防和/或治療危重病，如治療危重患者、危重病多發(fā)性腎病(cipnp)患者和/或潛在的cipnp患者；預(yù)防危重病或cipnp的進(jìn)展；預(yù)防、治療和/或治愈患者的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(sirs)；預(yù)防或降低患者在住院期間罹患菌血癥、敗血癥和/或膿毒性休克的可能性。

在特定實(shí)施方案中，該適應(yīng)癥選自(i)-(vii)。在另一特定實(shí)施方案中，該適應(yīng)癥選自(i)、(iv)、(vi)和/或(vii)。以下適應(yīng)癥是特別優(yōu)選的：2型糖尿病和/或肥胖癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物用于治療2型糖尿病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物用于治療肥胖癥。

特定實(shí)施方案

以下是本發(fā)明的特定實(shí)施方案：

1.fgf21蛋白的衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酰胺或酯，

其中所述蛋白在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基

其中所述衍生物包含經(jīng)由連接體附接至所述cys殘基的延長(zhǎng)體；

其中該延長(zhǎng)體選自

化學(xué)式1a：hooc-(ch2)x-co-*，

化學(xué)式1b：hooc-苯-o-(ch2)x-co-*以及

化學(xué)式1c：ho-s(＝o)2-(ch2)x-co-*

其中x為8-18范圍內(nèi)的整數(shù)；并且

其中該連接體包含化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中每一種的至少一個(gè)：

其中化學(xué)式2選自：

*-nh-ch(cooh)-(ch2)m-co-*，

*-nh-s(＝o)2-(ch2)m-co-*以及

*-nh-(ch2)m-環(huán)己烷-co-*，

其中m為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，

其中化學(xué)式3為*-nh-(ch2)2-[o-(ch2)2]k-o-[ch2]n-co-*，其中k為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，并且n為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，并且

其中化學(xué)式4選自

*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*和

*-nh-ch(cooh)-(ch2)m-nh-co-ch2-*

其中m為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)；并且

其中化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4經(jīng)由酰胺鍵并按所示順序相互連接，在其*-nh端連接至所述延長(zhǎng)體的co-*端，并在其ch2-*端連接至在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基的硫原子。

2.根據(jù)實(shí)施方案1的衍生物，其中所述蛋白在位置170、171、172、173、174、175、180或位置181處包含cys殘基。

3.根據(jù)實(shí)施方案1的衍生物，其中所述蛋白在位置170、173、174、175、180或位置181處包含cys殘基。

4.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中化學(xué)式2選自：

化學(xué)式2a：*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*，

化學(xué)式2b：*-nh-s(＝o)2-(ch2)3-co-*以及

化學(xué)式2c：*-nh-ch2-環(huán)己烷-co-*。

5.根據(jù)實(shí)施方案1的衍生物，其中化學(xué)式4選自：

化學(xué)式4a：*-nh-(ch2)2-nh-co-ch2-*。

化學(xué)式4b：*-nh-ch(cooh)-(ch2)4-nh-co-ch2-*。

6.fgf21蛋白的衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酰胺或酯，其中所述蛋白包含在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基，以及與成熟人fgf21(seqidno:1)相比的最多30個(gè)氨基酸修飾；

其中所述衍生物包含經(jīng)由連接體附接至所述cys殘基的延長(zhǎng)體；

其中該延長(zhǎng)體選自

化學(xué)式1a：hooc-(ch2)x-co-*，

其中x為10-18范圍內(nèi)的整數(shù)，

化學(xué)式1b：hooc-苯-o-(ch2)x

其中x為8-18范圍內(nèi)的整數(shù)，

以及

化學(xué)式1c：ho-s(＝o)2-(ch2)x

其中x為10-18范圍內(nèi)的整數(shù)，

其中該連接體包含化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中每一種的至少一個(gè)：

化學(xué)式2：*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*，

化學(xué)式3：*-nh-(ch2)2-[o-(ch2)2]k-o-[ch2]n-co-*，以及

化學(xué)式4：*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*，

其中k為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，且m為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)；

并且

其中化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4經(jīng)由酰胺鍵并按所示順序相互連接，在其*-nh端連接至所述延長(zhǎng)體的co-*端，并在其-ch2-*端連接至在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基的硫原子。

7.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中化學(xué)式1選自：

化學(xué)式1a：hooc-(ch2)16-co-*，

化學(xué)式1b：hooc-苯-o-(ch2)9-co-*以及

化學(xué)式1c：ho-s(＝o)2-(ch2)15-co-*

8.fgf21蛋白的衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酰胺或酯，

其中所述蛋白在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基，其中所述衍生物包含經(jīng)由連接體附接至所述cys殘基的延長(zhǎng)體；

其中該延長(zhǎng)體為

化學(xué)式1：hooc-(ch2)x-co-*，

其中x為10-18范圍內(nèi)的整數(shù)；并且

其中該連接體包含化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中每一種的至少一個(gè)：

化學(xué)式2：*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*，

化學(xué)式3：*-nh-(ch2)2-[o-(ch2)2]k-o-[ch2]n-co-*，以及

化學(xué)式4：*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*，

其中k為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，且m為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)；

其中化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4經(jīng)由酰胺鍵并按所示順序相互連接，在其*-nh端連接至所述延長(zhǎng)體的co-*端，并在其ch2-*端連接至在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基的硫原子。

9.fgf21蛋白的衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酰胺或酯，

其中所述蛋白包含在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基，以及與成熟人fgf21(seqidno:1)相比的最多30個(gè)氨基酸修飾；

其中所述衍生物包含經(jīng)由連接體附接至所述cys殘基的延長(zhǎng)體；

其中該延長(zhǎng)體為

化學(xué)式1：hooc-(ch2)x-co-*，

其中x為10-18范圍內(nèi)的整數(shù)；并且

其中該連接體包含化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4中每一種的至少一個(gè)：

化學(xué)式2：*-nh-ch(cooh)-(ch2)2-co-*，

化學(xué)式3：*-nh-(ch2)2-[o-(ch2)2]k-o-[ch2]n-co-*，以及

化學(xué)式4：*-nh-(ch2)m-nh-co-ch2-*，

其中k為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，且m為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)；

其中化學(xué)式2、化學(xué)式3和化學(xué)式4經(jīng)由酰胺鍵并按所示順序相互連接，在其*-nh端連接至所述延長(zhǎng)體的co-*端，并在其ch2-*端連接至在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180或位置181相對(duì)應(yīng)的位置處的cys殘基的巰基基團(tuán)。

10.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述蛋白在與成熟人fgf21(seqidno:1)的位置180相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。

11.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中相比于成熟人fgf21(seqidno:1)，所述蛋白具有最多30個(gè)氨基酸修飾，如25個(gè)氨基酸修飾，如20個(gè)氨基酸修飾，如15個(gè)氨基酸修飾，如10個(gè)氨基酸修飾，如8個(gè)氨基酸修飾，如最多5個(gè)氨基酸修飾。

12.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中相比于成熟人fgf21(seqidno:1)，所述蛋白具有4或5個(gè)氨基酸修飾。

13.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中相比于成熟人fgf21(seqidno:1)，所述蛋白具有4個(gè)氨基酸修飾。

14.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述fgf蛋白與成熟人fgf21(seqidno:1)具有至少80％，如85％，如90％，如95％的同一性。

15.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述fgf蛋白與成熟人fgf21(seqidno:1)具有至少96％，如97％，如98％，如99％的同一性。

16.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述氨基酸改變?cè)谂c成熟人fgf21(seqidno:1)的位置121、168、180或181中的一個(gè)或多個(gè)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處。

17.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述氨基酸改變之一是在與成熟人fgf21(seqidno:1)的n-末端相對(duì)應(yīng)的位置處的ala殘基添加。

18.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述蛋白在所述蛋白的n-末端包含ala。

19.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述蛋白包含121q。

20.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述蛋白包含168l。

21.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述蛋白包含seqidno:8或10的氨基酸序列。

22.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述蛋白具有seqidno:8、10、12、15、16、17、18、19或20的氨基酸序列。

23.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中化學(xué)式1為1a或1c并且x為12-18范圍內(nèi)的整數(shù)。

24.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中化學(xué)式1為1a或1c并且x為14-16范圍內(nèi)的整數(shù)。

25.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中化學(xué)式1為1b并且x為8-12范圍內(nèi)的整數(shù)。

26.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中x為16。

27.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中k為1-2范圍內(nèi)的整數(shù)。

28.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中k為1。

29.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中n為1-2范圍內(nèi)的整數(shù)。

30.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中n為1。

31.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中化學(xué)式4的m為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

32.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中化學(xué)式4的m為2。

33.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述延長(zhǎng)體包含化學(xué)式1a：hooc-(ch2)16-co-*。

34.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述延長(zhǎng)體由化學(xué)式1a：hooc-(ch2)14-co-*組成。

35.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述連接體包含化學(xué)式3a：*-nh-(ch2)2-o-(ch2)2-o-ch2-co-*。

36.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述連接體包含化學(xué)式4a：*-nh-(ch2)2-nh-co-ch2-*。

37.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述連接體由至少一個(gè)化學(xué)式2元件、兩個(gè)化學(xué)式3元件和一個(gè)化學(xué)式4元件組成。

38.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述連接體由一個(gè)化學(xué)式2元件、兩個(gè)化學(xué)式3元件和一個(gè)化學(xué)式4元件組成。

39.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述連接體由兩個(gè)化學(xué)式2元件、兩個(gè)化學(xué)式3元件和一個(gè)化學(xué)式4元件組成。

40.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述連接體由一個(gè)化學(xué)式2元件、兩個(gè)化學(xué)式3a元件和一個(gè)化學(xué)式4a元件組成。

41.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為以下之一：

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(11-羧基十一?；?氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21(化合物13)

；

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21(化合物14)

；

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21(化合物15)

；

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21(化合物16)

；

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(19-羧基十九?；?氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21(化合物17)

；

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180,des181]fgf21(化合物18)

；

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(11-羧基十一?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21(化合物19)

；

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21(化合物20)

；

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21(化合物21)

；

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21(化合物22)

；

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(19-羧基十九?；?氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21(化合物23)

；

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-met[cys181]fgf21(化合物24)

42.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為以下之一：

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21(化合物13)

；

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21(化合物14)

；

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21(化合物15)

；

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21(化合物16)

；

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(19-羧基十九?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21(化合物17)

；

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180,des181]fgf21(化合物18)

43.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物選自化合物13-24和化合物43至56。

44.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物選自化合物35-41。

45.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物選自化合物13-24、35-41和43至56。

46.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物13。

47.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物14。

48.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物15。根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物16。

49.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物17。

50.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物18。

51.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物19。

52.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物20。

53.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物21。

54.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物22。

55.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物23。

56.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物24。

57.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物35。

58.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物36。

59.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物37。

60.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物38。

61.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物39。

62.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物40。

63.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物41。

64.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物43。

65.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物44。

66.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物45。

67.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物46。

68.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物47。

69.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物48。

70.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物49。

71.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物50。

72.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物51。

73.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物53。

74.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物54。

75.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物55。

76.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物為化合物56。

77.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物具有fgf21活性。

78.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述衍生物能夠激活fgf受體。

79.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的衍生物，其中靜脈內(nèi)施用至小型豬后的終末半衰期(t1/2)至少為成熟人fgf21的終末半衰期(t1/2)的20倍。

80.根據(jù)實(shí)施方案1-79中任一項(xiàng)的衍生物，其用作藥物。

81.根據(jù)實(shí)施方案1-79中任一項(xiàng)的衍生物，其用于治療和/或預(yù)防所有形式的糖尿病及相關(guān)疾病如肥胖癥、飲食失調(diào)、心血管疾病、糖尿病并發(fā)癥中的任一種；和/或改善脂質(zhì)參數(shù)、改善β-細(xì)胞功能；和/或延緩或預(yù)防糖尿病進(jìn)展；以及/或者治療和/或預(yù)防肝脂肪變性和非酒精性脂肪性肝病(nafld)的方法。

82.根據(jù)實(shí)施方案1-79中任一項(xiàng)的衍生物在制備藥物中的用途，該藥物用于治療和/或預(yù)防所有形式的糖尿病及相關(guān)疾病，如肥胖癥、飲食失調(diào)、心血管疾病、糖尿病并發(fā)癥；和/或用于改善脂質(zhì)參數(shù)、改善β-細(xì)胞功能；和/或用于延緩或預(yù)防糖尿病進(jìn)展；以及/或者用于治療和/或預(yù)防肝脂肪變性和非酒精性脂肪性肝病(nafld)。

83.通過(guò)施用藥物活性量的根據(jù)實(shí)施方案1-79中任一項(xiàng)的衍生物來(lái)治療或預(yù)防所有形式的糖尿病及相關(guān)疾病，如肥胖癥、飲食失調(diào)、心血管疾病、糖尿病并發(fā)癥；和/或改善脂質(zhì)參數(shù)、改善β-細(xì)胞功能；和/或延緩或預(yù)防糖尿病進(jìn)展；以及/或者治療和/或預(yù)防肝脂肪變性和非酒精性脂肪性肝病(nafld)的方法。

84.fgf21蛋白，其在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180和181之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含野生型氨基酸被半胱氨酸殘基的氨基酸置換。

85.根據(jù)實(shí)施方案83的fgf21蛋白，其中所述fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置170、173、174、180和181之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。

86.根據(jù)實(shí)施方案83的fgf21蛋白，其中所述fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置170、173和174之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。

87.根據(jù)實(shí)施方案83的fgf21蛋白，其中所述fgf21蛋白在與fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置180和181之一相對(duì)應(yīng)的位置處包含cys殘基。

88.根據(jù)實(shí)施方案83的fgf21蛋白，其中除了變異cys殘基之外，所述fgf21蛋白還包含-1ala、121gln和/或168leu。

89.根據(jù)實(shí)施方案83的fgf21蛋白，其中除了在fgf21(1-181)(seqidno:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180和181之一處的cys殘基之外，所述fgf21蛋白還包含-1ala、121gln和/或168leu。

實(shí)施例

縮寫(xiě)列表

acod：氘代丙酮

ado：8-氨基-3,6-二氧雜辛酸

bspp：雙(對(duì)磺酸基苯基)苯基膦二鉀鹽二水合物

dcm：二氯甲烷

dmso：二甲基亞砜

dpbs：dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水

edac：(3-二甲基氨基丙基)乙基碳二亞胺

elsd：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器

fmoc：9h-芴-9-基甲氧羰基

fc：可結(jié)晶片段

glp-1：胰高血糖素樣肽-1

gglu：γ谷氨酸

glut1：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1

hatu：2-(7-氮雜-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽

hepes：4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸

hplc：高效液相色譜法

igg4：免疫球蛋白g4

ibmx：3-異丁基-1-甲基黃嘌呤

iptg：異丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷

lcms：液相色譜質(zhì)譜法

mtt：4-甲基三苯甲基

nmr：核磁共振

otbu：叔丁酯

pbs：磷酸緩沖鹽水

rf：阻滯因數(shù)

rt：保留時(shí)間

rt：室溫

tbu：叔丁基

tctu：o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽

tfa：三氟乙酸

tris：三(羥甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羥甲基丙烷-1,3-二醇

trx：氨甲環(huán)酸

uplc：超高效液相色譜法

zosu：n-(芐氧羰基氧基)琥珀酰亞胺

材料與方法

通用檢測(cè)和表征方法

lcms方法1

將樣品稀釋至約0.2mg/ml并注射至lcms系統(tǒng)，例如3-5μl。lcms儀器由uplc系統(tǒng)和質(zhì)譜儀組成。將類(lèi)似物脫鹽，并且可將其在反相柱(例如，c4、c8、c18柱或前置柱)上分離，并采用乙腈在0.02-0.05％tfa(三氟乙酸)中的線性梯度進(jìn)行分析。應(yīng)該將儀器校準(zhǔn)，并且若可能，通過(guò)使用鎖定質(zhì)量噴霧(lockmassspray)進(jìn)行校準(zhǔn)。生成主色譜峰上的ms譜，并使用去卷積算法重建完整質(zhì)量。

lcms儀器設(shè)置(synapt)的實(shí)例：

正離子模式

3000v毛細(xì)管電位，

30v錐電壓

110℃源溫度，

250℃去溶劑化溫度

25l/h的錐孔氣流。

m/z范圍200-3000

得到去卷積的質(zhì)量。

lcms方法2

系統(tǒng)：agilent1290infinity系列uplc柱：aeriswidepore3.6μxb-c182.1x50mm檢測(cè)器：agilenttechnologieslc/msdtof6230(g6230a)檢測(cè)器設(shè)置

電離方法：agilentjetstream源掃描范圍：m/z最小值100，m/z最大值3200線性反射器模式正模式

條件：線性梯度：5％至95％b梯度運(yùn)行時(shí)間：10分鐘0-8min5-95％b、8-9min95％b、9-9.5min95-5％b9.5-10min5％b流速：0.40ml/min固定柱溫：40℃

洗脫液溶劑a：99.90％h2o，0.02％tfa溶劑b：99.90％ch3cn，0.02％tfa溶劑c：na

結(jié)果說(shuō)明和驗(yàn)證：實(shí)測(cè)質(zhì)量是對(duì)于m<4000的化合物而言的化合物的m/z((m+z)/z)，或者是使用masshunterworkstation軟件版本b.05.00build5.0.519.13sp1(agilent)去卷積所得到的質(zhì)量(平均)。所計(jì)算的質(zhì)量是所需化合物的平均分子量。所計(jì)算的m/z是所需化合物的分子量(m+z)/z。

lcms方法3

系統(tǒng)：agilent1290infinity系列uplc柱：phenomenexaeriswidepore3,6μc450x2.1mm檢測(cè)器：agilenttechnologieslc/msdtof6230(g6230a)

檢測(cè)器設(shè)置：電離方法：agilentjetstream源掃描范圍：m/z最小值100，m/z最大值3200線性反射器模式正模式

條件：分級(jí)梯度：5％至90％b梯度運(yùn)行時(shí)間：10分鐘：0-1min5-20％b、1-7min20-90％b、7-8min90％b8-8.5min90-5％b8.5-10min5％b流速：0.40ml/min固定柱溫：40℃

洗脫液溶劑a：99.90％h2o，0.02％tfa溶劑b：99.90％ch3cn，0.02％tfa溶劑c：na

結(jié)果說(shuō)明和驗(yàn)證：實(shí)測(cè)質(zhì)量是對(duì)于m<4000的化合物而言的化合物的m/z((m+z)/z)，或者是使用masshunterworkstation軟件版本b.05.00build5.0.519.13sp1(agilent)去卷積所得到的質(zhì)量(平均)。所計(jì)算的質(zhì)量是所需化合物的平均分子量。所計(jì)算的m/z是所需化合物的分子量(m+z)/z。

lcms方法4

系統(tǒng)：waters自動(dòng)純化系統(tǒng)

柱：kinetexc184.6mmx50mm

檢測(cè)器：uv：pda，elsd，msmicromassquatromicro

檢測(cè)器設(shè)置：電離方法：es+，掃描范圍100-1000，錐電壓30v，毛細(xì)管電壓300kv，掃描時(shí)間1.3s；pda：210-400nm；elsd：霧化加熱器-冷卻器70％，漂移管57.0℃

條件：線性梯度乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa，梯度運(yùn)行時(shí)間：4.0min，總運(yùn)行時(shí)間：6.0min，流速：1.1ml/min，柱溫：23℃

本發(fā)明化合物的制備

實(shí)施例1：人成熟fgf21的克隆和表達(dá)

人fgf21的dna和氨基酸序列已被例如nishimura等人,biochim.biophys.acta1492(1):203-206(2000)公開(kāi)。這些序列還可從公共數(shù)據(jù)庫(kù)分別通過(guò)登錄號(hào)embl:ab021975和uniprot:q9nsa1獲得。

對(duì)成熟人fgf21蛋白進(jìn)行克隆并在大腸桿菌中表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)蛋白，其沒(méi)有信號(hào)肽，但添加有n-末端甲硫氨酸。更具體地，將編碼成熟人fgf21(在n末端添加了met)的基因序列針對(duì)大腸桿菌表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并克隆到載體pet11c的ndei與bamhi位點(diǎn)之間。這使得fgf21基因處于噬菌體t7啟動(dòng)子的控制下。將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中。挑取單個(gè)菌落，并使其在lb+amp100μg/ml中生長(zhǎng)至od450為0.5。在37℃下用0.3mmiptg誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。通過(guò)超聲處理制備細(xì)胞的粗提取物以供分析fgf21表達(dá)?？捡R斯藍(lán)染色的sds-page顯示出fgf21的成功表達(dá)，主要在沉淀物級(jí)分中鑒別到該fgf21。盡管這樣表達(dá)的metfgf21的計(jì)算分子量為19.5kd，但其作為25kd蛋白在凝膠上遷移，這可能是由于脯氨酸含量高而延緩了該蛋白的移動(dòng)。

在本申請(qǐng)中，metfgf21用作參考化合物。當(dāng)通過(guò)使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)fgf21時(shí)，在fgf21的n-末端引入了甲硫氨酸。然而，不認(rèn)為這會(huì)影響生物活性，因此通常將fgf21和metfgf21二者用作參考化合物。

實(shí)施例2：fgf21類(lèi)似物的克隆和表達(dá)

通過(guò)對(duì)實(shí)施例1所述的fgf21成熟表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行誘變來(lái)制備用于表1(實(shí)施例3)中的類(lèi)似物的表達(dá)構(gòu)建體。使用stratagene多位點(diǎn)誘變?cè)噭┖小Ｒ矐?yīng)用與實(shí)施例1中所述相同的表達(dá)條件。考馬斯藍(lán)染色的sds-page顯示出類(lèi)似物的成功表達(dá)。表達(dá)的類(lèi)似物在fgf21序列的n-末端包含二肽met-ala，這允許由于met被大腸桿菌酶切割而表達(dá)出以ala作為n-末端氨基酸殘基的fgf21類(lèi)似物。

實(shí)施例3：成熟fgf21和fgf21類(lèi)似物的純化

為純化實(shí)施例1-2中所述的成熟fgf21和fgf21類(lèi)似物，使用以下過(guò)程或類(lèi)似技術(shù)：

將大腸桿菌細(xì)胞沉淀物重懸在ph6.0的10mm磷酸鉀中，并通過(guò)勻漿器在800巴下破壞兩次。通過(guò)離心(10,000×g，30分鐘)使包涵體沉淀，重溶解在ph8.0的50mmtris中，并任選地添加2m尿素和/或5mm半胱胺，并將漿液在4℃下攪拌過(guò)夜。在上柱之前，再次在10,000×g下將漿液離心30分鐘。將上清液加至陰離子交換色譜柱(qsepharosefastflow樹(shù)脂，gehealthcare)，并用50-250mmnacl洗脫。將0.4m硫酸銨添加至洗脫合并物中，隨后將該洗脫合并物加至在ph8.0的20mmtris、0.4m硫酸銨中平衡的苯基ff柱(gehealthcare)上。用ph8.0的20mmtris、1.5m氯化鈉洗滌該柱，之后用10％tris-氯化物緩沖液(ph8.0的20mmtris，1.5m氯化鈉)洗脫?？蓪?0q柱用于進(jìn)一步的純度精制。通過(guò)sds-page或其他相關(guān)技術(shù)分析終產(chǎn)物。對(duì)于化合物3和5-10，在藥效學(xué)試驗(yàn)期間保留所引入的半胱氨酸的半胱胺保護(hù)。

如上所述制備fgf21類(lèi)似物。對(duì)于所述化合物給出了通過(guò)lcms(采用lcms方法1)測(cè)得的完整質(zhì)量。

表1a.fgf21類(lèi)似物1到10。

表1b.fgf21類(lèi)似物25到32。

實(shí)施例4：用于衍生fgf21類(lèi)似物的試劑的制備

實(shí)施例4.1給出了用于衍生的代表性試劑的制備。實(shí)施例4.2-4.4的試劑通過(guò)實(shí)施例4.1提供的方法制備。實(shí)施例4.5-4.17的試劑通過(guò)與如下所述類(lèi)似的方法制備。

實(shí)施例4.1：15-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲?；鵠甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十五酸的制備

固相合成方案：

經(jīng)2小時(shí)將n-(芐氧羰基氧基)琥珀酰亞胺(zosu，100g，401mmol)在二氯甲烷(500ml)中的溶液逐滴添加至乙二胺(1，189ml，2.81mol)在二氯甲烷(750ml)中的溶液中。30分鐘后，過(guò)濾懸浮液并用二氯甲烷洗滌固體。將濾液蒸發(fā)至干，并用甲苯(1.00l)和水(0.50l)稀釋殘余物。過(guò)濾所得混合物，并分離濾液以得到兩個(gè)相。水相含有產(chǎn)物；因此將其用二氯甲烷(2×250ml)萃取。合并所有有機(jī)相，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并真空濃縮。將殘余物用甲苯(750ml)稀釋并用2m鹽酸水溶液(500ml)和1m鹽酸水溶液(100ml)萃取。合并酸性水相并用氫氧化鈉(60.0g，1.50mol)的水(90ml)溶液堿化。用二氯甲烷(4x200ml)萃取所得混合物，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，真空濃縮，并用己烷(200ml)稀釋。向該溶液中加入在醚中的4m氯化氫溶液(100ml，400mmol)，真空濃縮所得懸浮液，并用己烷(1.00l)稀釋。將沉淀的固體過(guò)濾，用己烷洗滌，并真空干燥，以得到呈白色粉末的(2-氨基-乙基)-氨基甲酸芐酯鹽酸鹽。

產(chǎn)率：62.62g(68％)。

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇4:1)：0.25(游離堿)。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,80℃,dh):7.42-7.26(m,5h)；5.16(s,2h)；3.60(t,j＝5.7hz,2h)；3.32(t,j＝5.7hz,2h)。

使2-氯三苯甲基樹(shù)脂100-200目1.7mmol/g(3，40.1g，68.1mmol)在無(wú)水二氯甲烷(250ml)中溶脹20分鐘。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-ado-oh，17.5g，45.4mmol)和n,n-二異丙基乙胺(30.1ml，173mmol)在無(wú)水二氯甲烷(50ml)中的溶液，并將該混合物振搖5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二異丙基乙胺(15.8ml，90.8mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，250ml，2x5min)中的溶液處理。然后用n,n-二甲基甲酰胺(2×250ml)、二氯甲烷(2×250ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×250ml)洗滌樹(shù)脂。通過(guò)用含20％哌啶的二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×250ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×250ml)、2-丙醇(2×250ml)和二氯甲烷(300ml，2×250ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-ado-oh，26.3g，68.1mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，24.2g，68.1mmol)和n,n-二異丙基乙胺(21.4ml，123mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(140ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×250ml)、二氯甲烷(2×250ml)和n,n-二甲基甲酰胺(250ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×250ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×250ml)、2-丙醇(2×250ml)和二氯甲烷(300ml，2×250ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-glu-otbu，29.0g，68.1mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，24.2g，68.1mmol)和n,n-二異丙基乙胺(21.4ml，123mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(140ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×250ml)、二氯甲烷(2×250ml)和n,n-二甲基甲酰胺(250ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×250ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×250ml)、2-丙醇(2×250ml)和二氯甲烷(300ml，2×250ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入16-(叔丁氧基)-16-氧代十六酸(23.3g，68.1mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，24.2g，68.1mmol)和n,n-二異丙基乙胺(21.4ml，123mmol)在n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷混合物(4:1，200ml)中的溶液。將樹(shù)脂振搖1小時(shí)，過(guò)濾，并用n,n-二甲基甲酰胺(3×250ml)、二氯甲烷(2×250ml)、甲醇(2×250ml)和二氯甲烷(350，6×250ml)洗滌。通過(guò)用2,2,2-三氟乙醇(250ml)處理18小時(shí)從樹(shù)脂上切下產(chǎn)物。濾出樹(shù)脂并用二氯甲烷(2×250ml)、2-丙醇/二氯甲烷混合物(1:1，2×250ml)、2-丙醇(250ml)和二氯甲烷(3×250ml)洗滌。合并溶液；蒸發(fā)溶劑，并通過(guò)急驟柱色譜法(silicagel60，0.040-0.060mm；洗脫液：二氯甲烷/甲醇1:0-9:1)純化粗產(chǎn)物。純(s)-22-(叔丁氧羰基)-41,41-二甲基-10,19,24,39-四氧代-3,6,12,15,40-五氧雜-9,18,23-三氮雜四十二烷酸在真空中干燥，并獲得淡黃色粘稠黃色油。

產(chǎn)率：30.88g(83％)。

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇4:1)：0.30。

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.36(t,j＝5.7hz,1h)；7.02(t,j＝5.4hz,1h)；6.55(d,j＝7.7hz,1h)；4.46(m,1h)；4.18(s,2h)；4.02(s,2h)；3.83-3.36(m,16h)；2.44-2.12(m,7h)；2.02-1.86(m,1h)；1.60(m,4h)；1.47(s,9h)；1.45(s,9h)；1.36-1.21(m,20h)。

lc-ms方法4：

純度：100％

rt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％fa)：3.60min。

實(shí)測(cè)m/z,z＝1:818.7(m+h)+

隨后將2-(7-氮雜-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(hatu，11.4g，30.1mmol)和三乙胺(8.77ml，62.9mmol)添加至(s)-22-(叔丁氧羰基)-41,41-二甲基-10,19,24,39-四氧代-3,6,12,15,40-五氧雜-9,18,23-三氮雜四十二烷酸(22.4g，27.4mmol)在無(wú)水二氯甲烷(110ml)中的溶液中。向(2-氨基-乙基)-氨基甲酸芐酯鹽酸鹽(6.94g，30.1mmol)在無(wú)水二氯甲烷(165ml)中的懸浮液中加入三乙胺(5.72ml，41.0mmol)，并將所得混合物加入上述溶液中。將混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，然后將其蒸發(fā)至干。將殘余物再溶解于乙酸乙酯(500ml)中；用1m鹽酸水溶液(2×200ml)、5％碳酸鈉水溶液(2×200ml，極慢的相分離)、1m鹽酸水溶液(8×200ml)和鹽水洗滌；經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，并真空蒸發(fā)至干。殘余物通過(guò)急驟柱色譜法純化(silicagel60，0.040-0.060mm；洗脫液：二氯甲烷/甲醇95:5)，得到呈淡黃色粘稠油的15-[(s)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-芐氧羰基氨基-乙基氨基甲酰基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基氨基甲?；?-甲氧基]-乙氧基}-乙基氨基甲?；?-1-叔丁氧羰基-丙基氨基甲?；鵠-十五酸叔丁酯。

產(chǎn)率：23.84g(88％)

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.35

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.39-7.26(m,6h)；7.19(t,j＝6.3hz,1h)；6.91(t,j＝5.7hz,1h)；6.52(d,j＝7.5hz,1h)；5.83(t,j＝5.5hz,1h)；5.09(s,2h)；4.41(ddd,j＝12.3,4.6和4.3hz,1h)；3.99(s,2h)；3.97(s,2h)；3.71-3.30(m,20h)；2.33-2.08(m,7h)；1.97-1.83(m,1h)；1.67-1.51(m,4h)；1.45(s,9h)；1.44(s,9h)；1.35-1.20(m,20h)。

lcms方法4

純度：100％

rt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％fa)：4.18min

實(shí)測(cè)m/z,z＝1:994.9(m+h)+

將碳載鈀(10％，1.27g，1.20mmol)添加至上述化合物(23.8g，24.0mmol)在甲醇(350ml)中的溶液中，并將所得混合物在正常壓力下氫化4小時(shí)。濾出催化劑并將濾液蒸發(fā)至干。將殘余物從二氯甲烷中蒸發(fā)數(shù)次以除去甲醇?xì)堄辔?，并真空干燥，以產(chǎn)生呈粘稠無(wú)色油的(s)-1-氨基-25-(叔丁氧羰基)-4,13,22,27-四氧代-6,9,15,18-四氧雜-3,12,21,26-四氮雜四十二烷-42-酸叔丁酯。

產(chǎn)率：20.50g(99％)。

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.05。

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.54(t,j＝5.7hz,1h)；7.41(t,j＝5.6hz,1h)；7.14(t,j＝5.5hz,1h)；6.68(d,j＝7.5hz,1h)；5.25(bs,2h)；4.39(td,j＝8.3和4.2hz,1h)；4.01(s,4h)；3.74-3.39(m,18h)；2.96(t,j＝5.7hz,2h)；2.34-2.06(m,7h)；1.97-1.83(m,1h)；1.68-1.50(m,4h)；1.45(s,9h)；1.43(s,9h)；1.37-1.19(m,20h)。

lcms方法4

純度：100％

rt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％fa)：1.43min

實(shí)測(cè)m/z,z＝1:860.8(m+h)+

在-30℃和氬氣下，將n,n-二異丙基乙胺(4.98ml，28.6mmol)添加至上述胺(6，20.5g，23.8mmol)在無(wú)水二氯甲烷(290ml)中的溶液中。逐滴加入溴乙酰溴(2.48ml，28.6mmol)，并將所得溶液在-30℃下攪拌另外3小時(shí)。移除冷卻浴，將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后真空除去溶劑。將殘余物再溶解于乙酸乙酯(450ml)中，并用5％檸檬酸水溶液(300ml)洗滌。在1小時(shí)內(nèi)分離各相。用水(300ml)洗滌有機(jī)層，使所得乳液分離過(guò)夜以得到3個(gè)相。除去澄清水層，并振搖其余2個(gè)相，加入溴化鉀飽和水溶液(100ml)。使相分離過(guò)夜，然后除去水相，將有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥。真空除去溶劑，并將殘余物通過(guò)急驟柱色譜法純化(silicagel60，0.040-0.060mm；洗脫液：二氯甲烷/甲醇95:5)，得到呈無(wú)色固體的(s)-1-溴-28-(叔丁氧羰基)-2,7,16,25,30-五氧代-9,12,18,21-四氧雜-3,6,15,24,29-五氮雜四十五烷-45-酸叔丁酯。

產(chǎn)率：19.46g(83％)。

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.25

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.46(m,1h)；7.33(t,j＝5.9hz,1h)；7.21(t,j＝5.1hz,1h)；6.92(t,j＝5.2hz,1h)；6.50(d,j＝7.5hz,1h)；4.41(ddd,j＝12.2,4.5和4.2hz,1h)；4.01(s,4h),3.85(s,2h)；3.75-3.40(m,20h),2.36-2.08(m,7h)；1.99-1.84(m,1h)；1.68-1.51(m,4h),1.46(s,9h)；1.44(s,9h)；1.38-1.19(m,20h)

lcms方法4

純度：100％

rt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％fa)：3.51min。

實(shí)測(cè)：m/z,z＝1:980.9,982.9(m+h)+

將上述化合物(19.5g，19.8mmol)溶解在三氟乙酸(120ml)中，并將所得溶液在室溫下攪拌1.5小時(shí)。真空除去三氟乙酸，并將殘余物從二氯甲烷(6×200ml)中蒸發(fā)。向油狀殘余物中加入二乙醚(200ml)，并將混合物攪拌過(guò)夜以得到懸浮液。將固體產(chǎn)物過(guò)濾，用二乙醚和己烷洗滌，并真空干燥，得到呈白色粉末的標(biāo)題產(chǎn)物15-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲?；鵠甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲?；鶀十五酸。

產(chǎn)率：16.74g(97％)。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,dh):4.61(dd,j＝8.8和4.8hz,1h)；4.12(s,2h),4.10(s,2h)；3.96(s,2h)；3.77-3.39(m,20h),2.49-2.18(m,7h)；2.16-1.04(m,1h)；1.71-1.56(m,4h),1.30(bs,20h)

lcms方法4：

純度：100％

rt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％fa)：3.51min

理論m/z,z＝1:869.8,實(shí)測(cè)：m/z,z＝1:868.7,870.7

實(shí)施例4.2：11-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲?；鵠甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲酰基}十一酸的制備

11-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十一酸通過(guò)與實(shí)施例4.1所述相同的方法制備，得到粘稠橙色油。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,dh):4.61(dd,j＝8.9和4.9hz,1h)；4.13(s,2h)；4.10(s,2h)；3.96(s,2h)；3.79-3.38(m,20h)；2.50-2.16(m,7h)；2.16-2.00(m,1h)；1.72-1.56(m,4h)；1.42-1.24(m,12h)

lcms方法4:

純度：100％(elsd)

rt(kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa)：2.74min

理論，m/z,z＝1:813.8,實(shí)測(cè)m/z,z＝1:812.0,814.0

實(shí)施例4.3：13-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十三酸的制備

13-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十三酸通過(guò)與實(shí)施例4.1所述相同的方法制備，得到粘稠黃色油。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,dh):4.61(dd,j＝8.9和4.9hz,1h)；4.13(s,2h)；4.11(s,2h)；3.96(s,2h)；3.77-3.40(m,20h)；2.49-2.18(m,7h)；2.16-2.07(m,1h)；1.70-1.56(m,4h)；1.31(bs,16h)。

lcms方法4：

純度：100％(elsd)

rt(kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa)：2.94min

理論m/z,z＝1:841.9,實(shí)測(cè)：m/z,z＝1:841.7,843.7

實(shí)施例4.4：19-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；?氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十九酸的制備

19-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十九酸通過(guò)與實(shí)施例4.1所述相同的方法制備，得到米色粉末。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,dh):4.65-4.57(m,1h)；4.13(s,2h)；4.10(s,2h)；3.96(s,2h)；3.77-3.43(m,20h)；2.49-2.40(t,j＝7.3hz,2h)；2.39-2.23(m,5h)；2.17-2.07(m,1h)；1.68-1.57(m,4h)；1.30(bs,28h)

lcms方法4:

純度：100％(elsd)

rt(kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％fa)：2.17min

理論質(zhì)量：926.0,實(shí)測(cè)m/z:926(m+h)+

實(shí)施例4.5：18-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸的制備

溶液相合成方案：

步驟1：18-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-芐氧羰基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸芐酯

經(jīng)75min向0℃的乙二胺(8.5ml)在dcm(80ml)和三乙胺(5.2ml)中的溶液中逐滴加入如wo10029159所述制備的18-[[(1s)-1-芐氧羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸芐酯(26g)在dcm(320ml)中的溶液。攪拌2h后濾出沉淀物。向?yàn)V液中加水(200ml)和異丙醇(50ml)。萃取該混合物，用mgso4將有機(jī)層干燥。通過(guò)過(guò)濾除去mgso4，并將濾液真空干燥以得到標(biāo)題化合物20.07g(81％)lcms：理論質(zhì)量：956.2；實(shí)測(cè)m/z,z＝1:957.0

步驟2：18-[[(1s)-1-芐氧羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸芐酯

將氯乙酸(0.19g)溶解在dcm(15ml)中。加入n-羥基琥珀酰亞胺(0.22g)和edachcl(0.42g)。攪拌2.5h后，加入在dcm(5ml)中的18-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-芐氧羰基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸芐酯(1.5g)。在室溫下攪拌過(guò)夜后，用1mhcl(2×20ml)和水/鹽水2:1(30ml)萃取該混合物。將有機(jī)層干燥(mgso4)，過(guò)濾，并真空濃縮，以得到澄清的油，1.37g(84％)

lcms：理論質(zhì)量：1032.7；實(shí)測(cè)m/z,z＝1:1033.1

步驟3:18-[[(1s)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸

在通氮?dú)夂笙?8-[[(1s)-1-芐氧羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸芐酯(10.5g)在丙酮(140ml)中的溶液中加入10％pd/c(1.0g)。在氫化6h后，將混合物加熱至40-50℃，然后過(guò)濾。分離在冷濾液中的沉淀物，并用丙酮洗滌并干燥，以得到標(biāo)題化合物，7.42g(85％)。

步驟4:8-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸。

向18-[[(1s)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸在丙酮(60ml)中的懸浮液中加入溴化鈉(5當(dāng)量，1.21g)。將混合物在室溫下避光攪拌。2h后再加入溴化鈉(10當(dāng)量，2.41g)。2天后再加入溴化鈉(5當(dāng)量，1.21g)。5天后濃縮該混合物。向殘余物的一半中添加dcm(30ml)、10％抗壞血酸(20ml)和水30ml。向乳液中加入異丙醇(50ml)和水(30ml)。分離有機(jī)相，并用10％抗壞血酸(20ml)和異丙醇(10ml)的混合物洗滌兩次。將有機(jī)層干燥(mgso4)，過(guò)濾，并濃縮，以得到固體油，將其在丙酮中結(jié)晶并通過(guò)過(guò)濾分離，以得到摻雜有起始材料的標(biāo)題化合物，0.80g(72％)。

lcms：理論質(zhì)量：896.9。實(shí)測(cè)m/z,z＝1:898.9(m+1)

實(shí)施例4.6：12-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲?；鵠環(huán)己基]甲基氨基]-12-氧代-十二酸的制備

固相合成方案：

使2-氯三苯甲基樹(shù)脂100-200目1.8mmol/g(1，11.9g，21.4mmol)在無(wú)水二氯甲烷(80ml)中溶脹20分鐘。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，5.50g，14.3mmol)和n,n-二異丙基乙胺(9.44ml，54.2mmol)在無(wú)水二氯甲烷(70ml)中的溶液，并將該混合物振搖4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二異丙基乙胺(4.97ml，28.5mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，2×5min，2×57ml)中的溶液處理。然后用n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)、二氯甲烷(2×80ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)洗滌樹(shù)脂。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×80ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)、2-丙醇(2×80ml)和二氯甲烷(100ml，2×80ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，11.0g，28.5mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，10.1g，28.5mmol)和n,n-二異丙基乙胺(9.93ml，57.0mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(80ml)中的溶液，并將該混合物振搖2小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)、二氯甲烷(2×80ml)和n,n-n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×80ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)、2-丙醇(2×80ml)和二氯甲烷(100ml，2×80ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu，9.11g，21.4mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，7.60g，21.4mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.71ml，38.5mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(80ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)、二氯甲烷(2×80ml)和n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×80ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)、2-丙醇(2×80ml)和二氯甲烷(100ml，2×80ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入4-[(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)甲基]環(huán)己烷羧酸(fmoc-trx-oh，9.11g，21.4mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，7.60g，21.4mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.71ml，38.5mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(80ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)、二氯甲烷(2×80ml)和n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×80ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)、2-丙醇(2×80ml)和二氯甲烷(100ml，2×80ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入十二烷二酸單叔丁酯(c12(otbu)-oh，6.13g，21.4mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，7.61g，21.4mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.71ml，38.5mmol)在二氯甲烷/n,n-二甲基甲酰胺混合物(4:1，80ml)中的溶液，并將該混合物振搖1.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(6×80ml)、二氯甲烷(4×80ml)、甲醇(4×80ml)和二氯甲烷(7×80ml)洗滌。通過(guò)用2,2,2-三氟乙醇(80ml)處理18小時(shí)從樹(shù)脂上切下產(chǎn)物。濾出樹(shù)脂并用二氯甲烷(4×80ml)、二氯甲烷/2-丙醇混合物(1:1，4×80ml)、2-丙醇(2×80ml)和二氯甲烷(6×80ml)洗滌。合并溶液；蒸發(fā)溶劑，并通過(guò)柱色譜法(silicagel60，0.040-0-063mm；洗脫液：二氯甲烷/甲醇1:0-9:1)純化粗產(chǎn)物。將純產(chǎn)物(2)真空干燥并獲得油狀物。

產(chǎn)率：5.40g(42％)。

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.30。

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.45-7.31(m,1h)；7.10-6.97(m,1h)；6.71-6.60(m,1h)；5.70-5.58(m,1h)；4.43-4.31(m,1h)；4.15(s,2h)；4.01(s,2h)；3.79-3.31(m,16h)；3.13-3.08(m,2h)；2.28-1.79(m,11h)；1.71-1.51(m,4h)；1.46(s,9h)；1.44(s,9h)；1.25(bs,12h)；1.05-0.88(m,2h)。

lc-ms純度：100％。

lc-msrt(sunfire4.6mm×100mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％fa)：2.16min。

lc-msm/z:903.0(m+h)+。

隨后將2-(7-氮雜-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(hatu，2.46g，6.48mmol)和三乙胺(1.89ml，13.6mmol)添加至來(lái)自以上的油(2，5.31g，5.89mmol)在無(wú)水二氯甲烷(23ml)中的溶液中。將三乙胺(1.36ml，9.72mmol)添加至(2-氨基-乙基)-氨基甲酸芐酯鹽酸鹽(3，1.49g，6.48mmol)在無(wú)水二氯甲烷(35ml)中的懸浮液中，并將所得混合物添加至上述溶液中。將混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，然后將其蒸發(fā)至干。將殘余物再溶解于乙酸乙酯(70ml)中；用1m鹽酸水溶液(1×70ml)、5％碳酸鈉水溶液(2×70ml)、1m鹽酸水溶液(4×70ml)和鹽水(70ml)洗滌；經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥并蒸發(fā)。殘余物通過(guò)急驟柱色譜法純化(silicagel60，0.040-0-063mm；洗脫液：二氯甲烷/甲醇95:5至92:8)，得到粘稠黃色油。

產(chǎn)率：2.81g(44％)。

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.25。

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.41-7.29(m,6h)；7.22-7.13(m,1h)；6.93-6.81(m,1h)；6.62-6.58(m,1h)；5.90-5.81(m,1h)；5.68-5.55(m,1h)；5.09(s,2h)；4.42-4.33(m,1h)；4.01-3.95(m,4h)；3.75-3.30(m,20h)；3.14-3.06(m,2h)；2.31-2.01(m,11h)；1.97-1.76(m,1h)；1.65-1.52(m,4h)；1.46(s,9h)；1.44(s,9h)；1.27(bs,12h)；1.04-0.87(m,2h)。

將碳載鈀(10％，0.15g，0.13mmol)添加至上述化合物(2.81g，2.60mmol)在甲醇(43ml)中的溶液中，并將所得混合物在正常壓力下氫化2.5小時(shí)。濾出催化劑并將濾液蒸發(fā)至干。殘余物與甲苯共蒸發(fā)四次并真空干燥，產(chǎn)生化合物5。

產(chǎn)率：2.01g(81％)。

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.51-7.36(m,2h)；7.04-6.96(m,1h)；6.76-6.66(m,1h)；5.93-5.85(m,1h)；4.41-4.29(m,1h)；4.03-3.99(m,4h)；3.73-3.25(m,18h)；3.13-2.97(m,4h)；2.34-1.78(m,11h)；1.67-1.51(m,4h)；1.46(s,9h)；1.44(s,9h)；1.30(m,12h)；1.04-0.88(m,2h)。

lc-ms純度：100％(elsd)。

lc-msrt(kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水70:30至100:0+0.1％tfa)：0.67min。

lc-msm/z:945.0(m+h)+。

在-30℃和氬氣下，將n,n-二異丙基乙胺(0.40ml，2.28mmol)添加至上述胺(5，1.79g，1.90mmol)在無(wú)水二氯甲烷(30ml)中的溶液中。逐滴加入溴乙酰溴(0.20ml，2.28mmol)，并將所得溶液在-30℃下攪拌3小時(shí)。移除冷卻浴，并將混合物在室溫下攪拌另外1小時(shí)，然后使其蒸發(fā)至干。將殘余物再溶解于乙酸乙酯(50ml)中，用5％檸檬酸水溶液(3×50ml，極慢的相分離)、1m鹽酸水溶液(4×50ml)和鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)。殘余物通過(guò)急驟柱色譜法純化(silicagel60，0.040-0-063mm；洗脫液：二氯甲烷/甲醇95:5至93:7)，得到黃色油。

產(chǎn)率：1.63g(80％)。

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇95:5)：0.25。

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.56-7.48(m,1h)；7.43-7.34(m,1h)；7.04-6.95(m,1h)；6.62(d,j＝7.9hz,1h)；5.74-5.63(m,1h)；4.43-4.33(m,1h)；4.02(s,4h)；3.85(s,2h)；3.73-3.40(m,20h)；3.14-3.09(m,2h)；2.34-2.04(m,9h)；1.97-1.76(m,4h)；1.68-1.51(m,7h)；1.46(s,9h)；1.44(s,9h)；1.27(m,12h)；1.07-0.90(m,2h)。

lc-ms純度：100％(elsd)。

lc-msrt(kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％fa)：2.16min。

lc-msm/z:1066.0(m+h)+。

將上述化合物(1.53g，1.44mmol)溶解在三氟乙酸(25ml)中并放置1.5小時(shí)。真空除去三氟乙酸，殘余物與甲苯共蒸發(fā)三次并與二氯甲烷共蒸發(fā)十次，得到黃色油狀固體。

產(chǎn)率：810mg(59％)。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,dh):4.64-4.54(m,1h)；4.13(s,2h)；4.11(s,2h)；3.96(s,2h)；3.78-3.40(m,20h)；3.13-3.10(d,j＝6.6hz,2h)；2.51-2.19(m,9h)；1.94-1.77(m,4h)；1.68-1.41(m,7h)；1.31(bs,12h)；1.10-0.92(m,2h)。

lc-ms純度：100％(elsd)。

lc-msrt(kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa)：2.82min。

lc-msm/z:952.0(m+h)+。

實(shí)施例4.7：16-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲?；鵠環(huán)己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸的制備

固相合成方案：

使2-氯三苯甲基樹(shù)脂100-200目1.8mmol/g(1，11.9g，21.4mmol)在無(wú)水二氯甲烷(80ml)中溶脹20分鐘。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，5.50g，14.3mmol)和n,n-二異丙基乙胺(9.44ml，54.2mmol)在無(wú)水二氯甲烷(70ml)中的溶液，并將該混合物振搖4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二異丙基乙胺(4.97ml，28.5mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，2×5min，2×57ml)中的溶液處理。然后用n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)、二氯甲烷(2×80ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)洗滌樹(shù)脂。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×80ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)、2-丙醇(2×80ml)和二氯甲烷(100ml，2×80ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，11.0g，28.5mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，10.1g，28.5mmol)和n,n-二異丙基乙胺(9.93ml，57.0mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(80ml)中的溶液，并將該混合物振搖2小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)、二氯甲烷(2×80ml)和n,n-n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×80ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)、2-丙醇(2×80ml)和二氯甲烷(100ml，2×80ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu，9.11g，21.4mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，7.60g，21.4mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.71ml，38.5mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(80ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)、二氯甲烷(2×80ml)和n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×80ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)、2-丙醇(2×80ml)和二氯甲烷(100ml，2×80ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入fmoc-氨甲環(huán)酸(fmoc-trx-oh，9.11g，21.4mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，7.60g，21.4mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.71ml，38.5mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(80ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)、二氯甲烷(2×80ml)和n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×80ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)、2-丙醇(2×80ml)和二氯甲烷(100ml，2×80ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入十六烷二酸單叔丁酯(c16(otbu)-oh，7.33g，21.4mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，7.61g，21.4mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.71ml，38.5mmol)在二氯甲烷/n,n-二甲基甲酰胺混合物(4:1，80ml)中的溶液，并將該混合物振搖1.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(6×80ml)、二氯甲烷(4×80ml),甲醇(4×80ml)和二氯甲烷(7×80ml)洗滌。通過(guò)用2,2,2-三氟乙醇(80ml)處理18小時(shí)從樹(shù)脂上切下產(chǎn)物。濾出樹(shù)脂并用二氯甲烷(4×80ml)、二氯甲烷/2-丙醇混合物(1:1，4×80ml)、2-丙醇(2×80ml)和二氯甲烷(6×80ml)洗滌。合并溶液；蒸發(fā)溶劑，并通過(guò)柱色譜法(silicagel60，0.040-0-063mm；洗脫液：二氯甲烷/甲醇1:0-9:1)純化粗產(chǎn)物。將中間體(2)真空干燥并獲得油狀物。

產(chǎn)率：8.20g(80％)。

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.20。

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.44-7.33(m,1h)；7.07-6.97(m,1h)；6.72-6.63(m,1h)；5.70-5.59(m,1h)；4.44-4.33(m,1h)；4.15(s,2h)；4.01(s,2h)；3.76-3.32(m,16h)；3.14-3.07(m,2h)；2.38-1.77(m,11h)；1.71-1.50(m,4h)；1.46(s,9h)；1.44(s,9h)；1.25(bs,20h)；1.05-0.87(m,2h)。

lc-ms純度：100％。

lc-msrt(sunfire4.6mm×100mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％fa)：3.56min。

lc-msm/z:959.0(m+h)+。

隨后將2-(7-氮雜-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(hatu，3.55g，9.34mmol)和三乙胺(2.72ml，19.5mmol)添加至中間體2(8.13g，8.49mmol)在無(wú)水二氯甲烷(34ml)中的溶液中。將三乙胺(1.78ml，12.7mmol)添加至(2-氨基-乙基)-氨基甲酸芐酯鹽酸鹽(2.15g，9.34mmol)在無(wú)水二氯甲烷(51ml)中的懸浮液中，并將所得混合物添加至上述溶液中。將混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，然后將其蒸發(fā)至干。將殘余物再溶解于乙酸乙酯(150ml)；用1m鹽酸水溶液(1×100ml)、5％碳酸鈉水溶液(2×100ml)、1m鹽酸水溶液(4×100ml)和鹽水洗滌；經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥并蒸發(fā)。殘余物通過(guò)急驟柱色譜法純化(silicagel60，0.040-0-063mm；洗脫液：二氯甲烷/甲醇95:5至92:8)，得到呈粘稠黃色油的化合物4。

產(chǎn)率：5.59g(58％)。

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.20。

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.41-7.31(m,6h)；7.21-7.12(m,1h)；6.92-6.83(m,1h)；6.58-6.52(m,1h)；5.89-5.79(m,1h)；5.62-5.51(m,1h)；5.10(s,2h)；4.43-4.32(m,1h)；4.05-3.92(m,4h)；3.75-3.30(m,20h)；3.15-3.07(m,2h)；2.33-2.03(m,11h)；1.97-1.68(m,1h)；1.67-1.51(m,4h)；1.45(s,9h)；1.44(s,9h)；1.26(bs,20h)；1.05-0.87(m,2h)。

lc-ms純度：100％(elsd)。

lc-msrt(kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水70:30至100:0+0.1％tfa)：1.41min。

lc-msm/z:1136.0(m+h)+。

將碳載鈀(10％，0.27g，0.24mmol)添加至上述化合物(4，5.59g，4.93mmol)在甲醇(85ml)中的溶液中，并將所得混合物在正常壓力下氫化2.5小時(shí)。濾出催化劑并將濾液蒸發(fā)至干。殘余物與甲苯共蒸發(fā)四次并真空干燥，產(chǎn)生化合物5。

產(chǎn)率：3.45g(70％)。

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.43-7.33(m,2h)；7.05-6.94(m,1h)；6.72-6.65(m,1h)；5.69-5.59(m,1h)；4.44-4.33(m,1h)；4.03-3.98(m,4h)；3.72-3.39(m,18h)；3.15-3.07(m,2h)；2.96-2.90(m,2h)；2.34-1.78(m,13h)；1.71-1.51(m,7h)；1.46(s,9h)；1.44(s,9h)；1.25(m,20h)；1.07-0.93(m,1h)。

lc-ms純度：100％(elsd)。

lc-msrt(kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水70:30至100:0+0.1％tfa)：0.76min。

lc-msm/z:1001.0(m+h)+。

在-30℃和氬氣下，將n,n-二異丙基乙胺(0.73ml，4.14mmol)添加至上述胺(5，3.45g，3.45mmol)在無(wú)水二氯甲烷(55ml)中的溶液中。逐滴加入溴乙酰溴(0.36ml，4.14mmol)，并將所得溶液在-30℃下攪拌3小時(shí)。移除冷卻浴，并將混合物在室溫下攪拌另外1小時(shí)，然后使其蒸發(fā)至干。將殘余物再溶解于乙酸乙酯(100ml)，用5％檸檬酸水溶液(3×100ml，極慢的相分離)、1m鹽酸水溶液(4×100ml)和鹽水洗滌。有機(jī)層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)。殘余物通過(guò)急驟柱色譜法純化(silicagel60，0.040-0-063mm；洗脫液：二氯甲烷/甲醇95:5至93:7)，得到呈黃色油的化合物6。

產(chǎn)率：1.63g(44％)。

rf(sio2，二氯甲烷/甲醇95:5)：0.15。

1hnmr譜(300mhz,cdcl3,dh):7.55-7.46(m,1h)；7.43-7.33(m,1h)；6.99-6.89(m,1h)；6.58(d,j＝7.5hz,1h)；5.72-5.59(m,1h)；4.44-4.32(m,1h)；4.02(s,4h)；3.85(s,2h)；3.74-3.40(m,20h)；3.14-3.09(m,2h)；2.33-2.05(m,9h)；2.01-1.76(m,4h)；1.67-1.53(m,7h)；1.46(s,9h)；1.44(s,9h)；1.25(m,20h)；1.07-0.89(m,2h)。

lc-ms純度：100％(elsd)。

lc-msrt(kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％fa)：3.47min。

lc-msm/z:1122.0(m+h)+。

將上述化合物(6，1.63g，1.53mmol)溶解在三氟乙酸(25ml)中并放置1.5小時(shí)。真空除去三氟乙酸，殘余物與甲苯共蒸發(fā)三次。將二乙醚(120ml)添加至油狀殘余物中，并攪拌該混合物1小時(shí)。然后濾出沉淀物，并將殘余物真空干燥以得到白色粉末。

產(chǎn)率：1.55g(90％)。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,dh):4.65-4.56(m,1h)；4.14(s,2h)；4.12(s,2h)；3.98(s,2h)；3.78-3.44(m,20h)；3.14-3.10(d,j＝6.8hz,2h)；2.48-2.21(m,8h)；2.18-2.10(m,1h)；1.97-1.79(m,4h)；1.70-1.46(m,7h)；1.32(bs,20h)；1.11-0.93(m,2h)。

lc-ms純度：100％(elsd)。

lc-msrt(kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa)：3.32min。

lc-msm/z:1008.0(m+h)+。

實(shí)施例4.8：18-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]環(huán)己基]甲基氨基]-18-氧代-十八酸的制備

合成方案：

使wangfmoc-lys(mtt)樹(shù)脂0.26mmol/g(1，11.7g，3.05mmol)在二氯甲烷(100ml)中溶脹45分鐘。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×90ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、2-丙醇(3×90ml)和二氯甲烷(3×90ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，2.35g，6.09mmol)、o-(6-氯苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，2.17g，6.09mmol)和n,n-二異丙基乙胺(2.12ml，12.2mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3x90ml)、二氯甲烷(3×90ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×90ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、2-丙醇(3×90ml)和二氯甲烷(3×90ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，2.35g，6.09mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，2.17g，6.09mmol)和n,n-二異丙基乙胺(2.12ml，12.2mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液，并將該混合物振搖1.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、二氯甲烷(3×90ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)洗滌以獲得中間體1。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×90ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、2-丙醇(3×90ml)和二氯甲烷(3×90ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu，1.94g，4.57mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，1.62g，4.57mmol)和n,n-二異丙基乙胺(1.43ml，8.23mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液，并將該混合物振搖1.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、二氯甲烷(3×90ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×90ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、2-丙醇(3×90ml)和二氯甲烷(3×90ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入4-[(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)甲基]環(huán)己烷羧酸(fmoc-trx-oh，1.73g，4.57mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，1.62g，4.57mmol)和n,n-二異丙基乙胺(1.43ml，8.23mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、二氯甲烷(3×90ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)洗滌以獲得中間體2。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×50ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×50ml),2-丙醇(3×50ml)和二氯甲烷(3×30ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入十八烷二酸單叔丁酯(c18(otbu)-oh，0.85g，2.28mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，0.81g，2.28mmol)和n,n-二異丙基乙胺(0.72ml，4.11mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液，并將該混合物振搖1.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3×50ml)、二氯甲烷(3×50ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×50ml)洗滌。通過(guò)用含80％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的二氯甲烷處理(2×10min，2×30min，4×50ml)除去mtt基團(tuán)。用二氯甲烷(6×50ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入溴乙酸(4.24g，30.5mmol)和n,n′-二異丙基碳二亞胺(dic，4.01ml，25.9mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液，并將該混合物振搖45分鐘。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(5×50ml)和二氯甲烷(10×50ml)洗滌。通過(guò)用三氟乙酸(50ml)處理1小時(shí)從樹(shù)脂上切下產(chǎn)物。濾出樹(shù)脂并用三氟乙酸(1×25ml)和二氯甲烷(2×30ml)洗滌。合并溶液并將溶劑蒸發(fā)至干，從而得到呈粘稠淡褐色油的化合物。

產(chǎn)率：2.18mg(64％)。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,80℃,dh):4.72-4.55(m,2h)；4.16(s,2h)；4.12(s,2h)；3.80-3.62(m,12h)；3.58-3.44(m,4h)；3.32(t,j＝6.8hz,2h)；3.15(d,j＝6.8hz,2h)；2.51-2.07(m,8h)；2.01-1.77(m,6h)；1.72-1.44(m,11h)；1.33(bs,24h)；1.13-0.95(m,2h)。

lc-ms純度：96％。

lc-msrt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa)：3.68min。

lc-msm/z:1124.1(m+h)+。

實(shí)施例4.9：16-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲?；鵠環(huán)己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸的制備

合成程序類(lèi)似于實(shí)施例4.8，不同之處在于在中間體2后的合成步驟中，使用十六烷二酸單叔丁酯(c16(otbu)-oh)代替十八烷二酸單叔丁酯(c18(otbu)-oh)。獲得呈粘稠淡褐色油的產(chǎn)物。

產(chǎn)率：2.05mg(62％)。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,80℃,dh):4.71-4.55(m,2h)；4.16(s,2h)；4.12(s,2h)；3.79-3.62(m,12h)；3.58-3.44(m,4h)；3.32(t,j＝6.7hz,2h)；3.15(d,j＝6.6hz,2h)；2.49-2.07(m,8h)；2.01-1.77(m,6h)；1.72-1.44(m,11h)；1.33(bs,20h)；1.13-0.97(m,2h)。

lc-ms純度：92％。

lc-msrt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa)：3.38min。

lc-msm/z:1096.0(m+h)+。

實(shí)施例4.10：4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺?；被鵠-10-氧代-癸氧基]苯甲酸的制備

合成程序類(lèi)似于實(shí)施例4.8，不同之處在于在中間體1后的合成步驟中，使用標(biāo)準(zhǔn)fmoc保護(hù)/脫保護(hù)合成程序，先將3-羧基丙烷磺酰胺、后將10-(4-叔丁氧羰基苯氧基)癸酸偶聯(lián)至樹(shù)脂。如實(shí)施例4.8所例示的后續(xù)合成步驟、切割和后處理得到白色固體。

lc-msm/z:998.54(m1+)。

uplc5：方法09_b4_1，rt＝8.3004min(ph2.3)；98％純度。

實(shí)施例4.11：4-[10-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸的制備

合成程序類(lèi)似于實(shí)施例4.8，不同之處在于在中間體1后的合成步驟中，使用標(biāo)準(zhǔn)fmoc保護(hù)/脫保護(hù)合成程序，先將(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu)、后將10-(4-叔丁氧羰基苯氧基)癸酸偶聯(lián)至樹(shù)脂。如實(shí)施例4.8所例示的后續(xù)合成步驟、切割和后處理得到白色固體。

lc-msm/z:978,55(m1+)。

uplc5：方法09_b4_1，rt＝7.573min(ph2.3)；99％純度。

實(shí)施例4.12：20-[[(1s)-4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸的制備

合成程序類(lèi)似于實(shí)施例4.8，不同之處在于在中間體1后的合成步驟中，使用標(biāo)準(zhǔn)fmoc保護(hù)/脫保護(hù)合成程序，先將(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu)偶聯(lián)至樹(shù)脂兩次，隨后將20-叔丁氧基-20-氧代-二十酸(c20(otbu)-oh)偶聯(lián)至樹(shù)脂。如實(shí)施例4.8所例示的后續(xù)合成步驟、切割和后處理得到白色固體。

lc-msm/z:1141.2(m+h)+。

實(shí)施例4.13：20-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸的制備

合成程序類(lèi)似于實(shí)施例4.8，不同之處在于在中間體1后的合成步驟中，使用標(biāo)準(zhǔn)fmoc保護(hù)/脫保護(hù)合成程序，先將(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu)偶聯(lián)至樹(shù)脂，隨后將20-叔丁氧基-20-氧代-二十酸(c20(otbu)-oh)偶聯(lián)至樹(shù)脂。如實(shí)施例4.8所例示的后續(xù)合成步驟、切割和后處理得到白色固體。

lc-msm/z:1012.0(m+h)+。

實(shí)施例4.14：(2s,25s)-2-(4-(2-溴乙酰胺基)丁基)-4,13,22-三氧代-25-(15-磺基十五烷酰胺基)-6,9,15,18-四氧雜-3,12,21-三氮雜二十六烷二酸的制備

合成方案：

使wangfmoc-lys(mtt)樹(shù)脂0.26mmol/g(1，36.7g，9.55mmol)在二氯甲烷(200ml)中溶脹45分鐘。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×150ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×150ml)、2-丙醇(2×150ml)和二氯甲烷(2×150ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，7.36g，19.1mmol)、o-(6-氯苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，6.79g，19.1mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.66ml，38.2mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(150ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×150ml)、二氯甲烷(2×150ml)和n,n-二甲基甲酰胺(2×150ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×150ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(2×150ml)、2-丙醇(2×150ml)和二氯甲烷(2×150ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，7.36g，19.1mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，6.79g，19.1mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.66ml，38.2mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(150ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×150ml)、二氯甲烷(2×150ml)和n,n-二甲基甲酰胺(150ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×150ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×150ml)、2-丙醇(2×150ml)和二氯甲烷(2×150ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu，6.10g，14.3mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，5.09g，14.3mmol)和n,n-二異丙基乙胺(4.49ml，25.8mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(150ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×150ml)、二氯甲烷(2×150ml)和n,n-二甲基甲酰胺(150ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×150ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×150ml)、2-丙醇(2×150ml)和二氯甲烷(2×150ml)洗滌樹(shù)脂。將樹(shù)脂分離成三份，向上述樹(shù)脂的一份中加入16-磺基-十六酸鈉(3，2.28g，6.37mmol)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽(pybop，3.31g，6.37mmol)和n,n-二異丙基乙胺(2.22ml，12.8mmol)在二甲基亞砜(80ml)中的溶液，并將該混合物振搖2小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺:水混合物(3:1，3×80ml)、n,n-二甲基甲酰胺(3×80ml)、二氯甲烷(3×80ml)和n,n-二甲基甲酰胺(2×80ml)洗滌。通過(guò)用含80％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的二氯甲烷處理(3×10min，2×30min，5×80ml)除去mtt基團(tuán)。用二氯甲烷(6×80ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入溴乙酸(6.64g，47.8mmol)和n,n′-二異丙基碳二亞胺(dic，5.26ml，34.0mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(80ml)中的溶液，并將該混合物振搖45分鐘。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(4×80ml)和二氯甲烷(10×80ml)洗滌。通過(guò)用三氟乙酸(100ml)處理1小時(shí)從樹(shù)脂上切下產(chǎn)物。濾出樹(shù)脂并用三氟乙酸(1×40ml)和二氯甲烷(3×50ml)洗滌。合并溶液并將溶劑蒸發(fā)至干，得到粘稠淡褐色油。將該油溶解在水:乙腈混合物(4:1，25ml)中，并使溶液通過(guò)h+型dowex50wx4柱(7×10cm)(50-100目；洗脫液：水)。合并具有酸性ph的級(jí)分，并冷凍干燥以得到白色粉末。

產(chǎn)率：2.17g(68％)。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,80℃,dh):4.74-4.56(m,2h)；4.16(d,j＝5.3hz,4h)；3.95(s,2h)；3.82-3.64(m,12h)；3.61-3.47(m,4h)；3.33(t,j＝6.9hz,2h)；3.17-3.07(m,2h)；2.54(t,j＝7.3hz,2h)；2.38(t,j＝7.5hz,2h)；2.34-2.09(m,2h)；2.01-1.93(m,1h)；1.93-1.78(m,3h)；1.74-1.57(m,4h)；1.57-1.29(m,24h)。

lc-ms純度：100％。

lc-msrt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa)：2.86min。

lc-msm/z:1003.9(m+h)+。

實(shí)施例4.15：12-[[(1s)-4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸的制備

合成方案：

使wangfmoc-lys(mtt)樹(shù)脂0.26mmol/g(1，36.7g，9.55mmol)在二氯甲烷(200ml)中溶脹45分鐘。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×150ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×150ml)、2-丙醇(2×150ml)和二氯甲烷(2×150ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，7.36g，19.1mmol)、o-(6-氯苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，6.79g，19.1mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.66ml，38.2mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(150ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×150ml)、二氯甲烷(2×150ml)和n,n-二甲基甲酰胺(2×150ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×150ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(2×150ml)、2-丙醇(2×150ml)和二氯甲烷(2×150ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，7.36g，19.1mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，6.79g，19.1mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.66ml，38.2mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(150ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×150ml)、二氯甲烷(2×150ml)和n,n-二甲基甲酰胺(150ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×150ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×150ml)、2-丙醇(2×150ml)和二氯甲烷(2×150ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu，6.10g，14.3mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，5.09g，14.3mmol)和n,n-二異丙基乙胺(4.49ml，25.8mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(150ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×150ml)、二氯甲烷(2×150ml)和n,n-二甲基甲酰胺(150ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×30min，2×150ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×150ml)、2-丙醇(2×150ml)和二氯甲烷(2×150ml)洗滌樹(shù)脂。將樹(shù)脂分離成三份，向上述樹(shù)脂的一份(2)中加入(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu，2.03g，4.78mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，1.70g，4.78mmol)和n,n-二異丙基乙胺(1.50ml，8.60mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(70ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(2×70ml)、二氯甲烷(2×70ml)和n,n-二甲基甲酰胺(70ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1××5min，1x30min，2×70ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×70ml)、2-丙醇(2×70ml)和二氯甲烷(2×70ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入十二烷二酸單叔丁酯(c12(otbu)-oh，1.37g，4.78mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，1.70g，4.78mmol)和n,n-二異丙基乙胺(1.50ml，8.60mmol)在二氯甲烷/n,n-二甲基甲酰胺混合物(4:1，70ml)中的溶液，并將該混合物振搖1.5hr。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3×150ml)、二氯甲烷(3×150ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×150ml)洗滌。通過(guò)用含80％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的二氯甲烷處理(3×10min，2×30min，4×70ml)除去mtt基團(tuán)。用二氯甲烷(6×70ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入溴乙酸(6.60g，47.8mmol)和n,n′-二異丙基碳二亞胺(dic，5.30ml，34.0mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(90ml)中的溶液，并將該混合物振搖30分鐘。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(4×70ml)和二氯甲烷(10×70ml)洗滌。通過(guò)用三氟乙酸(100ml)處理1小時(shí)從樹(shù)脂上切下產(chǎn)物。濾出樹(shù)脂并用三氟乙酸(1×40ml)和二氯甲烷(2×40ml)洗滌。合并溶液并將溶劑蒸發(fā)至干，得到粘稠淡褐色油。

產(chǎn)率：2.94mg(90％)。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,dh):4.74-4.53(m,3h)；4.17(s,2h)；4.12(s,2h)；3.96(s,2h)；3.81-3.40(m,16h)；3.31(t,j＝6.8hz,2h)；2.57-2.20(m,10h)；2.16-2.04(m,3h)；1.89-1.75(m,1h)；1.72-1.54(m,6h)；1.52-1.41(m,2h)；1.32(bs,12h)。

lc-ms純度：100％。

lc-msrt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa)：2.64min。

lc-msm/z:1028.0(m+h)+。

實(shí)施例4.16：12-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸的制備

合成程序與實(shí)施例4.8相似，不同之處在于在中間體1后的合成步驟中，使用標(biāo)準(zhǔn)fmoc保護(hù)/脫保護(hù)合成程序，先將(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu)、后將12-叔丁氧基-12-氧代-十二酸偶聯(lián)至樹(shù)脂。如實(shí)施例4.8所例示的后續(xù)合成步驟、切割和后處理得到呈粘稠淡褐色油的化合物。

產(chǎn)率：97％

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,dh):4.73-4.55(m,2h)；4.17(s,2h)；4.12(s,2h)；3.96(s,2h)；3.80-3.42(m,16h)；3.31(t,j＝6.78hz,2h)；2.49-2.17(m,7h)；2.01-1.92(m,2h)；1.87-1.76(m,1h)；1.70-1.54(m,6h)；1.52-1.41(m,2h)；1.32(bs,12h)。

lc-ms純度：100％。

lc-msrt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa)：2.72min。

lc-msm/z:900.0(m+h)+。

實(shí)施例4.17：20-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲?；鵠環(huán)己基]甲基氨基]-20-氧代-二十酸的制備

合成方案：

使wangfmoc-lys(mtt)樹(shù)脂0.26mmol/g(1，11.2g，2.90mmol)在二氯甲烷(100ml)中溶脹45分鐘。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×100ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、2-丙醇(3×90ml)和二氯甲烷(3×90ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，2.23g，5.80mmol)、o-(6-氯苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，2.06g，5.80mmol)和n,n-二異丙基乙胺(2.02ml，11.6mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液，并將該混合物振搖1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、二氯甲烷(3×90ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×100ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、2-丙醇(3×90ml)和二氯甲烷(3×90ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入{2-[2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(fmoc-oeg-oh，2.23g，5.80mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，2.06g，5.80mmol)和n,n-二異丙基乙胺(2.02ml，11.6mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液，并將該混合物振搖1.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、二氯甲烷(3×90ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×100ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、2-丙醇(3×90ml)和二氯甲烷(3×90ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入(s)-2-(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(fmoc-lglu-otbu，1.85g，4.35mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，1.55g，4.35mmol)和n,n-二異丙基乙胺(1.36ml，7.82mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液，并將該混合物振搖1.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、二氯甲烷(3×90ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×100ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、2-丙醇(3×90ml)和二氯甲烷(3×90ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入4-[(9h-芴-9-基甲氧羰基氨基)甲基]環(huán)己烷羧酸(fmoc-trx-oh，1.65g，4.35mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，1.55g，4.35mmol)和n,n-二異丙基乙胺(1.36ml，7.82mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液，并將該混合物振搖2小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、二氯甲烷(3×90ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)洗滌。通過(guò)用含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺處理(1×5min，1×10min，1×30min，3×100ml)除去fmoc基團(tuán)。用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、2-丙醇(3×90ml)和二氯甲烷(3×90ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入二十烷二酸單叔丁酯(c20(otbu)-oh，1.73g，4.35mmol)、o-(6-氯-苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(tctu，1.55g，4.35mmol)和n,n-二異丙基乙胺(1.36ml，7.82mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液，并將該混合物振搖2小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)、二氯甲烷(3×90ml)、n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)和二氯甲烷(3×90ml)洗滌。通過(guò)用含80％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的二氯甲烷處理(2×10min，2×30min，4×100ml)除去mtt基團(tuán)。用二氯甲烷(6×90ml)和n,n-二甲基甲酰胺(3×90ml)洗滌樹(shù)脂。向樹(shù)脂中加入溴乙酸(8.06g，58.0mmol)和n,n′-二異丙基碳二亞胺(dic,7.60ml，49.3mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液，并將該混合物振搖40分鐘。將樹(shù)脂過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺(5×90ml)和二氯甲烷(12×90ml)洗滌。通過(guò)用三氟乙酸(100ml)處理1小時(shí)從樹(shù)脂上切下產(chǎn)物。濾出樹(shù)脂并用三氟乙酸(1×50ml)和二氯甲烷(7×70ml)洗滌。合并溶液并將溶劑蒸發(fā)至干，得到粘稠淡褐色油。

產(chǎn)率：3.28g(98％)。

1hnmr譜(300mhz,acod-d4,80℃,dh):4.68(dd,j＝8.0和5.4hz,1h)；4.60(dd,j＝7.9和5.3hz,1h)；4.16(s,2h)；4.12(s,2h)；3.94(s,2h)；3.81-3.61(m,12h)；3.59-3.44(m,4h)；3.32(t,j＝6.8hz,2h)；3.14(d,j＝6.8hz,2h)；2.49-1.79(m,15h)；1.73-1.43(m,11h)；1.33(s,28h)；1.11-0.96(m,2h)。

lc-ms純度：100％(elsd)。

lc-msrt(kinetex4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％fa)：4.04min。

lc-msm/z:1151.3(m+h)+。

實(shí)施例5：fgf21衍生物的制備

代表性fgf21衍生物的制備在實(shí)施例5.1(化合物21)中給出。實(shí)施例5.2-5.14的fgf21衍生物(化合物11-20和22-14)通過(guò)實(shí)施例5.1提供的方法制備。實(shí)施例5.15-5.37的fgf21衍生物通過(guò)實(shí)施例5.1提供的方法制備或如下文所述制備。

實(shí)施例5.1：化合物21

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21

該化合物是seqidno:10的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

化合物21如下制備：

按實(shí)施例1-3中一般性描述所制備的seqno:10的s{β-181}-2-氨基乙基硫基-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21類(lèi)似物位置181的cys殘基在位置181c的cys殘基的巰基處用實(shí)施例4.1制備的試劑修飾：

向tris和nacl-緩沖液(1.35mg/ml)中的半胱胺保護(hù)的ala[gln121,leu168,cys181]fgf21(70mg，0.0036mmol)中加入tris水溶液以將ph調(diào)節(jié)至8.0。加入溶解在水中的bspp(雙(對(duì)磺酸基苯基)苯基膦二鉀鹽二水合物，12mg)，并在室溫下輕輕攪拌4小時(shí)。加入在乙醇(0.5ml)中的15-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠-甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十五酸(19mg，0.022mmol)。輕輕攪拌過(guò)夜后，加入miliq水(150ml)以使電導(dǎo)率降低至2.5ms/cm。在monoq10/100gl柱上利用陰離子交換純化該混合物，其中使用a-緩沖液：20mmtris，ph8.0；b-緩沖液：20mmtris，500mmnacl，ph8.0，流量為6ml，梯度為0-80％b，經(jīng)60個(gè)cv。產(chǎn)率：37mg，51％。

lcms方法2：

理論質(zhì)量：20279.9；實(shí)測(cè)：20280.4

實(shí)施例5.2：化合物11

s{β-178}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys178]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.1的試劑15-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲?；鶀十五酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:6的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法2

理論質(zhì)量：20279.9；實(shí)測(cè)：20280.2

實(shí)施例5.3：化合物12

s{β-179}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys179]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.1的試劑15-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十五酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:7的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法3

理論質(zhì)量：20203.8；實(shí)測(cè)：20204.2

實(shí)施例5.4：化合物13

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(11-羧基十一?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.2的試劑11-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?-乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠-丙基氨基甲?；鶀十一酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法2

理論質(zhì)量：20239.8；實(shí)測(cè)：20240.1

實(shí)施例5.5：化合物14

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.3的試劑13-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲?；鵠甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲?；鶀十三酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法3：

理論質(zhì)量：20267.8；實(shí)測(cè)：20268.1

實(shí)施例5.6：化合物15

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五?；?氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.1的試劑15-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲?；鶀十五酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法2：

理論質(zhì)量：20295.9；實(shí)測(cè)：20296.2

實(shí)施例5.7：化合物16

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七?；?氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.5的試劑17-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十七酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法3

理論質(zhì)量：20323.9；實(shí)測(cè)：20324.5

實(shí)施例5.8：化合物17

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.4的試劑19-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲?；鶀十九酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法3

理論質(zhì)量：20352.0；實(shí)測(cè)：20352.0

實(shí)施例5.9：化合物18

s{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys180,des181]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.5的試劑17-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲?；鶀十七酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:9的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法2：

理論質(zhì)量：20236.8；實(shí)測(cè)：20237.0

實(shí)施例5.10：化合物19

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(11-羧基十一?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.2的試劑11-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲?；鵠甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十一酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:1的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法2：

理論質(zhì)量：20223.8；實(shí)測(cè)：20224.4。

實(shí)施例5.11：化合物20

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.3的試劑13-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基-氨基甲?；鵠甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠-丙基氨基甲酰基}十三酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:10的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法2：

理論質(zhì)量：20251.8；實(shí)測(cè)：20252.2

實(shí)施例5.12：化合物22

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.5的試劑17-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲?；鵠甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲酰基}十七酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:10的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法2：

理論質(zhì)量：20307.9；實(shí)測(cè)：20308.6。

實(shí)施例5.13：化合物23

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.4的試劑19-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基-氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲?；鶀十九酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:10的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法2：

理論質(zhì)量：20336.0；實(shí)測(cè)：20336.2

實(shí)施例5.14：化合物24

s{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-met[cys181]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.5的試劑17-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠-丙基氨基甲酰基}十七酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:11的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法3：

理論質(zhì)量：20372.2；實(shí)測(cè)：20372.2。

實(shí)施例5.15：化合物34

s{β-168}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,cys168]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.3的試劑13-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠-丙基氨基甲?；鶀十三酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述的方法制備的seqidno:13的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法1

理論質(zhì)量：20225.；實(shí)測(cè)：20226.7

實(shí)施例5.16：化合物35

s{β-169}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五?；?氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys169]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.1的試劑15-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠-丙基氨基甲?；鶀十五酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:14的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法3

理論質(zhì)量：20267.8；實(shí)測(cè)：20268.2

實(shí)施例5.17：化合物36

18-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸-ala[gln121,leu168,cys170]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.5的試劑18-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:15的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.18：化合物37

s{β-173}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys173]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.1的試劑15-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠-丙基氨基甲?；鶀十五酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:18的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法3

理論質(zhì)量：20238.8；實(shí)測(cè)：20239.3

實(shí)施例5.19：化合物38

s{β-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；?氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys174]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.3的試劑13-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠-丙基氨基甲?；鶀十三酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:19的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法1

理論質(zhì)量：20281.9；實(shí)測(cè)：20281.9

實(shí)施例5.20：化合物39

18-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸-ala[gln121,leu168,cys174]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.5的試劑18-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:19的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.21：化合物40

16-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-16-氧代-十六酸-ala[gln121,leu168,cys174]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.1的試劑16-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-16-氧代-十六酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:19的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.22：化合物41

s{β-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys175]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.1的試劑15-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲?；鶀十五酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:20的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法3

理論質(zhì)量：20210.8；實(shí)測(cè)：20211.4

實(shí)施例5.23：化合物42

s{β-176}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-ala[gln121,leu168,cys176]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.1的試劑15-{(s)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙?；被?乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠-丙基氨基甲酰基}十五酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:4的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

lcms方法3

理論質(zhì)量：20279.9；實(shí)測(cè)：20280.4

實(shí)施例5.24：化合物43

4-[10-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.11的試劑4-[10-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.25：化合物44

4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺?；被鵠-10-氧代-癸氧基]苯甲酸]-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.10的試劑4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺?；被鵠-10-氧代-癸氧基]苯甲酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.26：化合物45

20-[[(1s)-4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.12的試劑20-[[(1s)-4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.27：化合物46

20-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.13的試劑20-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.28：化合物47

(2s)-6-乙酰胺基-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(16-磺基十六酰基氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]十六酸-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.14的試劑(2s)-6-[(2-溴乙?；?氨基]-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4s)-4-羧基-4-(16-磺基十六?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]己酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.29：化合物48

12-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.16的試劑12-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.30：化合物49

12-[[(1s)-4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.15的試劑12-[[(1s)-4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.31：化合物50

20-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-乙酰胺基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]環(huán)己基]甲基氨基]-20-氧代-二十酸-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.17的試劑20-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲?；鵠環(huán)己基]甲基氨基]-20-氧代-二十酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.32：化合物51

16-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲?；鵠環(huán)己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.7的試劑16-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲?；鵠環(huán)己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.33：化合物52

16-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-乙酰胺基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲?；鵠環(huán)己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.9的試劑16-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲?；鵠環(huán)己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.34：化合物53

18-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-乙酰胺基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]環(huán)己基]甲基氨基]-18-氧代-十八酸-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.8的試劑18-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲?；鵠環(huán)己基]甲基氨基]-18-氧代-十八酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.35：化合物54

12-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]環(huán)己基]甲基氨基]-12-氧代-十二酸-ala[gln121,leu168,cys180]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.6的試劑12-[[4-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙?；?氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]環(huán)己基]甲基氨基]-12-氧代-十二酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:8的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.36：化合物55

4-[10-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸]-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.11的試劑4-[10-[[(1s)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:10的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

實(shí)施例5.37：化合物56

4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺?；被鵠-10-氧代-癸氧基]苯甲酸-ala[gln121,leu168,cys181]fgf21

該化合物是使用實(shí)施例4.10的試劑4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1s)-5-[(2-溴乙?；?氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺?；被鵠-10-氧代-癸氧基]苯甲酸，通過(guò)實(shí)施例5.1所述方法制備的seqidno:10的fgf21類(lèi)似物(參見(jiàn)實(shí)施例3)的衍生物。

藥理學(xué)方法

本發(fā)明的fgf21類(lèi)似物或其衍生物作為藥學(xué)活性劑在減少哺乳動(dòng)物(如人)的體重增加和治療肥胖癥和糖尿病中的應(yīng)用可通過(guò)在常規(guī)試驗(yàn)中以及在以下所述的體外和體內(nèi)試驗(yàn)中通過(guò)fgf21激動(dòng)劑的活性來(lái)證明。

此類(lèi)試驗(yàn)還提供了一種方法，憑借該方法可將本發(fā)明的fgf21化合物的活性與已知化合物的活性進(jìn)行比較。

實(shí)施例6：在超表達(dá)人bkl的hek293中的erk磷酸化試驗(yàn)中的fgf受體效力

本實(shí)施例的目的是測(cè)試fgf21衍生物在體外的活性或效力。體外效力是全細(xì)胞試驗(yàn)中fgf受體激活的量度。

實(shí)施例5的fgf21衍生物的效力在超表達(dá)人β-klotho(bkl)的hek(人胚腎細(xì)胞)中進(jìn)行測(cè)定，如以下進(jìn)一步描述。

為了測(cè)試fgf21衍生物與白蛋白的結(jié)合，該試驗(yàn)在不存在血清白蛋白以及存在人血清白蛋白(hsa)(0.1％最終測(cè)定濃度)的情況下進(jìn)行。在血清白蛋白的存在下，fgf21衍生物的ec50值的增加(效力的降低)將指示與血清白蛋白的結(jié)合，并代表用來(lái)預(yù)測(cè)測(cè)試物質(zhì)在動(dòng)物模型中延長(zhǎng)的藥代動(dòng)力學(xué)譜的方法。

fgf21類(lèi)似物的結(jié)果示于表2中，而fgf21衍生物的結(jié)果示于表3中。包含metfgf21(seqidno:2)以供參考。

試驗(yàn)原理

hek293細(xì)胞內(nèi)源性地表達(dá)數(shù)種fgf受體，包括fgfr1c、fgfr3c和fgfr4。在用共受體β-klotho(bkl)轉(zhuǎn)染之前，這些細(xì)胞對(duì)fgf21是不響應(yīng)的。fgf受體/bkl復(fù)合體的激活導(dǎo)致mapk/erk信號(hào)途徑的激活和erk的磷酸化。在給定時(shí)間點(diǎn)的磷酸化erk(perk)的水平隨fgf21濃度的升高而升高。如下所述，在用一系列的fgf21類(lèi)似物濃度刺激12分鐘之后測(cè)定perk的水平。

試驗(yàn)描述

將hek293/β-klotho細(xì)胞以30,000個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板中的補(bǔ)充有10％fcs(gibco#16140-071)、1％青霉素/鏈霉素(gibco#15140)、100μg/ml潮霉素b(calbiochem,#400052)的dmem(biowhittaker#be12-604f/u1)中。兩天后且在加入化合物之前2小時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為100μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基(dmem(biowhittaker#be12-604f/u1))。將fgf21類(lèi)似物在測(cè)定培養(yǎng)基(補(bǔ)充有0.02％吐溫20的dmem(biowhittaker#be12-604f/u1))中稀釋，加溫至37℃，加入細(xì)胞(100μl)，并在37℃下溫育12分鐘。fgf21衍生物還在0.1％hsa(sigma–a1887)的存在下進(jìn)行測(cè)試?？焖僖瞥鏊信囵B(yǎng)基，并且每孔加入50μl裂解緩沖液。將該培養(yǎng)板搖動(dòng)5分鐘，并準(zhǔn)備好裂解物以供perk的測(cè)定。用alphascreensurefire試劑盒(perkinelmer#tgres10k)在384孔板中測(cè)定perk。該試劑盒基于與供體和受體珠子偶聯(lián)的erk和perk特異性抗體。perk的存在將使受體和供體珠子緊密接近，并生成信號(hào)，在envision上讀取該信號(hào)。使用graphpadprism分析數(shù)據(jù)，并將fgf21蛋白的效力描述為絕對(duì)ec50值。

表2a.fgf21類(lèi)似物在hek293/bkl細(xì)胞中的效力

從表2中的結(jié)果可以看出，在位置176、177、178或179處引入半胱氨酸使效力與metfgf21相比急劇降低。然而，出乎意料地，在位置180或在位置181處引入半胱氨酸導(dǎo)致與metfgf21相比沒(méi)有(180c)或僅有適度(181c)的效力降低。在位置180處具有半胱氨酸的化合物7顯示出與metfgf21和除了位置180處的半胱氨酸外與化合物8具有相同氨基酸改變的化合物2兩者類(lèi)似的效力。

與metfgf21以及除了位置181的半胱氨酸外與化合物9具有相同氨基酸改變的化合物2相比，在位置181處具有半胱氨酸的化合物9的效力僅稍微降低。

表2b.其他fgf21類(lèi)似物在hek293/bkl細(xì)胞中的效力

可以看出，具有c168氨基酸置換的化合物#26效力降低，而在位置167、169、170、171、172、173、174和175處具有半胱氨酸的類(lèi)似物意外地具有類(lèi)似于metfgf21的效力。

表3a.在不存在或存在0.1％hsa的情況下，fgf21衍生物在hek293/bkl細(xì)胞中的效力。

從表3a中的結(jié)果可以看出，意外地發(fā)現(xiàn)與不具有側(cè)鏈的化合物(參見(jiàn)表2)相比，本發(fā)明的側(cè)鏈附接至位置178-181中任一處的半胱氨酸沒(méi)有導(dǎo)致效力的降低?；衔?1、12、15和21都包含相同的側(cè)鏈，其中延長(zhǎng)體元件為c16二酸(化學(xué)式1a)(連接體元件為一個(gè)化學(xué)式2元件、兩個(gè)化學(xué)式3a元件和一個(gè)化學(xué)式4a元件)。當(dāng)與相應(yīng)的fgf21類(lèi)似物(化合物5、6、7和9，參見(jiàn)表2)的效力比較時(shí)，可以看出這些fgf21衍生物的效力類(lèi)似于相應(yīng)的fgf類(lèi)似物(即不具有側(cè)鏈)。

還探究了不同脂肪鏈長(zhǎng)度對(duì)具有延長(zhǎng)體元件的化合物的效力的影響。在不存在hsa的情況下，在位置180處具有半胱氨酸的fgf衍生物的效力類(lèi)似于具有c12二酸、c14二酸、c16二酸或c18二酸作為延長(zhǎng)體元件的fgf21衍生物。在不存在hsa的情況下，在位置181處具有半胱氨酸的fgf衍生物的效力類(lèi)似于具有c14二酸、c16二酸、c18二酸或c20二酸作為延長(zhǎng)體元件的fgf21衍生物。

提高h(yuǎn)sa濃度對(duì)包含c12、c14或c16側(cè)鏈的衍生物的效力沒(méi)有影響或具有適度影響，而在存在0.1％has的情況下，具有c18或c20側(cè)鏈的化合物的效力降低。

從表3a可以看出，與不存在血清白蛋白時(shí)的ec50值相比，fgf21衍生物在存在0.1％血清白蛋白時(shí)的ec50值增加與延長(zhǎng)體長(zhǎng)度的增加相符合。這良好地符合這些fgf21衍生物的半衰期延長(zhǎng)(參見(jiàn)實(shí)施例8)。

表3b.在不存在或存在0.1％hsa的情況下，其他fgf21衍生物在hek293/bkl細(xì)胞中的效力。

進(jìn)一步測(cè)試了如上所述具有不同fgf21骨架的fgf21衍生物的效力，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)用脂肪酸延長(zhǎng)體衍生化時(shí)，在位置169、170、171、172、173、174和175處具有半胱氨酸的衍生物都保持效力。注意到，在cys169處的衍生化稍微降低了效力。

表3c.在不存在或存在0.1％hsa的情況下，其他fgf21衍生物在hek293/bkl細(xì)胞中的效力。

為了比較其他延伸元件，測(cè)試了延長(zhǎng)體和連接體的不同組合。全部與cys180或cys181綴合，并且觀察到所獲得的fgf21衍生物具有十分類(lèi)似的功能，這表明當(dāng)與fgf21cys如cys180或cys181綴合時(shí)可以使用各種延長(zhǎng)體元件。

實(shí)施例7：3t3-l1脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝入

對(duì)c-末端修飾的類(lèi)似物增加3t3-l1小鼠脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝入的能力進(jìn)行了測(cè)試。以下試驗(yàn)用于測(cè)定本發(fā)明的fgf21類(lèi)似物和衍生物的生物活性或效力。

試驗(yàn)原理

還可以通過(guò)測(cè)試fgf21類(lèi)似物和衍生物增加葡萄糖向脂肪細(xì)胞中的攝入的能力，在采用小鼠3t3-l1脂肪細(xì)胞的試驗(yàn)中測(cè)定體外效力。分化的3t3-l1脂肪細(xì)胞內(nèi)源性地表達(dá)fgfr1c和bkl。在分化前，3t3-l1細(xì)胞對(duì)fgf21是不響應(yīng)的，因?yàn)榉只瘜?dǎo)致共受體bkl的表達(dá)。fgfr1受體/bkl復(fù)合體的激活增加了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glut1)的表達(dá)，因此fgf21激動(dòng)劑將以劑量反應(yīng)的方式導(dǎo)致吸收進(jìn)脂肪細(xì)胞中的葡萄糖的量增加。

試驗(yàn)描述

將小鼠3t3-l1成纖維細(xì)胞(例如可獲自atcc，目錄號(hào)cl-173)保持在含有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素/鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(dmem(4500mg/l葡萄糖))中。不允許細(xì)胞達(dá)到匯合，并應(yīng)該在達(dá)到約60％匯合度(通過(guò)目測(cè))之前傳代(轉(zhuǎn)移至新的小瓶)。

對(duì)于葡萄糖攝入試驗(yàn)，細(xì)胞在96孔板(biocoat)中為15,000個(gè)細(xì)胞/孔，并且當(dāng)它們達(dá)到匯合(高密度，意在制備分化的脂肪細(xì)胞)時(shí)，將培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為含曲格列酮、ibmx、地塞米松(例如可商購(gòu)自sigma)和人胰島素(例如可商購(gòu)自novonordiska/s)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在開(kāi)始分化后7-9天使用細(xì)胞。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中用濃度逐漸增加(0-300nm)的本發(fā)明fgf21類(lèi)似物或衍生物刺激細(xì)胞20小時(shí)。在加入3h-脫氧-葡萄糖(在下文中：示蹤劑)之前，在溫的(約37℃)測(cè)定緩沖液(含有1mmmgcl2和2mmcacl2的pbs、hepes和0.1％人血清白蛋白)中洗滌細(xì)胞，并將細(xì)胞與示蹤劑一起溫育1小時(shí)。通過(guò)在冰冷的測(cè)定緩沖液中洗滌兩次結(jié)束該溫育。將細(xì)胞用tritonx-100裂解，并將裂解物轉(zhuǎn)移到96孔板中，加入microscint-40(例如可商購(gòu)自perkinelmer)，并在top計(jì)數(shù)器(例如，來(lái)自perkinelmer的packardtop-counter)中對(duì)示蹤劑的量進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算所討論的fgf21化合物的ec50和emax。以下表4-表5中顯示的結(jié)果分別指示了fgf21類(lèi)似物和衍生物的ec50(效力)和emax(功效)。

表4：fgf21類(lèi)似物在3t3-l1脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝入

表5.fgf21衍生物在3t3-l1脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝入

因?yàn)榛A(chǔ)測(cè)定培養(yǎng)基中血清、因而白蛋白的存在，由于fgf21衍生物的側(cè)鏈與白蛋白的結(jié)合，fgf21衍生物(表5)具有比相應(yīng)的fgf21類(lèi)似物(表4)更低的效力。效力的降低與延長(zhǎng)體元件的長(zhǎng)度相關(guān)。

實(shí)施例8：在小型豬和小鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)研究

本研究的目的在于確定fgf21衍生物在靜脈內(nèi)施用于小型豬和小鼠后的體內(nèi)延長(zhǎng)性，即fgf21衍生物在體內(nèi)的時(shí)間的延長(zhǎng)以及由此導(dǎo)致的其作用時(shí)間的延長(zhǎng)。這在藥代動(dòng)力學(xué)(pk)研究中完成，其中測(cè)定了所討論的類(lèi)似物的終末半衰期。終末半衰期是指在終末消除階段使某個(gè)血漿濃度減半所花的時(shí)間。

在小型豬中的研究

在本研究中使用從ellegaardminipigs(dalmose,denmark)獲得的約7-14個(gè)月齡且重約16-35kg的雌性小型豬。將小型豬單獨(dú)地(具有永久導(dǎo)管的豬)或成組地圈養(yǎng)，并限制性地每日一次或兩次飼以sds小型豬飲食(specialdietsservices,essex,uk)。

在至少2周的適應(yīng)后，將兩個(gè)永久中心靜脈導(dǎo)管植入每只動(dòng)物的尾側(cè)或顱側(cè)腔靜脈中。使動(dòng)物在手術(shù)后恢復(fù)1周，然后用于重復(fù)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，其中在連續(xù)給藥之間具有適當(dāng)?shù)南疵撈凇?/p>

所述化合物的靜脈注射液(體積對(duì)應(yīng)于例如0.050-0.125ml/kg)通過(guò)一個(gè)導(dǎo)管或通過(guò)venflon給予，并在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)采集血樣，直到給藥后11天(優(yōu)選通過(guò)另一個(gè)導(dǎo)管或通過(guò)靜脈穿刺)。

將血液樣品(例如0.8ml)收集在edta(8mm)包被的試管中，隨后在4℃和1942g下離心10分鐘。收集血液樣品以充分覆蓋api的完全血漿濃度-時(shí)間曲線。在實(shí)例中，在t＝給藥前、給藥后0.0833、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、30、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264小時(shí)收集血液樣品。

將血漿移取至干冰上的micronic管中，并在-20℃下保存，直到使用elisa來(lái)分析相應(yīng)fgf-1類(lèi)似物的血漿濃度。通過(guò)phoenixv.6.3(pharsightinc.,mountainview,ca,usa)或用于pk分析的其他相關(guān)軟件中的非房室藥代動(dòng)力學(xué)方法分析單獨(dú)的血漿濃度-時(shí)間曲線，并確定所得到的終末半衰期(調(diào)和平均值)。如上所述，fgf21衍生物的終末半衰期是采用不同劑量的兩個(gè)測(cè)定的算數(shù)平均值。

在小鼠中的研究

在正常的瘦型c57bl小鼠n＝2-3(約30克)中測(cè)試fgf21類(lèi)似物的藥代動(dòng)力學(xué)譜。fgf21化合物以單一靜脈內(nèi)劑量20mg/kg(約5ml/kg)給藥。

使用成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21人elisa(可獲自biovendor，目錄號(hào)rd191108200r)測(cè)定fgf21化合物的血漿水平。使用基于pc的軟件——來(lái)自pharsightcorportion,caryn.c.的winnonlin第6.3版進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算。結(jié)果在表6中給出。

表6：fgf21類(lèi)似物的藥代動(dòng)力學(xué)譜。

從表6中可以看出，在小型豬和小鼠中血漿半衰期隨著延長(zhǎng)體元件的脂肪酸鏈的長(zhǎng)度而增加。

實(shí)施例9：瘦型小鼠中的體重減輕

為了測(cè)定fgf21衍生物的體內(nèi)效力，在瘦型c57bl小鼠中研究了皮下(s.c.)給藥后對(duì)體重的影響。之前已經(jīng)表明，瘦型小鼠中由fgf21誘導(dǎo)的體重減輕對(duì)在肥胖小鼠中的效果有預(yù)示性，因此認(rèn)為瘦型小鼠是良好的篩選模型。

每日一次(qd)或兩次(bid)皮下施用在10mm磷酸鹽、2％(w/vol)甘油、500ppm(＝0.05％)聚山梨酯80，ph＝8.15(2ml/kg)中的所述化合物1mg/kg，持續(xù)7天(n＝7-8)。相應(yīng)的媒介物處理組(對(duì)照)用10mm磷酸鹽、2％(w/vol)甘油、500ppm(＝0.05％)聚山梨酯80，ph＝8.15(2ml/kg)每日皮下處理兩次，持續(xù)7天(n＝6-8)。在給藥前以及在處理7天后再次測(cè)量體重。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7：第1天至第7天相對(duì)于基線的體重變化(百分比)

*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001單因素anova事后dunnet檢驗(yàn)比較化合物與相應(yīng)的媒介物，n＝6-8

以體重減輕的形式測(cè)得的在位置180處具有側(cè)鏈的fgf21衍生物的體內(nèi)效力高于在位置181處具有相同側(cè)鏈的衍生物。因此，體內(nèi)效力與體外效力相關(guān)。對(duì)體重減輕的影響依賴于血漿半衰期。如果血漿半衰期短，則每日給藥兩次增加效力。

盡管己在本文中說(shuō)明和描述了本發(fā)明的某些特征，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員現(xiàn)將會(huì)想到許多修改、替代、改變和等同物。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所附權(quán)利要求意欲涵蓋落入本發(fā)明的真實(shí)精神內(nèi)的所有這類(lèi)修改和改變。

序列表

<110>諾和諾德股份有限公司

<120>fgf21衍生物及其用途

<130>140109cn01

<160>20

<170>patentinversion3.5

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<212>prt

<213>智人

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