本發(fā)明涉及包含至少一個(gè)氨基酸修飾的工程化的梭菌毒素，以及這樣的工程化的梭菌毒素在醫(yī)學(xué)和治療中的用途。梭菌屬(clostridia)中的細(xì)菌產(chǎn)生高度強(qiáng)大的并且特異性的蛋白毒素，它們能夠毒害它們被遞送之處的神經(jīng)元和其它細(xì)胞。這樣的梭菌毒素的實(shí)例包括由破傷風(fēng)梭菌(c.tetani)(tent)和肉毒梭菌(c.botulinum)(bont)血清型a-g產(chǎn)生的神經(jīng)毒素以及由巴氏梭菌(c.baratii)和丁酸梭菌(c.butyricum)產(chǎn)生的那些神經(jīng)毒素。在梭菌毒素中有一些是已知最強(qiáng)大的毒素。例如，肉毒梭菌神經(jīng)毒素對(duì)于小鼠的半數(shù)致死劑量(ld50)值范圍為0.5至5ng/kg，這取決于血清型。破傷風(fēng)梭菌毒素和肉毒梭菌毒素兩者都通過抑制受影響的神經(jīng)元的功能(特別是神經(jīng)遞質(zhì)的釋放)而起作用。雖然肉毒梭菌毒素在神經(jīng)肌肉接頭處起作用并且抑制周圍神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能的傳導(dǎo)，但是破傷風(fēng)梭菌毒素卻在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起作用。在自然界中，梭菌毒素是以單鏈多肽形式被合成的，通過一種蛋白酶解切割事件對(duì)該多肽進(jìn)行翻譯后的修飾而形成通過二硫鍵連接在一起的兩條多肽鏈。切割發(fā)生在特異性的切割位點(diǎn)(常常被稱為活化位點(diǎn))處，其位于提供鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基之間。正是這種雙鏈形式成為了毒素的活性形式。這兩條鏈被稱為重鏈(h-鏈)(具有大約100kda的分子量)和輕鏈(l-鏈)(具有大約50kda的分子量)。h-鏈包含n-末端易位元件(hn結(jié)構(gòu)域)和c-末端靶向元件(hc結(jié)構(gòu)域)。切割位點(diǎn)位于l-鏈和易位結(jié)構(gòu)域元件之間。在hc結(jié)構(gòu)域與它的靶標(biāo)神經(jīng)元結(jié)合以及所結(jié)合的毒素經(jīng)由內(nèi)體內(nèi)化到細(xì)胞中以后，hn結(jié)構(gòu)域使l-鏈易位跨越內(nèi)體膜并且進(jìn)入胞質(zhì)中，并且l-鏈提供蛋白酶功能(也被稱為無(wú)細(xì)胞毒性的蛋白酶)。無(wú)細(xì)胞毒性的蛋白酶通過蛋白酶解切割被稱為snare蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如snap-25、vamp或突觸融合蛋白)而起作用-參見geraldk(2002)“cellandmolecularbiology”(第4版)johnwiley&sons,inc。首字母縮略詞snare源于術(shù)語(yǔ)可溶性的nsf連接受體，其中nsf意指n-乙基馬來酰亞胺-敏感因子。snare蛋白是細(xì)胞內(nèi)的小泡融合體所必需的，因此是經(jīng)由小泡轉(zhuǎn)運(yùn)的來自細(xì)胞的分子分泌所必需的。蛋白酶功能是鋅依賴性的內(nèi)肽酶活性并且顯示對(duì)snare蛋白的高度底物特異性。因此，一旦被遞送到所要的靶細(xì)胞，無(wú)細(xì)胞毒性的蛋白酶就能夠抑制來自靶細(xì)胞的細(xì)胞分泌。梭菌毒素的l-鏈蛋白酶是切割snare蛋白的無(wú)細(xì)胞毒性的蛋白酶。鑒于snare蛋白的遍在本性，梭菌毒素例如肉毒梭菌毒素已經(jīng)被成功地應(yīng)用在廣泛的治療中。舉例來說，我們參考williamj.lipham,cosmeticandclinicalapplicationsofbotulinumtoxin(slack,inc.,2004)，它描述了梭菌毒素，例如肉毒梭菌神經(jīng)毒素(bonts)、bont/a、bont/b、bont/c1、bont/d、bont/e、bont/f和bont/g以及破傷風(fēng)梭菌神經(jīng)毒素(tent)的用途，用于在許多治療和美容化妝或美學(xué)應(yīng)用中抑制神經(jīng)元傳導(dǎo)-例如，市售的肉毒梭菌毒素產(chǎn)品目前被批準(zhǔn)作為下列適應(yīng)證的治療劑，包括局灶性痙攣、上肢痙攣、下肢痙攣、頸肌張力障礙、眼瞼痙攣、半面痙攣、腋窩多汗癥、慢性偏頭痛、神經(jīng)源性逼尿肌過度活動(dòng)、眉間線和嚴(yán)重的外眥線。另外，描述了梭菌毒素治療用于治療神經(jīng)肌肉障礙(參見us6,872,397)；用于治療子宮障礙(參見us2004/0175399)；用于治療潰瘍和胃食管反流病(參見us2004/0086531)；用于治療肌張力障礙(參見us6,319,505)；用于治療眼障礙(參見us2004/0234532)；用于治療眼瞼痙攣(參見us2004/0151740)；用于治療斜視(參見us2004/0126396)；用于治療疼痛(參見us6,869,610、us6,641,820、us6,464,986和us6,113,915)；用于治療纖維肌痛(參見us6,623,742、us2004/0062776)；用于治療下背痛(參見us2004/0037852)；用于治療肌肉損傷(參見us6,423,319)；用于治療竇性頭痛(參見us6,838,434)；用于治療緊張性頭痛(參見us6,776,992)；用于治療頭痛(參見us6,458,365)；用于減少偏頭痛性頭痛(參見us5,714,469)；用于治療心血管疾病(參見us6,767,544)；用于治療神經(jīng)障礙例如帕金森病(參見us6,620,415、us6,306,403)；用于治療神經(jīng)精神障礙(參見us2004/0180061、us2003/0211121)；用于治療內(nèi)分泌障礙(參見us6,827,931)；用于治療甲狀腺障礙(參見us6,740,321)；用于治療膽堿能影響的汗腺障礙(參見us6,683,049)；用于治療糖尿病(參見us6,337,075、us6,416,765)；用于治療胰腺障礙(參見us6,261,572、us6,143,306)；用于治療癌癥例如骨腫瘤(參見us6,565,870、us6,368,605、us6,139,845、us2005/0031648)；用于治療耳障礙(參見us6,358,926、us6,265,379)；用于治療自主性障礙例如胃腸肌肉障礙和其它平滑肌功能障礙(參見us5,437,291)；用于治療與皮膚細(xì)胞增殖障礙相關(guān)的皮膚損傷(參見us5,670,484)；用于控制神經(jīng)原性炎性障礙(參見us6,063,768)；用于減少脫發(fā)和刺激毛發(fā)生長(zhǎng)(參見us6,299,893)；用于治療嘴角朝下(參見us6,358,917)；用于減少食欲(參見us2004/40253274)；用于牙齒的治療和牙科手術(shù)(參見us2004/0115139)；用于治療神經(jīng)肌肉障礙和病癥(參見us2002/0010138)；用于治療多種障礙和病癥以及相關(guān)的疼痛(參見us2004/0013692)；用于治療由粘液分泌過多引起的病癥例如哮喘和copd(參見wo00/10598)；以及用于治療非神經(jīng)元病癥例如炎癥、內(nèi)分泌病癥、外分泌病癥、免疫病癥、心血管病癥、骨病癥(參見wo01/21213)。將全部以上出版物的全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。預(yù)期無(wú)細(xì)胞毒性的蛋白酶例如梭菌毒素(例如bont和tent)在治療性和美容化妝性處理人和其它哺乳動(dòng)物中的用途將要擴(kuò)大到范圍日益寬廣的能夠受益于這些毒素性質(zhì)的疾病和不適。為了避免系統(tǒng)性的神經(jīng)作用，許多梭菌毒素療法利用向給定的靶位點(diǎn)(例如靶組織)直接施用梭菌毒素治療劑。當(dāng)以這種方式施用基于梭菌毒素的治療劑時(shí)的一個(gè)問題是毒素遠(yuǎn)離施用位點(diǎn)而進(jìn)入周圍組織或系統(tǒng)性循環(huán)的傳播。毒素遠(yuǎn)離靶組織的擴(kuò)散被認(rèn)為對(duì)不想要的副作用負(fù)責(zé)，這些副作用在極端情況下可能會(huì)是威脅生命的。當(dāng)以高的劑量、濃度和注射體積使用梭菌毒素治療劑(例如bont治療劑)時(shí)，這可能是一個(gè)特別的關(guān)注。對(duì)于商業(yè)化的bont/a治療劑，已經(jīng)報(bào)道的與這個(gè)問題相關(guān)的副作用包括：無(wú)力、廣泛性肌肉虛弱、復(fù)視、下垂、吞咽困難、發(fā)聲困難、構(gòu)音困難、尿失禁和呼吸困難。吞咽和呼吸困難可能是威脅生命的并且已經(jīng)報(bào)道了與毒素作用的傳播相關(guān)的死亡。因此，在本領(lǐng)域中存在對(duì)這樣的梭菌毒素的需要:與已知的梭菌毒素相比，它在施用位點(diǎn)具有增大的組織保留性質(zhì)并且因此顯示出遠(yuǎn)離施用位點(diǎn)的擴(kuò)散的減少。本發(fā)明通過提供工程化的梭菌毒素解決了上述問題，正如權(quán)利要求書中具體說明的那樣。一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含至少一個(gè)(例如至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè))氨基酸修飾的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.2個(gè)(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位，并且其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾不位于梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，“不位于梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc)結(jié)構(gòu)域中”是指所述的至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的hn結(jié)構(gòu)域或梭菌毒素的輕鏈中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個(gè)(例如至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè))氨基酸修飾的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.2個(gè)(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位，并且其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾不位于梭菌毒素的易位結(jié)構(gòu)域(hn結(jié)構(gòu)域)中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個(gè)(例如至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè))氨基酸修飾的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.2個(gè)(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位，并且其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的輕鏈中。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素輕鏈中，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾不向梭菌毒素的輕鏈引入e3連接酶識(shí)別基序。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素的輕鏈不包含e3連接酶識(shí)別基序。如上所使用的，術(shù)語(yǔ)“e3連接酶識(shí)別基序”是指輕鏈的修飾，其導(dǎo)致神經(jīng)毒素多肽被應(yīng)用神經(jīng)毒素的個(gè)體中存在的內(nèi)源性蛋白酶體降解途徑加速降解?！癳3連接酶識(shí)別”基序是允許通過e3連接酶(也稱為e3泛素連接酶；因此，“e3連接酶識(shí)別基序”也可以稱為“e3泛素連接酶識(shí)別基序”)識(shí)別基序并且結(jié)合基序的結(jié)構(gòu)基序。e3連接酶識(shí)別基序是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。e3連接酶識(shí)別基序的實(shí)例包括以下序列(其中“x”可以表示任何天然存在的氨基酸)：e3連接酶識(shí)別基序的其它實(shí)例包括：etfsdlwkllpe(seqidno：20)，tsfaeywnllsp(seqidno：21)，ltfehywaqlts(seqidno：22)，ltfehwwaqlts(seqidno：23)，ltfehswaqlts(seqidno：24)，etfehnwaqlts(seqidno：25)，ltfehnwaqlts(seqidno：26)，ltfehwwaslts(seqidno：27)，ltfehwwsslts(seqidno：28)，ltfthwwaqlts(seqidno：29)，etfehwwaqlts(seqidno：30)，ltfehwwsqlts(seqidno：31)，ltfehwwaqlls(seqidno：32)，etfehwwsqlls(seqidno：33)，rfmdywegl(seqidno：34)，mprfmdywegln(seqidno：35)，sqetfsdlwkllpen(seqidno：36)，和ltfehnwaqlen(seqidno：37).在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的輕鏈中，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾不向梭菌毒素的輕鏈引入mdm2e3連接酶識(shí)別基序。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素的輕鏈不包含mdm2e3連接酶識(shí)別基序。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的輕鏈中，工程化的梭菌毒素在n-末端脯氨酸不包含氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，并且其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的輕鏈中，所述工程化的bont/e在以下氨基酸位置中的任何一個(gè)上不包含用賴氨酸的取代：q53、n72、n378、n379、r394、t400。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，并且其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的輕鏈中，所述的工程化的bont/e在以下氨基酸位置中的任何一個(gè)上不包含用賴氨酸的取代：q53、n72、n378、n379、t400。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，并且其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的輕鏈中，所述的工程化的bont/e在以下氨基酸位置中的任何三個(gè)上不包含用賴氨酸的取代：q53、n72、n378、n379、r394、t400。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，并且其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的輕鏈中，所述的工程化的bont/e在以下氨基酸位置中的任何三個(gè)上不包含用賴氨酸的取代：q53、n72、n378、n379、t400。在一個(gè)實(shí)施方案中，任選地其中至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的輕鏈中，工程化的梭菌毒素不是bont/e。本發(fā)明的工程化的梭菌毒素不包含位于梭菌毒素hc結(jié)構(gòu)域中的任何氨基酸修飾。因此，在本發(fā)明的工程化的梭菌毒素中，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾不位于梭菌毒素的hc結(jié)構(gòu)域中。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的輕鏈中，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾不包括用賴氨酸殘基取代氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的梭菌毒素，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾包括用賴氨酸或精氨酸殘基取代酸性氨基酸殘基或不帶電荷的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的梭菌毒素，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾包括用精氨酸殘基取代酸性氨基酸殘基或不帶電荷的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的pi增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.4個(gè)pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的pi增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.5個(gè)pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的pi增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.6個(gè)pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的pi增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.8個(gè)pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的pi增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少1個(gè)pi單位。在某些實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素包含至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90個(gè)氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的pi增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少2、3、4或5個(gè)pi單位。在某些實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素包含至少3個(gè)氨基酸修飾，并且所述的至少3個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的pi增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少3個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.2個(gè)pi單位。在某些實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素包含至少5個(gè)氨基酸修飾，并且所述至少5個(gè)氨基酸修飾把工程化的梭菌毒素的pi增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少5個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.5個(gè)pi單位。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過增大梭菌毒素的pi，例如增大至少0.2個(gè)pi單位或0.5個(gè)pi單位或1個(gè)pi單位(通過向梭菌毒素蛋白中引入至少一個(gè)氨基酸修飾)，所得的工程化的梭菌毒素有利地顯示了增大的組織保留性質(zhì)和減少的遠(yuǎn)離施用位點(diǎn)的擴(kuò)散，同時(shí)保留了靶細(xì)胞結(jié)合、易位以及靶snare蛋白切割的能力。因此，與缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素相比，所述的梭菌毒素從施用位點(diǎn)的傳播被顯著地減少了。本發(fā)明的工程化的梭菌毒素適用于任何上述的治療，并且與使用已知的梭菌毒素治療劑相比，可以有利地顯示副作用的減少或不存在。本發(fā)明的工程化的梭菌毒素的增大的組織保留性質(zhì)還提供了增加的作用效力和/或持續(xù)時(shí)間，并且與已知的梭菌毒素治療劑相比，能夠允許使用減少的劑量(或增大的劑量而沒有任何額外的副作用)，從而提供了進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，與相應(yīng)的未修飾的梭菌毒素相比，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素具有增大的效力、增大的組織保留和/或增長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間。正如下面更詳細(xì)地論述的那樣，由至少一個(gè)氨基酸修飾所提供的pi的增大意思是本發(fā)明的工程化的梭菌毒素在給定的ph下具有的凈電荷比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素上的凈電荷更正。不希望受任何一種理論限制，本發(fā)明人相信，這種增大的正電荷允許本發(fā)明的工程化的梭菌毒素在施用位點(diǎn)處展示更長(zhǎng)的組織保留時(shí)間，這歸因于在施用位點(diǎn)處，在工程化的梭菌毒素與陰離子細(xì)胞外組分(例如細(xì)胞膜和硫酸肝素蛋白聚糖)之間有利的靜電相互作用。這些改善的靜電相互作用用于減少了工程化的梭菌毒素遠(yuǎn)離施用位點(diǎn)的擴(kuò)散，從而改善了組織保留。舉例來說，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素的改善的組織保留性質(zhì)可以允許(i)更高的劑量進(jìn)入個(gè)別的肌肉，例如胸鎖乳突肌，而不會(huì)傳播到附近的頸部肌肉中而引起吞咽困難，以及(ii)在單次治療中更高的總劑量(對(duì)于所有的肌肉)，而不會(huì)傳播到循環(huán)中，引起系統(tǒng)性的效應(yīng)例如呼吸困難。對(duì)于患者的益處可以包括對(duì)大肌肉(例如胸鎖乳突肌)的更有效的治療、增大的在每次治療期間注射幾塊不同的肌肉的機(jī)會(huì)以及由于更高的給藥而導(dǎo)致的可能更長(zhǎng)的有效治療持續(xù)時(shí)間(再次治療之前更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間是必要的)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素在使用中具有正的凈電荷(例如當(dāng)工程化的梭菌毒素在使用中位于組織中的所要施用位點(diǎn)時(shí))。等電點(diǎn)(pi)是給定蛋白質(zhì)的特性。正如本領(lǐng)域中眾所周知的那樣，蛋白質(zhì)是由特定的氨基酸(當(dāng)在一種蛋白質(zhì)中時(shí)，也被稱為氨基酸殘基)序列組成。20種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)集合中的每一種氨基酸都具有不同的側(cè)鏈(或r基團(tuán))，意味著在一種蛋白質(zhì)中，每一種氨基酸殘基顯示不同的化學(xué)性質(zhì)例如電荷和疏水性。這些性質(zhì)可以受周圍化學(xué)環(huán)境(例如溫度和ph)的影響。一種蛋白質(zhì)的總的化學(xué)特征將會(huì)取決于這些多種因素的總和。某些氨基酸殘基(下面詳述)具有能夠電離的側(cè)鏈，該側(cè)鏈可能顯示電荷，取決于周圍的ph。在給定的ph下，這樣的側(cè)鏈?zhǔn)欠駧щ娙Q于相關(guān)的能夠電離的部分的pka，其中pka是酸的一個(gè)指定質(zhì)子從一個(gè)共軛堿分離的解離常數(shù)(ka)的負(fù)對(duì)數(shù)。例如酸性的殘基例如天冬氨酸和谷氨酸具有pka值大約為4.1(精確的pka值可能取決于溫度、離子強(qiáng)度和能夠電離的基團(tuán)的微環(huán)境)的側(cè)鏈羧酸基團(tuán)。因此，這些側(cè)鏈在ph7.4下(經(jīng)常被稱為“生理ph”)顯示負(fù)的電荷。在低ph值下，這些側(cè)鏈將會(huì)變成質(zhì)子化的并且失去它們的電荷。相反地，堿性的殘基例如賴氨酸和精氨酸具有pka值大約為10-12的含氮的側(cè)鏈基團(tuán)。這些側(cè)鏈因此在ph7.4下顯示正的電荷。在高ph值下，這些側(cè)鏈將會(huì)變成去質(zhì)子化的并且失去它們的電荷。因此，蛋白質(zhì)分子的總的(凈)電荷取決于存在于蛋白質(zhì)中的酸性殘基和堿性殘基的數(shù)目(以及它們的表面暴露程度)和環(huán)境的ph。改變環(huán)境的ph，就改變了蛋白質(zhì)上的總的電荷。因此，對(duì)于每一種蛋白質(zhì)，存在著一個(gè)給定的ph，在該ph下正電荷和負(fù)電荷的數(shù)目是相等的并且蛋白質(zhì)顯示總體上無(wú)凈電荷。這個(gè)點(diǎn)被稱為等電點(diǎn)(pi)。等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)生物化學(xué)中的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的概念，技術(shù)人員將會(huì)對(duì)它很熟悉。因此，等電點(diǎn)(pi)被定義為蛋白質(zhì)顯示零凈電荷時(shí)的ph值。pi的增大意味著蛋白質(zhì)顯示零凈電荷需要更高的ph值。因此，pi的增大表示在給定的ph下，蛋白質(zhì)的凈正電荷的增加。相反地，pi的減小意味著蛋白質(zhì)顯示零凈電荷需要更低的ph值。因此，pi的減小表示在給定的ph下，蛋白質(zhì)的凈正電荷的減少。在本領(lǐng)域中確定蛋白質(zhì)的pi的方法是已知的并且對(duì)于技術(shù)人員來說將會(huì)是熟悉的。舉例來說，從存在于蛋白質(zhì)中的每一種氨基酸的平均pka值能夠把蛋白質(zhì)的pi計(jì)算出來(“計(jì)算的pi”)。這樣的計(jì)算可以使用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行；用于計(jì)算pi值的優(yōu)選的示例性計(jì)算機(jī)程序包括來自scrippsresearchinstitute的proteincalculator和來自expasy的computepi/mw工具。應(yīng)該使用相同的計(jì)算技術(shù)/程序來比較不同分子之間的pi值。在適當(dāng)?shù)那闆r下，蛋白質(zhì)的計(jì)算的pi可以使用等電聚焦技術(shù)在試驗(yàn)中測(cè)定出來(“觀察到的pi”)。這種技術(shù)根據(jù)蛋白質(zhì)的pi使用電泳來分離蛋白質(zhì)。典型地使用具有固定化ph梯度的凝膠來進(jìn)行等電聚焦。當(dāng)應(yīng)用電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)遷移穿過ph梯度，直到它達(dá)到它具有零凈電荷時(shí)的ph，這個(gè)點(diǎn)就是蛋白質(zhì)的pi。通過等電聚焦提供的結(jié)果本質(zhì)上通常是相對(duì)較低的分辨率，因此本發(fā)明人認(rèn)為由計(jì)算的pi(如上所述)提供的結(jié)果更適合使用。在本說明書中，除非另有說明，否則“pi”是指“計(jì)算的pi”。通過改變顯示在蛋白質(zhì)表面上的堿性基團(tuán)和/或酸性基團(tuán)的數(shù)目，可以增大或減小蛋白質(zhì)的pi。這能夠通過修飾蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸來實(shí)現(xiàn)。例如，可以通過減少酸性殘基的數(shù)目或通過增大堿性殘基的數(shù)目來提供pi的增大。下面更詳細(xì)地討論這樣的氨基酸修飾。天然(未修飾的)梭菌毒素具有大約5-6的pi。因此，在ph7.4下，天然肉毒梭菌毒素具有負(fù)凈電荷。舉例來說，bont/a的pi是6.4，并且bont/a分子在ph7.4下具有-8的凈電荷。如上所述計(jì)算出了這些pi值。表1梭菌毒素pibont/a6.4bont/b5.3bont/c15.5bont/d5.5bont/e6.0bont/f5.6bont/g5.2tent5.8如上所述，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾將工程化的梭菌毒素的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.2個(gè)pi單位。因此，在本發(fā)明的上下文中，在工程化的bont/a梭菌毒素的上下文中pi增大0.2個(gè)單位將會(huì)是pi從6.4增大到6.6。如上所述，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾將工程化的梭菌毒素的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的至少一個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少1個(gè)pi單位。因此，在本發(fā)明的上下文中，在工程化的bont/a梭菌毒素的上下文中pi增大1個(gè)單位將會(huì)是pi從6.4增大到7.4。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素具有至少為5.5的pi。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素具有至少為6(例如至少6、至少7、至少8或至少9)的pi。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素具有至少為6.5的pi。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素具有至少為7的pi。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素具有6.5至9.5的pi(例如6.5至7.5的pi)。如上所述，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素具有增大的組織保留性質(zhì)，該性質(zhì)也提供了增大的效力和/或作用持續(xù)時(shí)間，并且與已知的梭菌毒素治療劑相比能夠允許減少使用的劑量(或者允許增大的劑量而沒有任何額外的效應(yīng))。其中可以定義這些有利的性質(zhì)(它們代表治療指數(shù)的增大)的一種方式是根據(jù)工程化的梭菌毒素的安全比。在這個(gè)方面，通過測(cè)量相關(guān)的動(dòng)物模型中體重減少的百分?jǐn)?shù)(例如小鼠，其中在7天的施用內(nèi)檢測(cè)體重減少)，能夠從試驗(yàn)上評(píng)估梭菌毒素的不希望的效應(yīng)(由毒素遠(yuǎn)離所述施用位點(diǎn)的擴(kuò)散引起的)。相反地，通過趾外展評(píng)分(das)分析(肌肉癱瘓量度)，能夠從試驗(yàn)上評(píng)估梭菌毒素的希望的中靶效應(yīng)?？梢酝ㄟ^將20μl配制在明膠磷酸鹽緩沖液中的梭菌毒素注射到小鼠腓腸肌/比目魚肌復(fù)合體中，然后通過使用aoki的方法評(píng)估趾外展評(píng)分(aokikr，toxicon39：1815-1820；2001)來進(jìn)行das分析。在das分析中，通過尾部短暫地懸掛小鼠以便引出特征性的驚恐反應(yīng)，其中小鼠伸展它的后肢并且外展它的后趾。在注射梭菌毒素后，按照五點(diǎn)量表(0＝正常至4＝趾外展和腿伸展減少最大)對(duì)不同程度的趾外展進(jìn)行評(píng)分。然后可以將梭菌毒素的安全比表示成在體重下降10％所需的毒素的量(在小鼠中給藥后第一個(gè)7天內(nèi)在峰值效應(yīng)下測(cè)得的)與das得分為2所需的毒素的量之間的比率。因此，高安全比得分是希望的，并且指示能夠有效地使靶肌肉癱瘓并且具有微小的不希望的脫靶效應(yīng)的毒素。本發(fā)明的工程化的毒素具有的安全比高于相當(dāng)?shù)奈葱揎椀?天然)肉毒梭菌毒素具有的安全比。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素具有至少為8(例如至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)的安全比，其中安全比是這樣計(jì)算的：體重變化-10％所需的毒素的劑量(pg/小鼠)除以dased50(pg/小鼠)[ed50＝產(chǎn)生為2的das得分所需的劑量]。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素具有至少為10的安全比。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素具有至少為15的安全比。本發(fā)明的工程化的梭菌毒素包含至少一個(gè)氨基酸修飾。所述的至少一個(gè)氨基酸修飾增大梭菌毒素的pi，如上所述。在本發(fā)明的上下文中，氨基酸修飾是梭菌毒素的氨基酸序列的修飾。這樣的修飾可以通過把序列中的一個(gè)氨基酸替換為另一個(gè)氨基酸(即取代)、通過把新的氨基酸插入序列中或者通過缺失序列的氨基酸來實(shí)施。被插入蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的氨基酸也被稱為氨基酸殘基。在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸如下所示：表2：下列氨基酸被認(rèn)為是帶電荷的氨基酸：天冬氨酸(負(fù)的)、谷氨酸(負(fù)的)、精氨酸(正的)和賴氨酸(正的)。在ph7.4下，天冬氨酸(pka3.1)和谷氨酸(pka4.1)的側(cè)鏈具有負(fù)電荷，同時(shí)精氨酸(pka12.5)和賴氨酸(pka10.8)的側(cè)鏈具有正電荷。天冬氨酸和谷氨酸被稱為酸性氨基酸殘基。精氨酸和賴氨酸被稱為堿性氨基酸殘基。下列氨基酸被認(rèn)為是不帶電荷的極性的(意思是它們能夠參與氫鍵鍵合)氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸。下列氨基酸被認(rèn)為是不帶電荷的疏水的氨基酸：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。通過向梭菌毒素中引入一個(gè)或多個(gè)增大梭菌毒素中正電荷與負(fù)電荷的比率的氨基酸修飾，能夠?qū)崿F(xiàn)梭菌毒素的pi的增大。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸修飾選自：氨基酸取代、氨基酸插入和氨基酸缺失。在氨基酸取代中，形成梭菌毒素氨基酸序列的一部分的氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基所替換。替換氨基酸殘基可以是如上所述的20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中的一種?？蛇x擇的是，在氨基酸取代中，替換的氨基酸可以是一種非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(不是上述20種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)組的一部分的氨基酸)。舉例來說，替換氨基酸可以是堿性非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，例如l-鳥氨酸、l-2-氨基-3-胍基丙酸，或賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸的d-異構(gòu)體)。把非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸引入蛋白質(zhì)中的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且包括使用大腸桿菌(e.coli)營(yíng)養(yǎng)缺陷型表達(dá)宿主的重組蛋白質(zhì)合成。在氨基酸插入中，把另外的氨基酸殘基(正常不存在的一個(gè)氨基酸)摻入梭菌毒素的氨基酸序列中，從而增大了所述的序列中氨基酸殘基的總數(shù)。在氨基酸缺失中，從梭菌毒素氨基酸序列中除去氨基酸殘基，從而減少了所述的序列中氨基酸殘基的總數(shù)。通過取代、插入或缺失氨基酸殘基來修飾蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域中已知的。舉例來說，可以通過對(duì)編碼梭菌毒素的dna序列的修飾來引入氨基酸修飾。這能夠使用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，例如通過定點(diǎn)誘變，其中采用聚合酶，使用為所要的氨基酸編碼的dna的短鏈(寡核苷酸)來替換原編碼序列，或者通過采用多種酶(例如連接酶和限制內(nèi)切核酸酶)插入/缺失基因的部分?？蛇x擇地，能夠化學(xué)合成修飾的基因序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸修飾選自：酸性氨基酸殘基被堿性氨基酸殘基取代；酸性氨基酸殘基被不帶電荷的氨基酸殘基取代；不帶電荷的氨基酸殘基被堿性氨基酸殘基取代；插入堿性氨基酸殘基；以及缺失酸性氨基酸殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸修飾是取代，該取代有利地保持了梭菌毒素中氨基酸殘基數(shù)相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，取代選自：酸性氨基酸殘基被堿性氨基酸殘基取代、酸性氨基酸殘基被不帶電荷的氨基酸殘基取代以及不帶電荷的氨基酸殘基被堿性氨基酸殘基取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿性氨基酸殘基是賴氨酸殘基或精氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿性氨基酸殘基是賴氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿性的氨基酸殘基是精氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中取代是酸性氨基酸殘基被不帶電荷的氨基酸殘基取代，酸性氨基酸殘基被它的相應(yīng)的不帶電荷的酰胺氨基酸殘基替換(即天冬氨酸被天冬酰胺替換，以及谷氨酸被谷氨酰胺替換)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸修飾是酸性氨基酸殘基被堿性氨基酸殘基取代或者不帶電荷的氨基酸殘基被堿性氨基酸殘基取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿性氨基酸殘基是賴氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿性氨基酸殘基是精氨酸殘基。本發(fā)明的工程化的梭菌毒素可以包含多于一個(gè)的氨基酸修飾。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)包含1至90個(gè)氨基酸修飾(例如1至80個(gè)、1至70個(gè)、1至60個(gè)、1至50個(gè)、1至40個(gè)、1至30個(gè)、1至20個(gè)、1至10個(gè)、3至50個(gè)、3至40個(gè)、3至30個(gè)、4至40個(gè)、4至30個(gè)、5至40個(gè)、5至30個(gè)或10至25個(gè)氨基酸修飾)。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)包含1至20個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)包含1至10個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)包含2至20個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)包含2至15個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)包含2至10個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)包含3至20個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)包含3至15個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)包含3至10個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)包含4至40個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素包含至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)或至少10個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素包含至少3個(gè)氨基酸修飾(例如至少3個(gè)氨基酸取代)。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素包含至少4個(gè)氨基酸修飾(例如至少4個(gè)氨基酸取代)。每一個(gè)所述的氨基酸修飾是如上所述的氨基酸修飾。因此，每一個(gè)所述的氨基酸修飾都有助于工程化的梭菌毒素的pi的增大(與缺乏所述的氨基酸修飾而其它方面相同的梭菌毒素的pi相比)。任何不位于梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)的梭菌毒素的氨基酸(即氨基酸殘基)都能夠如上所述被修飾，只要所述的修飾的結(jié)果是增大梭菌毒素的pi(如上所述)。然而，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了特別適合用于修飾的靶的梭菌毒素氨基酸的亞組。優(yōu)選的靶氨基酸可以具有某些性質(zhì)。舉例來說，優(yōu)選的靶氨基酸可以：(i)是表面暴露的氨基酸；(ii)位于梭菌毒素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的外面；(iii)位于梭菌毒素蛋白的不是蛋白質(zhì)功能所必需的區(qū)域中；(iv)是其同一性在梭菌毒素的類型、亞型或血清型之間沒有被保留的氨基酸；(iv)是其修飾沒有產(chǎn)生預(yù)期的泛素化位點(diǎn)的氨基酸；或(v)是前述的任意組合。如上所述，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素的特點(diǎn)是位于梭菌毒素hn易位結(jié)構(gòu)域或位于梭菌毒素輕鏈的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾。梭菌毒素輕鏈參考序列的實(shí)例包括：肉毒梭菌a型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-448肉毒梭菌b型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-440肉毒梭菌c1型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-441肉毒梭菌d型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-445肉毒梭菌e型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-422肉毒梭菌f型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-439肉毒梭菌g型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-441破傷風(fēng)梭菌神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-457。梭菌毒素hn結(jié)構(gòu)域參考序列的實(shí)例包括:肉毒梭菌a型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基449-871肉毒梭菌b型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基443-862肉毒梭菌c1型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基450-866肉毒梭菌d型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基449-871肉毒梭菌e型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基455-845肉毒梭菌f型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基450-864肉毒梭菌g型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基449-871破傷風(fēng)梭菌神經(jīng)毒素：氨基酸殘基456-879。梭菌毒素hc結(jié)構(gòu)域參考序列的實(shí)例包括:肉毒梭菌a型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基872-1278肉毒梭菌b型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基863-1291肉毒梭菌c1型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基867-1291肉毒梭菌d型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基872-1276肉毒梭菌e型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基846-1252肉毒梭菌f型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基865-1278肉毒梭菌g型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基872-1297破傷風(fēng)梭菌神經(jīng)毒素：氨基酸殘基880-1315。應(yīng)將上述參考序列視為指南，因?yàn)楦鶕?jù)亞血清型可能會(huì)發(fā)生輕微的變化。舉例來說，us2007/0166332(將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考)列舉了輕微不同的梭菌序列：輕鏈：肉毒梭菌a型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-k448肉毒梭菌b型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-k441肉毒梭菌c1型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-k449肉毒梭菌d型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-r445肉毒梭菌e型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-r422肉毒梭菌f型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-k439肉毒梭菌g型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-k446破傷風(fēng)梭菌神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-a457。hn結(jié)構(gòu)域：肉毒梭菌a型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基a449-k871肉毒梭菌b型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基a442-s858肉毒梭菌c1型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基t450-n866肉毒梭菌d型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基d446-n862肉毒梭菌e型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基k423-k845肉毒梭菌f型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基a440-k864肉毒梭菌g型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基s447-s863破傷風(fēng)梭菌神經(jīng)毒素：氨基酸殘基s458-v879。hc結(jié)構(gòu)域：肉毒梭菌a型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基n872-l1296肉毒梭菌b型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基e859-e1291肉毒梭菌c1型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基n867-e1291肉毒梭菌d型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基s863-e1276肉毒梭菌e型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基r846-k1252肉毒梭菌f型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基k865-e1274肉毒梭菌g型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基n864-e1297破傷風(fēng)梭菌神經(jīng)毒素：氨基酸殘基i880-d1315。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的至少一個(gè)氨基酸修飾位于梭菌毒素的易位結(jié)構(gòu)域(hn結(jié)構(gòu)域)中，所述的至少一個(gè)氨基酸修飾不位于梭菌毒素帶區(qū)域(beltregion)中。梭菌毒素帶區(qū)域(通過結(jié)構(gòu)和模型的目視檢查確定)定義如下：肉毒梭菌a型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基492-545肉毒梭菌b型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基472-532肉毒梭菌c1型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基494-543肉毒梭菌d型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基489-539肉毒梭菌e型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基466-515肉毒梭菌f型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基485-536肉毒梭菌g型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基489-538破傷風(fēng)梭菌神經(jīng)毒素：氨基酸殘基506-556。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸修飾(如上所述)是表面暴露的氨基酸殘基的修飾。表面暴露的氨基酸殘基是存在于折疊的蛋白質(zhì)的外部上的那些，并且因此易于接近周圍溶劑，與位于折疊的蛋白質(zhì)內(nèi)部中的那些氨基酸殘基相反。氨基酸殘基的表面暴露程度以及因此它暴露于周圍溶劑的程度取決于它在折疊的蛋白質(zhì)中的位置，也取決于蛋白質(zhì)采用的構(gòu)象。因此，與具有低表面暴露程度的氨基酸殘基的修飾相比，具有高表面暴露程度的氨基酸殘基的修飾可能對(duì)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)具有更大的影響。測(cè)定氨基酸殘基的表面暴露程度的方法是本領(lǐng)域中已知的。舉例來說，能夠使用計(jì)算機(jī)程序arealmol(ccp4計(jì)算機(jī)程序套件的一部分)來計(jì)算給定的蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的表面暴露程度。也可以通過目視檢查蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)(例如由x射線晶體學(xué)提供的)來鑒定表面暴露的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，表面暴露的氨基酸殘基具有至少40的總arealmol值。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸修飾包括選自以下的氨基酸殘基的修飾：天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、組氨酸殘基、天冬酰胺殘基、谷氨酰胺殘基、絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨酸殘基和異亮氨酸殘基。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定該組中的氨基酸殘基代表用于根據(jù)本發(fā)明的修飾的特別合適的靶。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中氨基酸修飾包括選自以下的氨基酸殘基的修飾：天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、組氨酸殘基、天冬酰胺殘基、谷氨酰胺殘基、絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨酸殘基和異亮氨酸殘基(如上所述)，氨基酸殘基被賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸殘基被精氨酸殘基取代。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，帶負(fù)電荷的殘基、極性殘基或不帶電荷的殘基被帶正電荷的殘基取代，從而增加了正電荷與負(fù)電荷的比例并且增加了梭菌毒素的pi。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸修飾(如上所述)包括天冬酰胺氨基酸殘基或谷氨酰胺氨基酸殘基(二者均為不帶電荷、極性殘基)的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸殘基被賴氨酸殘基或精氨酸殘基(二者均為帶正電荷的殘基)取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸殘基被賴氨酸殘基取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸殘基被精氨酸殘基取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素是bont/a。參考bont/a序列具有uniprotkb登錄號(hào)p10845。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/a，工程化的梭菌毒素是bont/a1。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/a梭菌毒素hn結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/a，所述的工程化的bont/a包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或全部55個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：d474、n476、d484、n486、i487、e488、a489、a490、e491、d546、e558、e560、h561、i566、l568、n570、s571、l577、n578、a597、e599、a601、e620、v621、t623、d625、t631、n645、l647、d650、d651、i668、e670、a672、v675、s683、i685、a686、n687、n752、q753、t755、e756、e757、e758、n760、n761、i762、n763、d825、i831、g832、t847、d848和d858；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/a的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/a的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/a，所述的工程化的bont/a包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15或全部17個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n476、s564、n578、e599、l647、d650、d651、v675、i685、n687、t755、e757、n761、n763、i831、t847和i849；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/a的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/a的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/a，所述的工程化的bont/a包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5或全部6個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：s564、l647、d650、d651、t847和i849；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/a的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/a的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/a，所述的工程化的bont/a包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5或全部6個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n476、n763、n687、e599、i831和n761；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/a的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/a的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/a，所述的工程化的bont/a包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4或全部5個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n578、v675、i685、t755和e757；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/a的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/a的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素是bont/b。參考bont/b序列具有uniprotkb登錄號(hào)p10844。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/b梭菌毒素hn結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/b，所述的工程化的bont/b包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或全部40個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：v443、g444、d453、s468、d533、e534、n535、t545、l548、d549、i550、d552、s557、l564、s566、n582、v584、n609、l619、n632、e633、g637、a646、i655、e657、v662、e669、s670、i672、d673、n739、i740、n748、n750、i818、g819、t834、i842、n845和s858；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/b的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/b的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素是bont/c1。參考bont/c1序列具有uniprotkb登錄號(hào)p18640。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/c1梭菌毒素hn結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/c1，所述的工程化的bont/c1包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或全部50個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：l451、d452、c453、e455、v472、t474、d475、l478、n483、e484、e485、e487、i489、l555、s556、d557、n558、e560、d561、e569、n574、s575、t584、g592、q594、g596、d617、n640、s641、v642、g645、n646、e661、e665、t667、a670、s678、v680、q681、e682、s750、g751、s759、q760、v826、g827、n842、t843、n847和n853；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/c1的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/c1的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素是bont/d。參考bont/d序列具有uniprotkb登錄號(hào)p19321。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/d梭菌毒素hn結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/d，所述的工程化的bont/d包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或全部62個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：q469、e470、e473、n474、d479、e480、n482、v483、q484、n485、s487、d488、s552、n553、n554、v555、e556、n557、i558、l560、t562、s563、v564、g569、s571、n572、g588、q590、t614、d616、s619、s622、n636、s637、l639、g641、n642、e657、e661、t663、a666、v669、s674、i676、q677、e678、s746、g747、d749、e751、n752、i753、q756、n818、v822、g823、e837、n838、t839、n843、n849和n850；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/d的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/b的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素是bont/e。參考bont/e序列具有uniprotkb登錄號(hào)q00496。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，工程化的梭菌毒素是bont/e3。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/e梭菌毒素hn結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，所述的工程化的bont/e包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或全部52個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：d474、n476、e479、e480、d484、n486、i487、e488、a489、a490、e491、e492、l496、d497、q500、q501、l504、n507、d509、n510、n514、s516、e518、q527、l530、n533、i534、e535、n539、y548、i566、l568、d589、a597、e599、a601、l604、y612、e620、n645、l647、y648、d651、e737、e741、y803、y824、d825、g828、i831、g832和d835；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/e的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/e的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素是bont/f。參考bont/f序列具有uniprotkb登錄號(hào)yp_001390123。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/f梭菌毒素hn結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/f，所述的工程化的bont/f包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或全部86個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n463、e464、n468、t469、d474、d475、t476、t477、n478、n482、n485、n495、i499、q501、i502、q505、t506、n508、t509、v511、d513、d521、s522、s526、e527、i528、e529、v534、d535、l536、e549、g550、t552、n553、s558、e566、e567、s568、v586、h587、q608、d613、a616、d617、s619、n630、n633、n639、e654、v656、e658、l660、t663、l665、v666、s671、i673、g674、s675、s676、e677、n678、t746、n751、l753、e754、e756、n758、i759、n760、n761、s799、s821、i822、n840、s841、e845、l846、s847、s848、t850、n851、d852、i854、l855和i856；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/f的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/f的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素是bont/g。參考bont/g序列具有uniprotkb登錄號(hào)q60393。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/g梭菌毒素hn結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/g，所述的工程化的bont/g包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或全部36個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n480、q482、n483、n484、t485、e487、d540、n562、n570、n571、n572、t588、v589、t615、d621、n637、e638、e642、n643、i660、e662、i667、e674、s675、v677、g678、n679、s747、n755、d757、l823、d839、i841、d844、s846和l847；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/g的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/g的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素是tent。參考tent序列具有uniprotkb登錄號(hào)p04958。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表tent梭菌毒素hn結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是tent，所述的工程化的tent包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或全部49個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：a457、s458、l459、d461、l462、e486、e487、q490、d491、n497、n504、d557、t571、t572、l573、q574、n580、s581、n588、s589、t590、s598、q605、g606、q608、t631、i633、s640、q655、e658、g659、n660、e675、i677、e679、t681、v684、a691、e692、s694、t695、q696、a772、d773、e774、s862、n866、l867和d868；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的tent的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的tent的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/a梭菌毒素輕鏈中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/a，所述的工程化的bont/a包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或全部28個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n5、q7、n9、d12、n15、q31、d58、n60、d74、n82、t122、d124、e126、q139、d141、e281、l284、s295、q311、d326、d334、n377、tyr387、n394、n396、n410、m411和n418；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/a的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/a的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/b梭菌毒素輕鏈中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/b，所述的工程化的bont/b包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40或全部41個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n6、n7、n9、n11、d12、n16、n17、n18、d41、e48、e57、n60、d75、d77、n80、e127、n130、n144、e147、e149、e185、n216、d245、e253、n316、d333、e335、d341、n385、d388、n389、e390、e395、e396、d402、d404、e406、e408、q419、e423和e427；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/b的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/b的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/c1梭菌毒素輕鏈中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/c1，所述的工程化的bont/c1包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或全部41個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n6、n7、n9、d12、d15、n18、n31、e32、n55、n59、n75、n120、n121、n125、d128、q142、n145、n177、n178、q183、e184、d208、e211、q247、n255、n311、e335、e339、n343、n368、n386、d389、d390、n391、q396、n405、n407、n425、e427、d442和n448；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/c1的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/c1的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/d梭菌毒素輕鏈中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/d，所述的工程化的bont/d包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30或全部34個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：d7、n9、d12、n15、d16、n17、d53、d73、d119、e124、e139、e142、n143、q177、q178、n180、e184、e255、n308、d335、n336、n339、n343、n368、n386、d389、d390、n391、d397、n403、n407、e409、e416和n443；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/d的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/d的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/e梭菌毒素輕鏈中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，所述的工程化的bont/e包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、35或全部37個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n5、n8、n10、d11、n14、d15、q27、e28、q53、n72、q75、d117、n118、d121、n122、q123、n138、n169、n170、n195、q237、ile244、q290、n293、n297、d312、q344、n362、n365、d366、n370、e373、n378、n379、n383、n390和t397；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/e的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/e的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，所述的工程化的bont/e包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15或20個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n5、n8、n10、d11、n14、d15、q27、e28、n72、q75、n118、d121、n122、q123、n138、q237、q290、n297、n362、n365、d366、n378和n379；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/e的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/e的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，所述的工程化的bont/e包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15或全部19個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n5、n8、n10、d11、n14、d15、n72、q75、n118、n122、q123、n138、q237、q290、q297、n362、d366、n378和n379；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/e的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/e的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，所述的工程化的bont/e包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5或全部6個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n8、n10、q75、q123、n138和q237；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/e的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/e的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/e，所述的工程化的bont/e包含至少一個(gè)(例如，至少1、2或全部3個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：q123、n138和q237；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/e的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/e的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/f梭菌毒素輕鏈中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/f，所述的工程化的bont/f包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30或全部35個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n6、n9、n11、d12、n15、d16、d17、e28、d55、d60、d74、n76、e105、e121、n126、e127、n144、d185、n211、q252、n305、e310、d312、n314、n329、d331、n379、d382、d383、d384、e390、n396、n400、d414和d418；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/f的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/f的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表bont/g梭菌毒素輕鏈中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是bont/g，所述的工程化的bont/g包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、35或全部38個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n4、n7、n9、n11、d12、n15、d17、e48、q55、d57、n60、d75、d127、q144、e148、d149、q150、n178、e185、e208、d211、e255、d315、d332、n334、d340、e383、d387、n388、q393、n394、e395、n403、e407、e418、e422、e426和n443；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的bont/g的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的bont/g的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表tent輕鏈中的氨基酸修飾的優(yōu)選靶的某些氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中工程化的梭菌毒素是tent，所述的工程化的tent包含至少一個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、35或全部36個(gè))選自以下的氨基酸的修飾：n6、n7、n15、n16、d17、d31、e51、e57、n60、n76、n101、d126、d143、n167、d179、n180、e251、q257、n313、n316、d318、d335、n337、q339、n368、n387、d390、d391、n395、d396、e403、d406、e410、n421、d427和e450；并且所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾把工程化的tent的等電點(diǎn)(pi)增大到一個(gè)值，該值比缺乏所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾、其它方面相同的tent的pi高至少0.2個(gè)(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個(gè))pi單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基或精氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用賴氨酸殘基取代氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的修飾包括用精氨酸殘基取代氨基酸。本發(fā)明適用于許多不同種類的梭菌毒素。因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“梭菌毒素”包括由肉毒梭菌(肉毒梭菌神經(jīng)毒素血清型a、b、c1、d、e、f和g)、破傷風(fēng)梭菌(破傷風(fēng)神經(jīng)毒素)、丁酸梭菌(肉毒梭菌神經(jīng)毒素血清型e)和巴氏梭菌(肉毒梭菌神經(jīng)毒素血清型f)以及修飾的梭菌毒素或衍生自任何前述的衍生物制備的毒素。術(shù)語(yǔ)“梭菌毒素”也包括肉毒梭菌神經(jīng)毒素血清型h。肉毒梭菌神經(jīng)毒素(bont)是由肉毒梭菌以大的蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式制備的，該復(fù)合物由bont自身與多個(gè)輔助蛋白復(fù)合組成。目前有8種不同的類別的肉毒梭菌神經(jīng)毒素，即：肉毒梭菌神經(jīng)毒素血清型a、b、c1、d、e、f、g和h，所有這些共有相似的結(jié)構(gòu)和作用模式。基于被特異性的中和抗血清失活能夠區(qū)分不同的bont血清型，這種通過血清型的分類與在氨基酸水平上序列同一性百分比相關(guān)。基于氨基酸的序列同一性百分比，進(jìn)一步把給定的血清型bont蛋白質(zhì)劃分成不同的亞型。bonts在胃腸道中被吸收，并且在進(jìn)入全身循環(huán)以后，與膽堿能神經(jīng)末端的突出前膜結(jié)合并且阻止它們的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放。bont/b、bont/d、bont/f和bont/g切割突觸小泡蛋白/小泡締合性膜蛋白(vamp)；bont/c1、bont/a和bont/e切割突觸小體締合性25kda的蛋白(snap-25)；而bont/c1切割突觸融合蛋白。破傷風(fēng)梭菌毒素是由破傷風(fēng)梭菌以單一的血清型制備。丁酸梭菌制備bont/e，而巴氏梭菌制備bont/f。術(shù)語(yǔ)“梭菌毒素”也旨在包括修飾的梭菌毒素及其衍生物，包括但不限于下面描述的那些。修飾的梭菌毒素或衍生物可以包含與梭菌毒素的天然(未修飾的)形式相比已經(jīng)被修飾的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者可以包含不存在于梭菌毒素的天然(未修飾的)形式中的插入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。舉例來說，與天然(未修飾的)梭菌毒素序列相比，修飾的梭菌毒素可以在一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中含有修飾的氨基酸序列。這樣的修飾可以改變毒素的功能方面，例如生物學(xué)活性或持久性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素是工程化的修飾的梭菌毒素，或工程化的修飾的梭菌毒素衍生物，或工程化的梭菌毒素衍生物。修飾的梭菌毒素可以在重鏈的氨基酸序列(例如修飾的hc結(jié)構(gòu)域)中具有一個(gè)或多個(gè)修飾，其中所述修飾的重鏈以比天然(未修飾的)梭菌毒素更高或更低的親和性與靶神經(jīng)細(xì)胞結(jié)合。在hc結(jié)構(gòu)域中這樣的修飾能夠包括修飾hc結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合位點(diǎn)中或蛋白質(zhì)(sv2或突觸結(jié)合蛋白)結(jié)合位點(diǎn)中的殘基，該修飾改變了與靶神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)節(jié)苷脂受體和/或蛋白質(zhì)受體的結(jié)合。這樣的修飾的梭菌毒素的實(shí)例被描述在wo2006/027207和wo2006/114308中，將其二者的全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。修飾的梭菌毒素可以在輕鏈的氨基酸序列中具有一個(gè)或多個(gè)修飾，例如在底物結(jié)合或催化結(jié)構(gòu)域中的修飾，該修飾可以改變或修飾所述修飾的lc的snare蛋白特異性。這樣的修飾的梭菌毒素的實(shí)例被描述在wo2010/120766和us2011/0318385，將其二者的全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。修飾的梭菌毒素可以包含增大或減小修飾的梭菌毒素的生物學(xué)活性和/或生物學(xué)持久性的一個(gè)或多個(gè)修飾。例如，修飾的梭菌毒素可以包含基于亮氨酸或酪氨酸的基序，其中所述的基序增大或減小修飾的梭菌毒素的生物學(xué)活性和/或生物學(xué)持久性。合適的基于亮氨酸的基序包括xdxxxll、xexxxll、xexxxil和xexxxlm(其中x是任何氨基酸)。合適的基于酪氨酸的基序包括y-x-x-hy(其中hy是疏水的氨基酸)。包含基于亮氨酸和酪氨酸的基序的修飾的梭菌毒素的實(shí)例被描述在wo2002/08268，將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。術(shù)語(yǔ)“梭菌毒素”旨在包括雜合體和嵌合體梭菌毒素。雜合體梭菌毒素包含來自一種梭菌毒素或其亞型的輕鏈的至少一部分和來自另一種梭菌毒素或梭菌毒素亞型的重鏈的至少一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜合體梭菌毒素可以包含來自一種梭菌毒素亞型的完整輕鏈和來自另一種梭菌毒素亞型的重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合體梭菌毒素可以包含一種梭菌毒素亞型的重鏈的一部分(例如結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，重鏈的另一部分來自另一種梭菌毒素亞型。類似地或可選擇地，治療性元素可以包含來自不同的梭菌毒素的輕鏈部分。這樣的雜合體或嵌合體梭菌毒素是有用的，例如作為遞送手段，把這樣的梭菌毒素的治療益處遞送到對(duì)給定的梭菌毒素亞型有免疫抗性的患者，遞送到可以具有低于平均的給定的梭菌毒素重鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域的受體濃度的患者，或遞送到可以具有膜或小泡毒素底物的抗蛋白酶的變體(例如snap-25、vamp和突觸融合蛋白)的患者。雜合體和嵌合體梭菌毒素被描述在us8,071,110中，將該公開的全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素是工程化的雜合體梭菌毒素或工程化的嵌合體梭菌毒素。術(shù)語(yǔ)“梭菌毒素”旨在包括再靶向的梭菌毒素。在再靶向的梭菌毒素中，梭菌毒素被修飾為包含稱為靶向部分(tm)的外源配體。選擇tm以提供對(duì)所需的靶細(xì)胞的結(jié)合特異性，并且作為再靶向過程的一部分，梭菌毒素的天然結(jié)合部分(例如hc結(jié)構(gòu)域或hcc結(jié)構(gòu)域)可以被除去。再靶向技術(shù)例如被描述在：ep-b-0689459；wo1994/021300；ep-b-0939818；us6,461,617；us7,192,596；wo1998/007864；ep-b-0826051；us5,989,545；us6,395,513；us6,962,703；wo1996/033273；ep-b-0996468；us7,052,702；wo1999/017806；ep-b-1107794；us6,632,440；wo2000/010598；wo2001/21213；wo2006/059093；wo2000/62814；wo2000/04926；wo1993/15766；wo2000/61192；和wo1999/58571中，將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素是工程化的再靶向的梭菌毒素。本發(fā)明還包括具有非天然蛋白酶切割位點(diǎn)的梭菌毒素。在這樣的梭菌毒素中，天然的蛋白酶切割位點(diǎn)(也被稱為活化位點(diǎn)，如上所述)被修飾或被不是該梭菌毒素天然有的蛋白酶切割位點(diǎn)(即外源性切割位點(diǎn))替換。這樣的位點(diǎn)將會(huì)需要外源性蛋白酶進(jìn)行切割，這允許改善的對(duì)切割事件的時(shí)機(jī)和位置的控制。可以被用在梭菌毒素中的非天然蛋白酶切割位點(diǎn)包括：另外的蛋白酶切割位點(diǎn)包括被無(wú)細(xì)胞毒性的蛋白酶(例如被梭菌神經(jīng)毒素的輕鏈)切割的識(shí)別序列。這些包括被無(wú)細(xì)胞毒性的蛋白酶(例如梭菌神經(jīng)毒素的輕鏈)切割的snare(例如snap-25、突觸融合蛋白、vamp)蛋白質(zhì)識(shí)別序列。包含非天然蛋白酶切割位點(diǎn)的梭菌毒素被描述在us7,132,259、ep1206554-b2和us2007/0166332中，將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。術(shù)語(yǔ)蛋白酶切割位點(diǎn)也包括內(nèi)含肽，它是自切割序列。自剪接反應(yīng)是能夠控制的，例如通過改變存在的還原劑的濃度。本發(fā)明還包括包含“破壞性切割位點(diǎn)”的梭菌毒素。在所述的梭菌毒素中，在選定的位置，非天然的蛋白酶切割位點(diǎn)被摻入梭菌毒素中，使得在所述位點(diǎn)的切割將會(huì)減小梭菌毒素的活性或失活。在施用后，梭菌毒素遷移到非靶向的位置的事件中，破壞性的蛋白酶切割位點(diǎn)可能易受局部蛋白酶切割。合適的非天然蛋白酶切割位點(diǎn)包括上述的那些。包含破壞性切割位點(diǎn)的梭菌毒素被描述在wo2010/094905和wo2002/044199中，將其二者的全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。本發(fā)明的工程化的梭菌毒素，特別是其輕鏈組件，可以是聚乙二醇化的—這可以幫助增大穩(wěn)定性，例如輕鏈組件的作用持續(xù)時(shí)間。當(dāng)輕鏈包含bont/a、b或c1蛋白酶時(shí)，聚乙二醇化是特別優(yōu)選的。聚乙二醇化優(yōu)選包括把peg添加到輕鏈組件的n-末端。舉例來說，輕鏈的n-末端可以是被一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如半胱氨酸)殘基延長(zhǎng)，該殘基可以是相同的或不同的。一個(gè)或多個(gè)所述的氨基酸殘基可以具有它自己的與其相連的(例如共價(jià)連接的)peg分子。這種技術(shù)的實(shí)例被描述在wo2007/104567中，將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。本發(fā)明的工程化的梭菌毒素可以沒有復(fù)合蛋白，該復(fù)合蛋白存在于天然存在的梭菌毒素復(fù)合物中。本發(fā)明的工程化的梭菌毒素還可以包含數(shù)量有限的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。因此，除了20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以外，還可以用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(例如4-羥基脯氨酸、6-n-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)來取代本發(fā)明的工程化的梭菌毒素的氨基酸殘基。數(shù)量有限的非保守性的氨基酸、沒有被遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然的氨基酸可以被用來取代梭菌多肽的氨基酸殘基。本發(fā)明的工程化的梭菌毒素還可以包含非天然存在的氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亞甲基-脯氨酸、順式-4-羥基脯氨酸、反式-4-羥基-脯氨酸、n-甲基甘氨酸、別蘇氨酸、甲基-蘇氨酸、羥基-乙基半胱氨酸、羥基乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、派可酸、叔亮氨酸、正纈氨酸、2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯基-丙氨酸、4-氮雜苯基-丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本領(lǐng)域中已知有幾種方法用于把非天然存在的氨基酸殘基摻入蛋白質(zhì)中。例如可以采用體外系統(tǒng)，其中使用以化學(xué)方法氨?；囊种谱觮rnas抑制無(wú)義突變。用于合成氨基酸和氨?；痶rna的方法是本領(lǐng)域中已知的。包含無(wú)義突變的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和翻譯是在包含大腸桿菌s30提取物和商購(gòu)可獲得的酶和其它試劑的不含有細(xì)胞的體系中進(jìn)行的。通過層析法純化蛋白質(zhì)。參見，例如robertson等人,j.am.chem.soc.113:2722.1991；ellman等人,methodsenzymol.202:301,1991；chung等人,science259:806-9,1993；和chung等人,proc.natl.acad.sci.usa90:10145-9,1993)。在第二種方法中，翻譯是通過顯微注射突變的mrna和以化學(xué)方法氨?；囊种谱觮rnas在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行的(turcatti等人,j.biol.chem.271:19991-8,1996)。在第三種方法中，在不存在將要被替換的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)并且存在所需的非天然存在的氨基酸(例如2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情況下培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞。將非天然存在的氨基酸摻入多肽中，替換它的天然對(duì)應(yīng)物。參見koide等人,biochem.33:7470-6,1994。使用重組核酸技術(shù)能夠制備本發(fā)明的工程化的梭菌毒素。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的梭菌毒素(如上所述)是重組的工程化的梭菌毒素。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了核酸(例如dna)，其包含編碼如上所述的工程化的梭菌毒素的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸序列是作為包含啟動(dòng)子和終止子的dna載體的一部分而被制備的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體具有選自下列的啟動(dòng)子：在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體具有選自下列的啟動(dòng)子：可以使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法來制備本發(fā)明的核酸分子。因此，可以使用化學(xué)合成技術(shù)來制備核酸分子?？蛇x擇的是，可以使用分子生物學(xué)技術(shù)來制備本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明的dna構(gòu)建體優(yōu)選是在電腦中(insilico)被設(shè)計(jì)，然后通過常規(guī)的dna合成技術(shù)被合成的。根據(jù)將要被采用的最終的宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)表達(dá)系統(tǒng)，任選地針對(duì)密碼子偏倚修飾上述的核酸序列信息。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼如上所述的工程化的梭菌毒素的核酸序列是核酸序列，它與選自seqidnos：2、4和6的核酸序列具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98或99％)的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸序列與選自seqidno：2、4和6的核酸序列具有至少90％的序列同一性。本發(fā)明還提供了由如上所述的核酸序列編碼的多肽。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了包含氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與選自seqidnos：1、3和5的氨基酸序列具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98或99％)的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸序列與選自seqidnos：1、3和5的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的bont/a，并且所述的工程化的bont/a包含氨基酸序列(或由其組成)，該氨基酸序列與選自seqidnos：1、3和5的氨基酸序列具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9％)的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的bont/a，并且所述的工程化的bont/a包含seqidno：1、3或5的氨基酸序列(或由其組成)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了多肽，它包含seqidno:1、3或5的氨基酸序列(或由其組成)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了編碼如上所述的工程化的梭菌毒素的核酸，其中所述的核酸包含核酸序列，該核酸序列與選自seqidnos：2、4和6的核酸序列具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9％)的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸包含seqidno：2、4或6的核酸序列(或由其組成)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了核酸，它包含seqidno：2、4或6的核酸序列(或由其組成)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的bont/e，并且所述的工程化的bont/e包含氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno：7具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9％)的序列同一性。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼如上所述的工程化的梭菌毒素的核酸，其中所述的核酸包含核酸序列，該核酸序列與seqidno：8具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9％)的序列同一性。在兩個(gè)或更多個(gè)核酸或氨基酸序列之間的“序列同一性百分?jǐn)?shù)”是序列共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)。因此，可以這樣計(jì)算同一性％：相同的核苷酸/氨基酸的數(shù)量除以核苷酸/氨基酸的總數(shù)，乘以100。計(jì)算序列同一性％也可以考慮需要引入以優(yōu)化兩個(gè)或更多個(gè)序列的比對(duì)的空位的數(shù)量以及每個(gè)空位的長(zhǎng)度。在兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的序列比較和同一性百分比的確定可以使用特定的數(shù)學(xué)算法(例如blast)來進(jìn)行，該算法對(duì)于技術(shù)人員來說是熟悉的。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了制備單鏈工程化的梭菌毒素蛋白的方法，該蛋白具有輕鏈和重鏈，所述的方法包括在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸(所述的核酸如上所述)，裂解宿主細(xì)胞以提供包含單鏈工程化的梭菌毒素蛋白的宿主細(xì)胞勻漿液，并且分離單鏈工程化的梭菌毒素蛋白。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了活化工程化的梭菌毒素的方法，所述的方法包括提供能夠通過如上所述的制備單鏈工程化的梭菌毒素蛋白的方法得到的單鏈工程化的梭菌毒素蛋白，使多肽與切割多肽的蛋白酶在位于輕鏈和重鏈之間的識(shí)別位點(diǎn)(切割位點(diǎn))處接觸，從而把多肽轉(zhuǎn)化為雙鏈多肽，其中通過二硫鍵把輕鏈和重鏈連接在一起。本發(fā)明的工程化的梭菌毒素可以被用來預(yù)防或治療某些醫(yī)學(xué)或美容化妝性疾病和病癥。因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了如上所述的工程化的梭菌毒素，其用于醫(yī)藥中。在一個(gè)相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供了如上所述的工程化的梭菌毒素，其用于預(yù)防或治療選自下列的疾病或病癥：斜視、眼瞼痙攣、斜眼、張力失常(例如痙攣性張力失常、口顎肌張力失常、病灶性張力失常、遲發(fā)性張力失常、喉部張力失常、四肢張力失常、子宮頸張力失常)、斜頸(例如痙攣性斜頸)、受益于細(xì)胞/肌肉失能的美容治療(化妝美容性)應(yīng)用(經(jīng)由snare下調(diào)或失活)、神經(jīng)肌肉障礙或眼能動(dòng)性病癥(例如共同性斜視、垂直斜視、外直肌癱瘓、眼球震顫、甲狀腺機(jī)能障礙性肌病)、指痙攣、眼瞼痙攣、夜磨牙癥、肝豆?fàn)詈俗冃?、震顫、抽搐、?jié)段性肌陣攣、痙攣、由慢性多發(fā)性硬化癥引起的痙攣狀態(tài)、導(dǎo)致異常的膀胱控制的痙攣狀態(tài)、男性意像、背部痙攣、四頭肌僵痛、緊張性頭痛、提肌骨盆綜合征、脊柱裂、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙、帕金森氏病、口吃、半面痙攣、眼瞼障礙、腦性癱瘓、病灶性痙攣狀態(tài)、痙攣性結(jié)腸炎、神經(jīng)源性膀胱、肛門痙攣、四肢痙攣狀態(tài)、抽搐、震顫、夜磨牙癥、肛裂、弛緩不能、吞咽困難、流淚、多汗癥、過度流涎、過度胃腸分泌、肌肉疼痛(例如來自肌肉痙攣的疼痛)、頭痛(例如緊張性頭痛)、額皺紋、皮膚皺紋、癌癥、子宮障礙、泌尿生殖器障礙、泌尿生殖器-神經(jīng)障礙、慢性神經(jīng)原性炎癥和平滑肌障礙。在使用中，本發(fā)明使用藥物組合物，其包含工程化的梭菌毒素和至少一種選自下列的組分：藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑、拋射劑和/或鹽。可以配制本發(fā)明的工程化的梭菌毒素用于口服、非腸道、連續(xù)輸注、吸入或局部應(yīng)用。適用于注射的組合物可以是溶液劑、混懸劑或乳劑的形式或者是干燥粉末形式，在使用前把干燥粉末溶解或混懸在合適的載體中。在將要被局部遞送的工程化的梭菌毒素的情形中，工程化的梭菌毒素可以被配制成乳膏劑(例如用于局部應(yīng)用)，或用于皮下注射。局部遞送手段可以包括氣霧劑或其它噴霧劑(例如噴霧器)。在這個(gè)方面，工程化的梭菌毒素的氣霧劑制劑能夠遞送到肺和/或其它鼻的和/或支氣管的或氣道的通道?？梢栽趨⑴c受影響的器官的神經(jīng)支配的脊髓節(jié)段的水平，通過鞘內(nèi)或硬膜外注射到脊柱中，來給患者施用本發(fā)明的工程化的梭菌毒素。優(yōu)選的施用途徑是經(jīng)由腹腔鏡檢查和/或局部化的，特別肌內(nèi)注射。施用本發(fā)明的工程化的梭菌毒素的劑量范圍是產(chǎn)生所需的治療效果的那些劑量范圍。應(yīng)當(dāng)理解所需的劑量范圍取決于工程化的梭菌毒素或組合物的精確性質(zhì)、施用途徑、制劑的性質(zhì)、患者的年齡、患者病癥的性質(zhì)、程度或嚴(yán)重程度、禁忌癥(如果有的話)和主治醫(yī)師的判斷。能夠使用用于最優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)途徑來調(diào)節(jié)這些劑量水平的變化。合適的每日劑量(每kg患者的體重)在0.0001-1ng/kg，優(yōu)選在0.0001-0.5ng/kg，更優(yōu)選在0.002-0.5ng/kg，并且特別優(yōu)選在0.004-0.5ng/kg范圍內(nèi)。單位劑量能夠在少于1皮克至30ng變化，但是典型地將會(huì)在0.01至1ng/劑量的區(qū)域內(nèi)，可以每日施用或優(yōu)選不那么頻繁，例如每星期或每6個(gè)月。特別優(yōu)選的給藥方案基于0.05ng工程化的梭菌毒素作為1×劑量。在這個(gè)方面，優(yōu)選的劑量在1×-100×(即0.05-5ng)范圍內(nèi)。流體劑型典型地是利用工程化的梭菌毒素和不含熱原的無(wú)菌載體制備的。取決于所用的載體和濃度，能夠把工程化的梭菌毒素溶解或混懸在載體中。在制備溶液時(shí)，可以將工程化的梭菌毒素溶解于載體中，如果必要的話，通過添加氯化鈉把溶液制成等滲的，并且通過使用無(wú)菌技術(shù)通過無(wú)菌過濾器過濾來滅菌，然后填充到合適的無(wú)菌小瓶或安瓿中并且密封?？蛇x擇的是，如果溶液穩(wěn)定性是足夠的，則可以通過高壓滅菌法把處于密封容器中的溶液滅菌。有利地，可以把添加劑例如緩沖劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑或殺菌劑、助懸劑或乳化劑和或局部麻醉劑溶解在載體中。干燥粉末(在使用前將其溶解或混懸在合適的載體中)可以通過在無(wú)菌區(qū)使用無(wú)菌技術(shù)把預(yù)先滅菌的成分填充在無(wú)菌容器中來制備?？蛇x擇的是，可以在無(wú)菌區(qū)使用無(wú)菌技術(shù)把成分溶解在合適的容器中。然后把產(chǎn)品冷凍干燥，并且把容器無(wú)菌密封。除了把無(wú)菌組分混懸而不是溶解在無(wú)菌載體中并且滅菌不能夠通過過濾完成外，以基本上相同的方式制備適用于肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)注射的非腸道混懸劑?？梢砸詿o(wú)菌狀態(tài)分離組分，或可選擇的是，可以在分離后把組分滅菌，例如通過伽馬照射。有利地，把助懸劑例如聚乙烯吡咯烷酮包含在組合物中以促進(jìn)組分的均勻分布。根據(jù)本發(fā)明的施用可以利用多種遞送技術(shù)，包括微粒包囊、病毒遞送體系或高壓氣溶膠沖擊。附圖說明圖1cathn_v1(圖1a)、cathn_v2(圖1b)和cathn_v3(圖1c)純化的sds-page純化。圖2對(duì)于cathn_v1的大鼠胚胎脊髓神經(jīng)元(escn)中snap-25切割的百分比。將大鼠胚胎脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)3周，并且用cathn_v1處理24小時(shí)，然后用snap-25特異性抗體進(jìn)行western印跡。數(shù)據(jù)是來自三次獨(dú)立試驗(yàn)(一式三份)的平均值±sem。圖3在小鼠膈神經(jīng)偏側(cè)膈測(cè)定法(mpnhd)中bont/a和cathn_v1的功效(t50)。數(shù)據(jù)點(diǎn)是單個(gè)偏側(cè)膈制備物和平均值±sem。cathn_v1在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著慢于參考蛋白bont/a(listbiologicallaboratories)。單因素anova和dunnett多重比較檢驗(yàn)。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(單因素anova和dunnett多重比較檢驗(yàn))。圖4對(duì)于cathn_v2的大鼠胚胎脊髓神經(jīng)元(escn)中snap-25切割的百分比。將大鼠胚胎脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)3周，并且用cathn_v2處理24小時(shí)，然后用snap-25特異性抗體進(jìn)行western印跡。數(shù)據(jù)是來自三次獨(dú)立試驗(yàn)(一式三份)的平均值±sem。圖5在小鼠膈神經(jīng)偏側(cè)膈測(cè)定法(mpnhd)中bont/a和cathn_v2的功效(t50)。數(shù)據(jù)點(diǎn)是單個(gè)偏側(cè)膈制備物和平均值±sem。cathn_v2在統(tǒng)計(jì)學(xué)上等同于參考蛋白bont/a(listbiologicallaboratories)。單因素anova和dunnett多重比較檢驗(yàn)。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(單因素anova和dunnett多重比較檢驗(yàn))。圖6對(duì)于cathn_v3的大鼠胚胎脊髓神經(jīng)元(escn)中snap-25切割的百分比。將大鼠胚胎脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)3周，并且用cathn_v3處理24小時(shí)，然后用snap-25特異性抗體進(jìn)行western印跡。數(shù)據(jù)是來自三次獨(dú)立試驗(yàn)(一式三份)的平均值±sem。圖7在小鼠膈神經(jīng)偏側(cè)膈測(cè)定法(mpnhd)中bont/a和cathn_v3的功效(t50)。數(shù)據(jù)點(diǎn)是單個(gè)偏側(cè)膈制備物和平均值±sem。cathn_v3在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著慢于參考蛋白bont/a(listbiologicallaboratories)。單因素anova和dunnett多重比較檢驗(yàn)。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(單因素anova和dunnett多重比較檢驗(yàn))。圖8等電點(diǎn)聚焦分析。與未修飾的bont/a相比，所有三個(gè)cathn構(gòu)建體具有增加的觀察到的pi。圖9catlc構(gòu)建體的sds-page純化。圖10與bont/elc參考相比，catlc的催化活性，其中按照制造商的說明書，使用botesta/ebont檢測(cè)試劑盒(biosentinalcat#a1004)中獲得的pec50值。數(shù)據(jù)顯示一次獨(dú)立試驗(yàn)(一式三份)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。序列seqidno：1.工程化的bont/a，“cathn_v1”，氨基酸序列。seqidno：2.工程化的bont/a，“cathn_v1”，核酸序列。seqidno：3.工程化的bont/a，“cathn_v2”，氨基酸序列。seqidno：4.工程化的bont/a，“cathn_v2”，核酸序列。seqidno：5.工程化的bont/a，“cathn_v3”，氨基酸序列。seqidno：6.工程化的bont/a，“cathn_v3”，核酸序列。seqidno：7.工程化的bont/e輕鏈，“catlc”，氨基酸序列。seqidno：8.工程化的bont/e輕鏈，“catlc”，核酸序列。seqidno：1.工程化的bont/a，“cathn_v1”，氨基酸序列。mpfvnkqfnykdpvngvdiayikipnagqmqpvkafkihnkiwviperdtftnpeegdlnpppeakqvpvsyydstylstdnekdnylkgvtklferiystdlgrmlltsivrgipfwggstidtelkvidtncinviqpdgsyrseelnlviigpsadiiqfecksfghevlnltrngygstqyirfspdftfgfeeslevdtnpllgagkfatdpavtlahelihaghrlygiainpnrvfkvntnayyemsglevsfeelrtfgghdakfidslqenefrlyyynkfkdiastlnkaksivgttaslqymknvfkekyllsedtsgkfsvdklkfdklykmlteiytednfvkffkvlnrktylnfdkavfkinivpkvnytiydgfnlrntnlaanfngqnteinnmnftklknftglfefykllcvrgiitsktksldkgynkalndlcikvnnwdlffspsednftndlnkgeeitsdtnieaaeenisldliqqyyltfnfdnepenisienlssdiigqlelmpnierfpngkkyeldkytmfhylraqefehgkrrialtnsvneallnpsrvytffssdyvkkvnkateaamflgwveqlvydftdetsevsttdkiaditiiipyigpalnignmrykrrfvgalifsgavillefipeiaipvlgtfalvsyiankvltvqtidnalskrnekwdevykyivtnwlakvntqidlirkkmkealenqaeatkaiinyqynqyteeeknninfniddlssklnesinkamininkflnqcsvsylmnsmipygvkrledfdaslkdallkyiydnrgtligqvdrlkdkvnntlsrdrpfqlskyvdnqrllstfteyikniintsilnlryesnhlidlsryaskinigskvnfdpidknqiqlfnlesskievilknaivynsmyenfstsfwiripkyfnsislnneytiincmennsgwkvslnygeiiwtlqdtqeikqrvvfkysqminisdyinrwifvtitnnrlnnskiyingrlidqkpisnlgnihasnnimfkldgcrdthryiwikyfnlfdkelnekeikdlydnqsnsgilkdfwgdylqydkpyymlnlydpnkyvdvnnvgirgymylkgprgsvmttniylnsslyrgtkfiikkyasgnkdnivrnndrvyinvvvknkeyrlatnasqagvekilsaleipdvgnlsqvvvmkskndqgitnkckmnlqdnngndigfigfhqfnniaklvasnwynrqierssrtlgcswefipvddgwgerplseqidno：2.工程化的bont/a，“cathn_v1”，核酸序列。atgccattcgtcaacaagcaattcaactacaaagacccagtcaacggcgtcgacatcgcatacatcaagattccgaacgccggtcaaatgcagccggttaaggcttttaagatccacaacaagatttgggttatcccggagcgtgacaccttcacgaacccggaagaaggcgatctgaacccgccaccggaagcgaagcaagtccctgtcagctactacgattcgacgtacctgagcacggataacgaaaaagataactacctgaaaggtgtgaccaagctgttcgaacgtatctacagcacggatctgggtcgcatgctgctgactagcattgttcgcggtatcccgttctggggtggtagcacgattgacaccgaactgaaggttatcgacactaactgcattaacgttattcaaccggatggtagctatcgtagcgaagagctgaatctggtcatcattggcccgagcgcagacattatccaattcgagtgcaagagctttggtcacgaggttctgaatctgacccgcaatggctatggtagcacccagtacattcgtttttcgccggattttaccttcggctttgaagagagcctggaggttgataccaatccgttgctgggtgcgggcaaattcgctaccgatccggctgtcacgctggcccatgaactgatccacgcaggccaccgcctgtacggcattgccatcaacccaaaccgtgtgttcaaggttaatacgaatgcatactacgagatgagcggcctggaagtcagcttcgaagaactgcgcaccttcggtggccatgacgctaaattcattgacagcttgcaagagaatgagttccgtctgtactactataacaaattcaaagacattgcaagcacgttgaacaaggccaaaagcatcgttggtactaccgcgtcgttgcagtatatgaagaatgtgtttaaagagaagtacctgctgtccgaggatacctccggcaagtttagcgttgataagctgaagtttgacaaactgtacaagatgctgaccgagatttacaccgaggacaactt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agcacccagtacattcgtttttcgccggattttaccttcggctttgaagagagcctggaggttgataccaatccgttgctgggtgcgggcaaattcgctaccgatccggctgtcacgctggcccatgaactgatccacgcaggccaccgcctgtacggcattgccatcaacccaaaccgtgtgttcaaggttaatacgaatgcatactacgagatgagcggcctggaagtcagcttcgaagaactgcgcaccttcggtggccatgacgctaaattcattgacagcttgcaagagaatgagttccgtctgtactactataacaaattcaaagacattgcaagcacgttgaacaaggccaaaagcatcgttggtactaccgcgtcgttgcagtatatgaagaatgtgtttaaagagaagtacctgctgtccgaggatacctccggcaagtttagcgttgataagctgaagtttgacaaactgtacaagatgctgaccgagatttacaccgaggacaactttgtgaaattcttcaaagtgttgaatcgtaaaacctatctgaattttgacaaagcggttttcaagattaacatcgtgccgaaggtgaactacaccatctatgacggttttaacctgcgtaacaccaacctggcggcgaactttaacggtcagaatacggaaatcaacaacatgaatttcacgaagttgaagaacttcacgggtctgttcgagttctataagctgctgtgcgtgcgcggtatcatcaccagcaaaaccaaaagcctggacaaaggctacaacaaggcgctgaatgacctgtgcattaaggtaaacaattgggatctgttcttttcgccatccgaagataattttaccaacgacctgaacaagggtgaagaaatcaccagcgatacgaatattgaagcagcggaagagaatatcagcctggatctgatccagcagtactatctgacctttaacttcgacaatgaaccggagaacattagcattgagaatctgagcagcgacattatcggtcagctggaactgatgccgaatatcgaacgtttcccgaacggcaaaaagtacgagctggacaagtacactatgttccattacctgcgtgcacaggagtttgaacacggtaaaagccgtatcgcgctgaccaacagcgttaacgaggccctgctgaaaccgagccgtgtctataccttcttcagcagcgactatgttaagaaagtgaacaaagccactgaggccgcgatgttcctgggctgggtggaacagctggtatatgacttcacggacgagacgagcgaagtgagcactaccgacaaaattgctgatattaccatcattatcccgtatattggtccggcactgaacattggcaacatgctgtacaaagacgattttgtgggtgccctgatcttctccggtgccgtgattctgctggagttcattccggagattgcgatcccgaagttgggtaccttcgcgctggtgtcctacaaggcgaataaggttctgacggttcagaccatcgataacgcgctgtcgaaacgtaatgaaaaatgggacgaggtttacaaatacattgttacgaattggctggcgaaagtcaatacccagatcgacctgatccgtaagaaaatgaaagaggcgctggagaatcaggcggaggccaccaaagcaattatcaactaccaatacaaccagtacaaggaaaaagagaagaataacattaacttcaatatcgatgatttgagcagcaagctgaatgaatctatcaacaaagcgatgatcaatatcaacaagtttttgaatcagtgtagcgtttcgtacctgatgaatagcatgattccgtatggcgtcaaacgtctggaggacttcgacgccagcctgaaagatgcgttgctgaaatacatttacgacaatcgtggtacgctgattggccaagttgaccgcttgaaagacaaagttaacaataccctgagcaccgacatcccatttcaactgagcaagtatgttgataatcaacgtctgttgagcactttcaccgagtatatcaaaaacatcatcaatactagcattctgaacctgcgttacgagagcaatcatctgattgatctgagccgttatgcaagcaagatcaacatcggtagcaaggtcaattttgacccgatcgataagaaccagatccagctgtttaatctggaatcgagcaaaattgaggttatcctgaaaaacgccattgtctacaactccatgtacgagaatttctccaccagcttctggattcgcatcccgaaatacttcaacagcattagcctgaacaacgagtatactatcatcaactgtatggagaacaacagcggttggaaggtgtctctgaactatggtgagatcatttggaccttgcaggacacccaagagatcaagcagcgcgtcgtgttcaagtactctcaaatgatcaacatttccgattacattaatcgttggatcttcgtgaccattacgaataaccgtctgaataacagcaagatttacatcaatggtcgcttgatcgatcagaaaccgattagcaacctgggtaatatccacgcaagcaacaacattatgttcaaattggacggttgccgcgatacccatcgttatatctggatcaagtatttcaacctgtttgataaagaactgaatgagaaggagatcaaagatttgtatgacaaccaatctaacagcggcattttgaaggacttctggggcgattatctgcaatacgataagccgtactatatgctgaacctgtatgatccgaacaaatatgtggatgtcaataatgtgggtattcgtggttacatgtatttgaagggtccgcgtggcagcgttatgacgaccaacatttacctgaactctagcctgtaccgtggtacgaaattcatcattaagaaatatgccagcggcaacaaagataacattgtgcgtaataacgatcgtgtctacatcaacgtggtcgtgaagaataaagagtaccgtctggcgaccaacgcttcgcaggcgggtgttgagaaaattctgagcgcgttggagatccctgatgtcggtaatctgagccaagtcgtggttatgaagagcaagaacgaccagggtatcactaacaagtgcaagatgaacctgcaagacaacaatggtaacgacatcggctttattggtttccaccagttcaacaatattgctaaactggtagcgagcaattggtacaatcgtcagattgagcgcagcagccgtactttgggctgtagctgggagtttatcccggtcgatgatggttggggcgaacgtccgctgseqidno：7.工程化的bont/e輕鏈，“catlc”，氨基酸序列。mkieegklviwingdkgynglaevgkkfekdtgikvtvehpdkleekfpqvaatgdgpdiifwahdrfggyaqsgllaeitpdkafqdklypftwdavryngkliaypiavealsliynkdllpnppktweeipaldkelkakgksalmfnlqepyftwpliaadggyafkyengkydikdvgvdnagakagltflvdliknkhmnadtdysiaeaafnkgetamtingpwawsnidtskvnygvtvlptfkgqpskpfvgvlsaginaaspnkelakeflenylltdegleavnkdkplgavalksyeeelakdpriaatmenaqkgeimpnipqmsafwyavrtavinaasgrqtvdealkdaqtnsssnnnnnnnnnnlgiegrisefgsmpkinsfnyndpvndrtilyikpggcqefyksfnimkniwiipernvigttpqdfhpptslkngdssyydpnylqsdeekdrflkivtkifnrinnnlsggilleelskanpylgndntpdnkfhigdasaveikfskgsqhillpnviimgaepdlfetnssnislrnnympsnhgfgsiaivtfspeysfrfndnsinefiqdpaltlmhelihslhglygakg工tttciitqqknplitnrkginieefltfggndlniitvaqyndiytnllndyrkiasklskvqvsnpqlnpykdifqekygldkdasgiysvninkfddilkklysftefdlatkfqvkcretyigqykyfklsnllndsiynisegyninnlkvnfrgqnanlnpriikpitgrglvkkiirfavdklaaalehhhhhhseqidno：8.工程化的bont/e輕鏈，“catlc”，氨基酸序列。atgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgataaaggctataacggtctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaagtcaccgttgagcatccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggcaactggcgatggccctgacattatcttctgggcacacgaccgctttggtggctacgctcaatctggcctgttggctgaaatcaccccggacaaagcgttccaggacaagctgtatccgtttacctgggatgccgtacgttacaacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttgaagcgttatcgctgatttataacaaagatctgctgccgaacccgccaaaaacctgggaagagatcccggcgctggataaagaactgaaagcgaaaggtaagagcgcgctgatgttcaacctgcaagaaccgtacttcacctggccgctgattgctgctgacgggggttatgcgttcaagtatgaaaacggcaagtacgacattaaagacgtgggcgtggataacgctggcgcgaaagcgggtctgaccttcctggttgacctgattaaaaacaaacacatgaatgcagacaccgattactccatcgcagaagctgcctttaataaaggcgaaacagcgatgaccatcaacggcccgtgggcatggtccaacatcgacaccagcaaagtgaattatggtgtaacggtactgccgaccttcaagggtcaaccatccaaaccgttcgttggcgtgctgagcgcaggtattaacgccgccagtccgaacaaagagctggcaaaagagttcctcgaaaactatctgctgactgatgaaggtctggaagcggttaataaagacaaaccgctgggtgccgtagcgctgaagtcttacgaggaagagttggcgaaagatccacgtattgccgccactatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagactaattcgagctcgaacaacaacaacaataacaataacaacaacctcgggatcgagggaaggatttcagaattcggatccatgccaaaaatcaacagctttaattacaatgaccctgtaaacgatcgtaccatcctatacataaagccgggtgggtgtcaagagttctacaaatctttcaatattatgaagaatatatggattatacctgagcgtaacgttattggtacgacaccgcaagattttcatccacctacttcgttgaagaacggtgactcttcctattacgaccccaattatctccagtcggatgaagagaaggacagattccttaaaatagtaaccaaaatctttaacaggattaataacaatctatccggaggtattttgcttgaagagcttagtaaagctaatccttacctaggtaacgataatacaccagacaacaagtttcatataggcgatgcatccgccgtggaaatcaaatttagcaagggatcacagcatattctcttgcccaacgttattataatgggggcggaaccagatttatttgaaacaaattcgagtaatattagcctgagaaataactatatgccgtcaaaccatgggttcggtagcatagcgatcgttactttttctcccgaatacagttttcgcttcaatgataatagtataaatgagtttatccaagaccccgcactcacgcttatgcacgaactcatacactctttacacggcctgtatggcgctaaggggataaccactacgtgtatcattactcagcaaaagaacccattgataacgaacaggaagggcattaacatcgaggaatttcttacatttggaggcaacgatctgaacattataactgtcgcacagtacaatgacatctataccaacttactaaatgattatagaaaaatcgcttctaagttatccaaggttcaagtctcaaaccctcaactgaatccgtataaggacatattccaagagaaatatggattagacaaagacgcgtcaggaatctattcggtaaacattaacaaattcgacgatattttgaagaaactttacagcttcacggagttcgacttggccaccaaattccaggtcaaatgccgagagacatacatcggacagtataagtatttcaagctgtcgaatctcctgaatgattccatatacaacattagtgagggttacaatataaataacctaaaggtgaatttccgaggccaaaacgccaacctaaatccgcgcatcattaaacccatcacaggacgggggttagtgaagaaaataatccggtttgcggtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccac實(shí)施例以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，并不以任何方式限制權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1鑒定用于修飾的優(yōu)選的梭菌毒素氨基酸。使用多種不同的標(biāo)準(zhǔn)選擇鑒定為適合用于修飾(突變位點(diǎn))的候選物的氨基酸。1.bont分子內(nèi)殘基的位置(hn內(nèi)，不包括帶區(qū)域)；2.二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)的位置；3.殘基的類型；4.表面暴露度。對(duì)于選擇，考慮酸性、中性、極性和疏水性殘基。使用ccp4套件中的areaimol測(cè)定暴露的殘基。通過areaimol分析每個(gè)結(jié)構(gòu)，并且將暴露的殘基鑒定為具有大于55的和值。使用二級(jí)結(jié)構(gòu)分配程序(stridewebinterface)鑒別每個(gè)亞型和tent的hn內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。從選擇中排除分配為形成α-螺旋、β-鏈或310-螺旋的區(qū)域。所使用的序列登錄號(hào)：bont/a：p10845bont/b：p10844bont/c1：p18640bont/d：p19321bont/e：q00496bont/f：yp_001390123bont/g：q60393結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)源從rcsb獲得的bont/a(3bta.pdb)、bont/b(1epw)和bont/e(3ffz.pdb)的晶體結(jié)構(gòu)。使用loopp和以下序列分別進(jìn)行bont/c1、bont/d、bont/f和bont/g的同源性建模：p18640、p19321、yp_001390123和q60393。在梭菌毒素hn結(jié)構(gòu)域中優(yōu)選的用于修飾的梭菌毒素氨基酸殘基：bont/a：d474，n476，d484，n486，i487，e488，a489，a490，e491，d546，e558，e560，h561，i566，l568，n570，s571，l577，n578，a597，e599，a601，e620，v621，t623，d625，t631，n645，l647，d650，d651，i668，e670，a672，v675，s683，i685，a686，n687，n752，q753，t755，e756，e757，e758，n760，n761，i762，n763，d825，i831，g832，t847，d848，和d858bont/b：v443，g444，d453，s468，d533，e534，n535，t545，l548，d549，i550，d552，s557，l564，s566，n582，v584，n609，l619，n632，e633，g637，a646，i655，e657，v662，e669，s670，i672，d673，n739，i740，n748，n750，i818，g819，t834，i842，n845，和s858bont/c1：l451，d452，c453，e455，v472，t474，d475，l478，n483，e484，e485，e487，i489，l555，s556，d557，n558，e560，d561，e569，n574，s575，t584，g592，q594，g596，d617，n640，s641，v642，g645，n646，e661，e665，t667，a670，s678，v680，q68l，e682，s750，g751，s759，q760，v826，g827，n842，t843，n847，和n853bont/d：q469，e470，e473，n474，d479，e480，n482，v483，q484，n485，s487，d488，s552，n553，n554，v555，e556，n557，i558，l560，t562，s563，v564，g569，s571，n572，g588，q590，t614，d616，s619，s622，n636，s637，l639，g641，n642，e657，e661，t663，a666，v669，s674，i676，q677，e678，s746，g747，d749，e751，n752，i753，q756，n818，v822，g823，e837，n838，t839，n843，n849，和n850bont/e：d474，n476，e479，e480，d484，n486，i487，e488，a489，a490，e491，e492，l496，d497，q500，q501，l504，n507，d509，n510，n514，s516，e518，q527，l530，n533，i534，e535，n539，y548，i566，l568，d589，a597，e599，a601，l604，y612，e620，n645，l647，y648，d651，e737，e741，y803，y824，d825，g828，i831，g832，和d835bont/f：n463，e464，n468，t469，d474，d475，t476，t477，n478，n482，n485，n495，i499，q501，i502，q505，t506，n508，t509，v511，d513，d521，s522，s526，e527，i528，e529，v534，d535，l536，e549，g550，t552，n553，s558，e566，e567，s568，v586，h587，q608，d613，a616，d617，s619，n630，n633，n639，e654，v656，e658，l660，t663，l665，v666，s671，i673，g674，s675，s676，e677，n678，t746，n751，l753，e754，e756，n758，i759，n760，n761，s799，s821，i822，n840，s841，e845，l846，s847，s848，t850，n851，d852，i854，l855，和i856bont/g：n480，q482，n483，n484，t485，e487，d540，n562，n570，n571，n572，t588，v589，t615，d621，n637，e638，e642，n643，i660，e662，i667，e674，s675，v677，g678，n679，s747，n755，d757，l823，d839，i841，d844，s846，和l847tent：a457，s458，l459，d461，l462，e486，e487，q490，d491，n497，n504，d557，t571，t572，l573，q574，n580，s581，n588，s589，t590，s598，q605，g606，q608，t631，i633，s640，q655，e658，g659，n660，e675，i677，e679，t681，v684，a691，e692，s694，t695，q696，a772，d773，e774，s862，n866，l867和d868在bont/e輕鏈中優(yōu)選的用于修飾的梭菌毒素氨基酸殘基：n5，n8，n10，d11，n14，d15，q27，e28，n72，q75，n118，d121，n122，q123，n138，q237，q290，n297，n362，n365，d366，n378，和n379.實(shí)施例2工程化的bont/a分子的設(shè)計(jì)制備了根據(jù)本發(fā)明的工程化的bont/a分子的三個(gè)不同實(shí)例。使用實(shí)施例1中描述的方法，將總共55個(gè)殘基鑒定為bont/ahn結(jié)構(gòu)域中用于突變的候選物。通過bont/a晶體結(jié)構(gòu)的目視檢查進(jìn)一步評(píng)估殘基的適用性，列出11個(gè)優(yōu)選的候選物(n476、n763、n687、e599、i831、n761、n578、v675、i685、t755、e757)?；诠δ軘?shù)據(jù)選擇另外6個(gè)殘基，該功能數(shù)據(jù)顯示這些殘基適于突變而不會(huì)不利地影響蛋白質(zhì)功能。這些殘基中的4個(gè)在候選列表中(l647、d650、d651、t847)，2個(gè)不在候選列表中(s564、i849)。候選列表中的11個(gè)殘基加上功能數(shù)據(jù)中的6個(gè)殘基，共選擇17個(gè)殘基用于突變。由所選擇的17個(gè)殘基，制備3個(gè)構(gòu)建體：cathn_v1、cathn_v2和cathn_v3。cathn構(gòu)建體的突變顯示在下表3中：表3：具有所列出的突變的cathn構(gòu)建體和計(jì)算的pi。[δpi＝等電點(diǎn)的改變]cathn_v1、cathn_v2和cathn_v3的純化分別如圖1a、1b和1c所示。實(shí)施例3克隆、表達(dá)和純化合成實(shí)施例2所述的編碼工程化的bont/a分子的dna構(gòu)建體，克隆到pj401表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化到bl21(de3)大腸桿菌中。這允許重組工程化的bont/a分子在大腸桿菌中可溶性的過表達(dá)。使用傳統(tǒng)的色譜技術(shù)從大腸桿菌裂解物中純化重組工程化的bonts。應(yīng)用使用陽(yáng)離子交換樹脂的初始純化步驟，然后是使用疏水相互作用樹脂的中間純化步驟。然后通過蛋白水解切割重組工程化的bont單鏈，得到活化的雙鏈工程化的bont。然后采用最終純化步驟去除剩余的污染物。實(shí)施例4純化的工程化的bonts的表征用試驗(yàn)對(duì)上述實(shí)施例2中描述的工程化的bonts進(jìn)行表征。使用大鼠胚胎脊髓神經(jīng)元(escn)評(píng)估工程化的bonts進(jìn)入神經(jīng)元并切割snap-25(bont/a的靶)的能力。使用小鼠膈神經(jīng)偏側(cè)膈測(cè)定法(mpnhd)進(jìn)一步評(píng)估工程化的bonts的效力。cathn_v1：加入的第一組突變?nèi)〈鸀榫彼幔簊564r、l647r、d650r、d651r、t847r、i849r在大鼠胚胎脊髓神經(jīng)元(escn)的snap-25切割測(cè)定法中測(cè)試cathn_v1分子，并且發(fā)現(xiàn)其與bont/a(bont/a)具有同等效力(圖2)。在小鼠膈神經(jīng)偏側(cè)膈(mpnhd)測(cè)定法中也證實(shí)了陽(yáng)性結(jié)果(圖3)。cathn_v2：第二組突變?nèi)〈鸀橘嚢彼幔簄476k、n763k、n687k、e599k、i831k、n761k在escnsnap-25切割測(cè)定法中測(cè)試了cathn_v2蛋白，并且發(fā)現(xiàn)其保留進(jìn)入細(xì)胞并切割snap-25的能力。在mpnhd測(cè)定法中，cathn_v2與bont/a等效(圖4和5)。cathn_v3：第三組突變?nèi)〈鸀橘嚢彼幔簄578k、v675k、i685k、t755k、e757k在escnsnap-25切割測(cè)定法中測(cè)試cathn_v3分子，并且發(fā)現(xiàn)其保留進(jìn)入細(xì)胞并切割snap-25的能力。類似地，在mpnhd測(cè)定法中也證實(shí)了陽(yáng)性結(jié)果(圖6和7)。等電點(diǎn)聚焦與未修飾的bont/a相比，所有三種cathn構(gòu)建體具有增加的pi(圖8)。實(shí)施例5bont/e輕鏈中的修飾由于肉毒梭菌毒素的模塊化，使用具有n-末端麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)標(biāo)簽和c末端6組氨酸標(biāo)簽(6ht)的bont/e輕鏈構(gòu)建體作為替換物來測(cè)定突變和表征時(shí)的bont/e活性。制備具有下表所示突變的bont/e輕鏈構(gòu)建體(“catlc”)。表4：具有所列突變的構(gòu)建體、計(jì)算的pi和計(jì)算的δpi。該構(gòu)建體在bl21de3細(xì)胞中表達(dá)并且用親和層析純化。純化如圖9所示。對(duì)構(gòu)建體催化活性的評(píng)估表明，修飾的輕鏈保留了未修飾輕鏈的催化活性(圖10)。當(dāng)前第1頁(yè)12