相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
本申請(qǐng)要求2014年10月23提交的歐洲專利申請(qǐng)ep14190111.6的權(quán)益，其通過引用將該申請(qǐng)全文納入本文。
背景技術(shù)：
本發(fā)明一般涉及基于免疫學(xué)的診斷試驗(yàn)領(lǐng)域，所述基于免疫學(xué)的診斷試驗(yàn)包括檢測細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力試驗(yàn)。
基于免疫學(xué)的診斷試驗(yàn)是檢測各種病癥的重要手段。這些試驗(yàn)類型的效果部分在于免疫系統(tǒng)內(nèi)成分的特異性。盡管有這樣的特異性，但對(duì)于在具有活性或潛伏感染疾病狀態(tài)的對(duì)象中檢測低級(jí)感染或持續(xù)低水平感染而言，基于免疫學(xué)的診斷不一定總是足夠靈敏。需要開發(fā)在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力方面靈敏度提高的診斷試驗(yàn)。
基于免疫學(xué)的一種診斷方法形式涉及在分離細(xì)胞培養(yǎng)或全血液培養(yǎng)中用抗原或有絲分裂原激活t細(xì)胞，然后是檢測效應(yīng)分子，例如刺激t細(xì)胞(也稱為效應(yīng)t細(xì)胞)生成的細(xì)胞因子。效應(yīng)分子一般用諸如酶免疫分析、多元珠分析、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(elispot)和流式細(xì)胞儀等技術(shù)檢測。然而，對(duì)于常規(guī)診斷應(yīng)用而言，此類試驗(yàn)的靈敏度和選擇性通常不足。
快速評(píng)估細(xì)胞介導(dǎo)免疫性的能力和具有高度的靈敏度是具有臨床重要性的。尤其是在免疫系統(tǒng)受損的患者中。臨床醫(yī)師需要了解疾病狀態(tài)發(fā)展及其對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響。
wo2013/000021a1公開了靈敏度增加的改善的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)試驗(yàn)。測定對(duì)象中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答活性的方法包括將來自對(duì)象的淋巴細(xì)胞與至少兩組肽接觸，第一組包括約7-14個(gè)氨基酸殘基長度的至少一種肽，第二組包括16個(gè)或更多氨基酸殘基的至少一種肽，所述肽包括全部或部分的蛋白質(zhì)抗原。
誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的各種蛋白質(zhì)抗原已在本領(lǐng)域公開。例如wo95/01441a1公開了從分枝桿菌分離的肽抗原esat-6。wo97/09429a2公開了從分枝桿菌分離的肽抗原cfp-10。
laurens等(clin.anddiagn.lab.imm.,2000年3月，第7期第2版,155-160頁)公開了基于esat-6和cfp-10診斷結(jié)核病的方法。他們發(fā)現(xiàn)，相比使用分開的抗原，兩種抗原的組合增加了體內(nèi)和體外診斷試驗(yàn)的靈敏度和特異度。
wo2008/141226公開了各種抗原(例如esat-6和cfp-10)的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。該文件未涉及抗原的片段。
wo2009/024822公開了用于疫苗的抗原列表，但其未公開或教導(dǎo)特異組合cfp-10和esat-10或其片段。
wo2014/085713a1涉及基于標(biāo)志物蛋白檢測結(jié)核病的方法和組合物。公開了診斷試驗(yàn)，其中通過胰蛋白酶消化在探針中獲得esat-6和cfp-10的大片段。該文未公開肽的限定組或該肽與淋巴細(xì)胞相互作用的方法。
然而，當(dāng)前需要新的靈敏且選擇性的抗原組合物以及相應(yīng)的免疫基診斷試驗(yàn)。
本發(fā)明背后的問題
本發(fā)明背后的問題是提供新的靈敏且選擇性的抗原組合物以及相應(yīng)的免疫基診斷試驗(yàn)。此外，問題是提供改善的組合物和診斷結(jié)核病的試驗(yàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
令人驚奇的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明背后的問題被權(quán)利要求所述的組合物和方法所克服。本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方式如本文所示。
本發(fā)明主題是含esat-6的至少一個(gè)片段和cfp-10的至少一個(gè)片段的組合物。
如上所用，“片段”是具有比全長esat-6或cfp-10更少的氨基酸的肽。
本發(fā)明組合物包含esat-6和cfp-10的片段。然而，并不排除存在的其他片段或抗原。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，不存在其他片段和/或抗原。該實(shí)施方式中，組合物中的免疫原性肽全部是esat-6和cfp-10的片段。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，片段包含至少兩組肽，第一組包含長度為約7至14個(gè)氨基酸殘基的至少一個(gè)肽，第二組包含16個(gè)或更多氨基酸殘基的至少一個(gè)肽。
該實(shí)施方式中，長度為約7至14個(gè)氨基酸殘基的第一組肽可稱為“短肽”，包含16個(gè)氨基酸殘基或更多的至少一個(gè)肽的第二組可稱為“長肽”。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，肽涵蓋蛋白抗原esat-6和cfp-10的部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一和第二組肽各包含esat-6和cfp-10的片段。
根據(jù)本發(fā)明，不排除esat-6和cfp-10的其他片段為組合物的一部分。因此，還可存在長度高至6個(gè)氨基酸或15個(gè)氨基酸的esat-6和cfp-10的片段。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，全長esat-6和/或cfp-10不是組合物的一部分。在其他實(shí)施方式中，不包含長度大于75、50或25個(gè)氨基酸的esat-6和/或cfp-10的片段。
esat-6(uniprot登錄號(hào):p0a564；entrez登錄號(hào):886209)是6kda的結(jié)核分枝桿菌(m.tuberculosis)早期分泌抗原性靶標(biāo)。wo95/01441a1公開了蛋白質(zhì)序列和從分歧桿菌中分離的方法。
cfp10(uniprot登錄號(hào):p0a566；entrez登錄號(hào):886194)也稱作esat-6樣蛋白eesxb和分泌的抗原性蛋白mtsa-10。wo97/09429a2公開了序列和從分歧桿菌中分離cfp-10的方法。
laurens等(clin.anddiagn.lab.imm.,2000年3月，第7期第2版,155-160頁)公開了基于esat-6和cfp-10診斷結(jié)核病的方法。他們發(fā)現(xiàn)，相比使用分開的抗原，兩種抗原的組合增加了體內(nèi)和體外診斷試驗(yàn)的靈敏度和特異度。然而，現(xiàn)有技術(shù)未公開本發(fā)明組合物，其合并了esat-6和cfp-10的片段用于誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。
“約7-14個(gè)氨基酸”表示7、8、9、10、11、12、13或14個(gè)氨基酸。這在本文中考慮第一組肽。
“大于15個(gè)氨基酸”表示16個(gè)至全長蛋白質(zhì)抗原，包括16-50個(gè)氨基酸。本文中其涉及第二組肽。本發(fā)明不限于何組肽被稱為第一或第二。各組包含至少一種肽至一系列重疊的肽。具有16個(gè)或更多氨基酸內(nèi)的“長肽”的長度受esat-6(95個(gè)氨基酸)和cfp-10(100個(gè)氨基酸)的長度所限。在具體實(shí)施方式中，長肽的最大長度小于90、小于75、小于50或小于30個(gè)氨基酸?？赏ㄟ^已知方法獲得肽，例如體外或體內(nèi)的重組肽生產(chǎn)方法，或通過消化esat-6、cfp-10或其衍生物。
衍生自蛋白抗原的7-14個(gè)氨基酸的肽和大于15個(gè)氨基酸的肽與淋巴細(xì)胞的共孵育產(chǎn)生更靈敏的試驗(yàn)，能夠比其它可能的情況更早地檢測淋巴細(xì)胞刺激。增加的靈敏度包括：相較于源自抗原的7-14個(gè)氨基酸范圍或>15個(gè)氨基酸范圍或完整抗原本身的單個(gè)肽的共孵育，對(duì)效應(yīng)器分子的檢測增加至少10％。增加細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答試驗(yàn)靈敏度的能力還允許檢測效應(yīng)分子的靈敏度較低的方法。此外，在本文公開的試驗(yàn)中的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的檢測的量級(jí)可能與疾病階段、發(fā)展和/或嚴(yán)重性相關(guān)。因此，本公開內(nèi)容指導(dǎo)對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力的試驗(yàn)。
不受理論或作用模式的限制，兩組肽(7-14聚體肽和>15聚體的肽)允許通過cd4+和cd8+t細(xì)胞的檢測vcd4+t細(xì)胞識(shí)別>15聚體的肽且cd8+t細(xì)胞識(shí)別7-14聚體的肽。這些肽在本文中稱為“cd4+肽”(>15聚體的肽)或“cd8+肽”(7-14聚體的肽)。
優(yōu)選組合物包含約7-14個(gè)氨基酸殘基的多種肽和16個(gè)或更多氨基酸殘基的多種不同的肽。在這一方面，“多種肽”指可包含例如2-2000、優(yōu)選10-1000或20-500個(gè)不同肽的池。當(dāng)包含多種肽時(shí)，免疫應(yīng)答通常得到改善。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物還包含至少一種糖。優(yōu)選所述糖是非還原糖，最優(yōu)選海藻糖。
本領(lǐng)域已公開(例如wo2004/042396a1)糖可增加該方法和組合物的靈敏度。
在優(yōu)選式實(shí)施方式中，糖是非還原糖?！胺沁€原糖”具體指不與針對(duì)還原糖的檢測試劑(如費(fèi)林溶液(fehling'ssolution)、本尼迪克特試劑(benedict'sreagent)或托倫試劑(tollens'reagent))發(fā)生反應(yīng)的糖。非還原糖不包含游離還原末端且因此不包含游離醛基或游離酮基。該非還原糖可具有任何長度并可以是直鏈或支鏈的。在某些實(shí)施方式中，該非還原糖包含至少兩個(gè)單糖單元。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，在非還原糖的任何和全部單糖單元中，與環(huán)結(jié)構(gòu)中的氧原子相鄰的碳原子不包含羥基且因此不包含異頭羥基。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該非還原寡糖的單糖單元的環(huán)結(jié)構(gòu)不包含半縮醛或半縮酮基團(tuán)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該非還原糖是寡糖，其包含10個(gè)單糖單元或更少、更有選8個(gè)單糖單元或更少、6個(gè)單糖單元或更少、5個(gè)單糖單元或更少、4個(gè)單糖單元或更少、3個(gè)單糖單元或更少或2個(gè)單糖單元。優(yōu)選地，該非還原糖是二糖。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，糖苷鍵形成于單糖單元之間，其連接一個(gè)單糖單元的還原末端與另一個(gè)單糖單元的還原末端。非還原糖的優(yōu)選的示例是蔗糖和海藻糖。海藻糖是特別優(yōu)選的，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)顯示海藻糖提高應(yīng)答的量級(jí)并因此提高試驗(yàn)靈敏度，此外包含海藻糖和抗原的組合物顯示出色的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。然而，該非還原糖還可以是單糖，其中，例如，還原末端與另一化學(xué)實(shí)體偶聯(lián)并從而被其阻礙。因此，該非還原糖可以是衍生化的。糖衍生物的示例是氨基糖，其中一個(gè)或多個(gè)羥基被氨基或乙酰氨基取代。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該非還原糖是未取代的且特別是未衍生化的。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該非還原糖不是多糖。在某些實(shí)施方式中，該非還原糖未結(jié)合至蛋白、肽或脂質(zhì)或其他大分子。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該非還原糖未包含在細(xì)胞培養(yǎng)基或其他培養(yǎng)基中。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該非還原糖未包含在液體中。該非還原糖是可由樣品中包含的免疫細(xì)胞代謝的。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，當(dāng)該非還原糖以適當(dāng)濃度存在于包含樣品和抗原的孵育組合物中時(shí)，其能夠增加再刺激的t細(xì)胞所釋放的干擾素γ。
糖可為組合物一部分?；蛘?，可在組合物接觸淋巴細(xì)胞時(shí)加入糖。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，該非還原糖是非還原二糖，優(yōu)選選自海藻糖和蔗糖。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，孵育組合物中非還原糖的濃度為至少1.5mg/ml，優(yōu)選至少2mg/ml。上文中還描述了孵育組合物中非還原糖的合適濃度范圍且參見上述公開內(nèi)容。
本發(fā)明的組合物可用作診斷或治療組合物。下面進(jìn)一步概述這些用途和應(yīng)用。
本發(fā)明的組合物和方法特別適用于確定細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，優(yōu)選作為診斷組合物或診斷方法。
本發(fā)明的組合物和方法特別適用于診斷結(jié)核病。用esat-6，cfp-10或其組合診斷結(jié)核病的試驗(yàn)已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述。
因此，本文提供用于檢測對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答活性的方法，所述方法包括，使所述對(duì)象的淋巴細(xì)胞接觸權(quán)利要求1所述的組合物，并檢測免疫細(xì)胞的免疫效應(yīng)物分子的存在或升高，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的存在或水平指示所述對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答力水平。
優(yōu)選地，所述對(duì)象是人且所述樣品是未經(jīng)稀釋的全血?；蛘?，所述樣品是占待分析樣品體積約10％-100％、約50％-100％、或約80％-100％的全血。樣品體積可為微升或毫升的量，例如0.5μ1至5ml。方便而言，將所述全血收集在含有肝素的管中，且所述免疫效應(yīng)物分子是ifn-γ。一般而言，所述免疫效應(yīng)子采用其特異性抗體例如使用elisa或elispot檢測。
一種或多種其他添加劑可以被添加并因此包含在組合物中。例如，可以添加一種或多種對(duì)樣品制備和/或樣品保存必需或有利的添加劑，例如合適的抗凝血?jiǎng)?如果樣品是血液樣品)。優(yōu)選地，該抗凝血?jiǎng)┦歉嗡?。添加劑不?yīng)以會(huì)干擾細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的濃度包含在內(nèi)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，除了非還原糖外，未向孵育組合物中添加其他單糖。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，除了所述非還原糖外，不向孵育組合物中添加其他還原糖，特別是還原單糖。
所述對(duì)象可受選自分枝桿菌(mycobacterium)屬例如結(jié)合分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)或結(jié)核(tb)、葡萄球菌(staphylococcus)屬、鏈球菌(streptococcus)屬、包柔氏螺旋體菌(borrelia)屬、大腸桿菌(escherichiacoli)、沙門氏菌(salmonella)屬、梭狀芽孢桿菌(clostridium)屬、志賀菌(shigella)屬、變形桿菌(proteus)屬、芽孢桿菌(bacillus)屬、皰疹病毒、乙型或丙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒(hiv)的病原劑感染或患有其導(dǎo)致的疾病。
還提供一種使用戶能夠測定對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力狀態(tài)的方法，所述方法包括：
(a)通過通訊網(wǎng)絡(luò)接收免疫效應(yīng)物分子的水平或濃度形式的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)相較于對(duì)照提供與所述對(duì)象中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力狀態(tài)的相關(guān)性，其中在淋巴細(xì)胞暴露于本發(fā)明組合物之后檢測所述免疫效應(yīng)物分子；
(b)通過單變量或多變量分析處理數(shù)據(jù)以提供免疫應(yīng)答力值；
(c)根據(jù)免疫應(yīng)答力值結(jié)果，與預(yù)定值相比，確定所述對(duì)象的狀態(tài)；和
(d)通過通信網(wǎng)絡(luò)將對(duì)象狀態(tài)指示轉(zhuǎn)移到用戶。
在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包含至少一種其他抗原或其片段。優(yōu)選地，其他抗原是結(jié)核病抗原，優(yōu)選tb7.7或tb37.6。
在一個(gè)實(shí)施方式中，淋巴細(xì)胞接觸cd4+和cd8+肽的組合。
術(shù)語“t細(xì)胞”和“t淋巴細(xì)胞”在本文中可互換使用。“免疫細(xì)胞”包括淋巴細(xì)胞，例如t-細(xì)胞。
“組合”也包括多個(gè)部分如兩部分組合物，其中所述試劑單獨(dú)提供或單獨(dú)使用或單獨(dú)分散或分散前一起混合。例如，多部分試驗(yàn)包可以具有長度為約7至14個(gè)氨基酸殘基和/或大于15個(gè)氨基酸殘基的一系列重疊肽，其涵蓋全部或部分蛋白質(zhì)抗原，其中待檢測針對(duì)其的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，本公開內(nèi)容的這方面包括試劑，所述試劑經(jīng)干燥且游離或固定到試驗(yàn)包的分隔壁或固體支持物。
本公開涉及肽集合。術(shù)語“組”可以被諸如“池”、“隊(duì)”、“系列”、“集合”等替換而不脫離本公開的方法。各組包含至少一種肽且在一個(gè)實(shí)施方式中包括一系列重疊的肽。因此，第一組可含有一系列長度為7-14個(gè)氨基酸殘基的重疊的肽。這些肽被cd8+t細(xì)胞識(shí)別(cd8+肽)。第二組可含有一系列長度大于15個(gè)氨基酸殘基的重疊的肽。這些肽被cd4+t細(xì)胞識(shí)別(cd4+肽)。兩組肽都涵蓋蛋白抗原的整個(gè)長度或一部分。此外，該肽不必是重疊的或者可通過單個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸來重疊。
提及包括全部或一部分蛋白抗原的長度為約7-14個(gè)氨基酸殘基的一系列重疊的肽時(shí)，指長度為約7個(gè)氨基酸殘基至最多14個(gè)氨基酸殘基的肽或其部分，所述肽從蛋白抗原的n末端至其c末端總共從蛋白抗原的各氨基酸殘基跨越至最多6個(gè)氨基酸殘基。因此，如果給定肽的長度為x個(gè)氨基酸殘基，其中x為約7-14，則兩種連續(xù)肽之間重疊的長度為x-1至x-6。在一個(gè)實(shí)施方式中，各連續(xù)肽的重疊為x-1。長度大于15個(gè)氨基酸殘基的一系列重疊的肽也跨越全部或部分蛋白抗原，其中各肽的長度為至少16個(gè)氨基酸殘基或最多完整蛋白抗原的長度。在一個(gè)實(shí)施方式中，長度大于15個(gè)氨基酸殘基的肽是約16-50個(gè)氨基酸，如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)氨基酸殘基。如上所述，不需要肽重疊，只要存在至少一組一個(gè)或多個(gè)7至14個(gè)氨基酸的肽和另一組至少一種>15聚體的肽。
本發(fā)明包括以下情況，即系列中的各肽是相同長度的(即x)。然而，該肽系列可包含x1、x2、xj…xi肽的混合物，其中xi肽的長度為約7-14個(gè)氨基酸殘基或大于15個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明提供了用于檢測對(duì)象中的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括用本發(fā)明組合物孵育來自對(duì)象的淋巴細(xì)胞，然后篩選由活化的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)器分子的水平。
淋巴細(xì)胞通過與至少兩組肽共孵育來活化，第一組包含至少一種長度為約7-14個(gè)氨基酸殘基的肽且第二組包含至少一種長度為16個(gè)氨基酸殘基或更長的肽，所述肽包括全部或一部分蛋白抗原。
本公開內(nèi)容指導(dǎo)暴露于本發(fā)明組合物的淋巴細(xì)胞的效應(yīng)分子的生成量增高。該淋巴細(xì)胞是“活化的”或“刺激的”淋巴細(xì)胞。通過將細(xì)胞暴露于本發(fā)明的組合物來發(fā)生增大(augmentation)。應(yīng)答的水平大于存在全抗原或衍生自抗原的小于7個(gè)氨基酸或大于14個(gè)氨基酸的肽的情況。這使試驗(yàn)更加靈敏以評(píng)估對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力。因此，本發(fā)明提供檢測、評(píng)價(jià)或另外監(jiān)控對(duì)象中細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的試驗(yàn)，這是通過檢測由本發(fā)明組合物刺激的t細(xì)胞效應(yīng)分子的存在或水平來進(jìn)行。所述試驗(yàn)還允許更早檢測細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答力。在一個(gè)實(shí)施方式中，其所指導(dǎo)的試驗(yàn)增強(qiáng)了細(xì)胞介導(dǎo)試驗(yàn)的靈敏度，該試驗(yàn)可使靈敏度較低的檢測實(shí)驗(yàn)可行。此外，建議所述細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的程度或量反映或提供病癥狀態(tài)、發(fā)展和/或嚴(yán)重性的信息。例如，所述應(yīng)答的大小可確定對(duì)象是否患有潛在或活動(dòng)性或急性的感染或病癥。
方便地，該cd4+和/或cd8+肽可分為單獨(dú)的肽池。
不受理論或作用模式的限制，至少兩組肽使得cd4+和cd8+表位都被刺激。所述肽在本文中稱為“cd4+肽”(>15聚體肽)或“cd8+肽”(7-14聚體肽)。
還可在孵育組合物中添加額外試劑以例如調(diào)控調(diào)節(jié)t細(xì)胞(t-調(diào)節(jié)細(xì)胞)的活性。后者包括抑制調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的抑制功能。本文所涵蓋的調(diào)節(jié)t調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑包括cd25配體；編碼jak1或tyk2遺傳物質(zhì)的正義或反義寡核苷酸；中和抗體；包括寡核苷酸的cpg；用作toll-樣受體(tlr)調(diào)控劑的寡核苷酸；和其他tlr調(diào)控劑。
在特定實(shí)施方式中，t調(diào)節(jié)細(xì)胞是活性被抑制的免疫應(yīng)答抑制細(xì)胞。
“cpg分子”指包括cpg序列或基序的寡核苷酸。
本發(fā)明提供一種測定對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力的方法，并進(jìn)而指導(dǎo)測定病癥或試劑是否誘導(dǎo)免疫抑制或與免疫抑制相關(guān)聯(lián)。方法也能診斷傳染病，病理狀況，測定免疫活性水平和評(píng)價(jià)對(duì)內(nèi)源或異源試劑的免疫細(xì)胞應(yīng)答力，以及評(píng)價(jià)暴露于蛋白質(zhì)毒劑。該試驗(yàn)還能篩選先前暴露于特定抗原(例如與疾病、感染或毒物相關(guān)聯(lián)的抗原)的對(duì)象。
因此，本文指導(dǎo)的一方面考慮用于檢測對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答活性的方法，所述方法包括使所述對(duì)象的淋巴細(xì)胞接觸本發(fā)明組合物，并檢測由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的免疫效應(yīng)物分子的水平，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的水平指示所述對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力的水平。
本文考慮的另一方面是用于檢測對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答活性的方法，所述方法包括使所述對(duì)象的淋巴細(xì)胞接觸本發(fā)明組合物，并檢測免疫細(xì)胞的免疫效應(yīng)物分子的水平的升高，其中所述免疫效應(yīng)物分子的水平指示所述對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答力的水平，其中，所述應(yīng)答力的水平指示了選自病原劑感染、自體免疫疾病、癌癥、炎性病癥和暴露于毒性蛋白質(zhì)劑的疾病或病癥的存在或不存在或水平或階段。
本文提供的另一方面是用于檢測對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答活性的方法，所述方法包括使所述對(duì)象的淋巴細(xì)胞接觸本發(fā)明組合物，并檢測免疫細(xì)胞的免疫效應(yīng)物分子的水平的升高，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的水平指示細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答力的水平，并指示選自病原劑感染、自體免疫疾病、癌癥、炎性病癥和暴露于毒性蛋白質(zhì)劑的疾病或病癥的存在或不存在或水平或階段。
本公開內(nèi)容指導(dǎo)的另一個(gè)方面是檢測對(duì)象內(nèi)疾病或病癥的存在、不存在、水平或階段的試驗(yàn)，所述方法包括使所述對(duì)象的淋巴細(xì)胞接觸本發(fā)明組合物，并檢測免疫細(xì)胞的免疫效應(yīng)物分子的水平的升高，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的水平指示所述疾病或病癥。
本公開內(nèi)容還涵蓋一種用于測定試劑是否誘導(dǎo)對(duì)象內(nèi)免疫抑制的方法，所述方法包括使所述對(duì)象的淋巴細(xì)胞在暴露于所述試劑后接觸本發(fā)明組合物，并檢測所述淋巴細(xì)胞的效應(yīng)分子的存在和水平，其中，所述效應(yīng)分子的水平確定由所述試劑誘導(dǎo)的免疫抑制的水平。
根據(jù)此方面，所述試劑可以是藥物或環(huán)境毒劑。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述淋巴細(xì)胞包含在血樣內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，血樣與本發(fā)明組合物共刺激。
還提供本發(fā)明組合物在制備細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力的診斷試驗(yàn)中的應(yīng)用，該應(yīng)用通過將淋巴細(xì)胞和限制量的激動(dòng)劑孵育并檢測效應(yīng)分子的存在或升高的方法進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本文指導(dǎo)用于檢測病癥是否誘導(dǎo)對(duì)象內(nèi)免疫抑制的方法，所述方法包括使具有病癥的對(duì)象的淋巴細(xì)胞接觸本發(fā)明組合物，檢測所述淋巴細(xì)胞的免疫效應(yīng)物分子的存在或水平，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的水平指示經(jīng)誘導(dǎo)的或與該病癥相關(guān)的免疫抑制的程度。
還提供本發(fā)明組合物在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力的診斷試驗(yàn)制造中的應(yīng)用。通常，該方法包括用本發(fā)明組合物孵育淋巴細(xì)胞。
此應(yīng)用包括檢測或監(jiān)控疾病或病癥的存在、缺失、水平或階段，所述疾病或病癥例如病原體感染、自身免疫疾病、癌癥、炎性病癥和/或暴露于藥劑或毒性蛋白質(zhì)試劑如環(huán)境毒劑。檢測“免疫效應(yīng)物分子”包括檢測一個(gè)或多個(gè)不同類型的分子。
本公開內(nèi)容還提供用于檢測對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答活性的方法，所述方法包括使所述對(duì)象的調(diào)節(jié)t細(xì)胞接觸選自以下的試劑：(1)抑制型調(diào)節(jié)t細(xì)胞的抑制劑；和(ii)免疫增強(qiáng)細(xì)胞或其亞群的活化劑；并進(jìn)一步使t細(xì)胞接觸本發(fā)明組合物，并檢測免疫細(xì)胞的免疫效應(yīng)物分子的水平的升高，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的水平指示所述對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答力的水平。
t調(diào)節(jié)功能的抑制劑或調(diào)節(jié)劑的示例包括cd25配體，例如但不限于cd25的多克隆或單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，cd25的人源化或去免疫多克隆或單克隆抗體或者多克隆或單克隆抗體的重組或合成形式。試劑的其他示例包括正義或反義核酸(nucleic)和分子，其針對(duì)編碼janus酪氨酸激酶1(jak1)或酪氨酸激酶2(tyk2)或者jak1或tyk2蛋白的小分子抑制劑的mrna或dna(即遺傳物質(zhì))。提及“小分子”包括免疫球蛋白新抗原受體(ignar)，如描述于國際專利公開號(hào)wo2005/118629。然而，合適試劑的其他示例包括刺激劑，例如通過toll樣受體(tlr)和/或其他機(jī)理作用的cpg分子。因此，作為tlr調(diào)節(jié)劑的包含一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸的cpg也形成本發(fā)明的一部分。
可使用單一類型試劑或使用兩個(gè)或更多類型試劑來調(diào)控調(diào)節(jié)性t細(xì)胞。例如，該試驗(yàn)可用下述試劑進(jìn)行：cd25配體和jak1/tyk2正義或反義寡核苷酸；cd25配體和tlr調(diào)節(jié)試劑；jak1/tyk2正義或反義寡核苷酸和tlr調(diào)節(jié)試劑；或cd25配體，jak1/ty2正義或反義寡核苷酸和tlr調(diào)節(jié)試劑?；蛘?，只使用一種類型的試劑。或者，可使用包含寡核苷酸和tlr調(diào)節(jié)劑的cpg。
提及“對(duì)象”，包括人類或非人物種，包括靈長類，家畜動(dòng)物(如綿羊，牛，豬，馬，驢，山羊)，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠，大鼠，兔，豚鼠，豬，倉鼠)，伴侶動(dòng)物(如狗，貓)，鳥類物種(如家禽鳥，飛鳥)，爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物。本發(fā)明主題可用于人體醫(yī)學(xué)，以及畜牧和獸醫(yī)和野生應(yīng)用，包括馬、狗和駱駝比賽行業(yè)。例如，本公開內(nèi)容的試驗(yàn)通?？捎糜隈R的強(qiáng)度勞作(如賽跑)之前和/或之后以篩選運(yùn)動(dòng)誘發(fā)肺出血(eiph)的證據(jù)。所有馬在運(yùn)動(dòng)中顯示一定程度的一些eiph形式。然而，eiph的亞臨床形式難以檢測。
提及“人”，包括特定人群，例如兒童、老年和體弱人群以及特定種族的人的特定組和群體。
另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象是人且細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答試驗(yàn)用于篩選對(duì)致病微生物、病毒和寄生蟲的應(yīng)答力，發(fā)展可能，或監(jiān)控免疫情況，乳糜瀉，監(jiān)控對(duì)象應(yīng)答腫瘤攻擊和測定任何免疫缺陷或免疫抑制的存在。后者可由例如包括各種化療劑的某些藥物引起?；蛘撸┞队诃h(huán)境蛋白質(zhì)毒劑或污染物。
免疫效應(yīng)物分子可以是應(yīng)答細(xì)胞活化或抗原刺激所產(chǎn)生的某一范圍分子的任何一種。盡管干擾素(ifn)例如ifn-γ是特別有用的免疫效應(yīng)物分子，其它的免疫效應(yīng)物分子包括一定范圍的細(xì)胞因子，例如，白細(xì)胞介素(il)，如il-2、il-4、il-6、il-6(cxcl8)、il-10、il-12、il-13、il-16(lcf)或il-17、il-1α(il-1f1)、il-1β(il-1f2)、il-1γ(il-1f3)，腫瘤壞死因子α(tnf-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)、集落刺激因子(csf)，如粒細(xì)胞(g)-csf或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞(gm)-csf、補(bǔ)體組分5a(c5a)、groα(cxcl1)、sicam-1(cd54)、ip-10(cxcl10)、i-tac(cxcl11)、mcp-1(ccl2)、mif(gif)、mip-1α(ccl3)、mip-1β(ccl4)、rantes(ccl5)或mig(cxcl9)。
本發(fā)明還提供用于檢測對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答活性的方法，所述方法包括使所述對(duì)象的淋巴細(xì)胞接觸本發(fā)明組合物，并檢測來自免疫細(xì)胞的免疫效應(yīng)物分子的水平，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的水平指示所述對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答力的水平。
本文指導(dǎo)的試驗(yàn)?zāi)軝z測對(duì)象中疾病或病癥的存在或缺失或水平或階段，所述疾病或病癥例如病原體感染、自身免疫疾病、癌癥、暴露于炎性病癥、暴露于藥物、暴露于毒性蛋白質(zhì)試劑以及例如由病癥誘導(dǎo)的免疫缺陷或免疫抑制。
在一個(gè)實(shí)施方式中，從對(duì)象收集的樣品一般存于血液收集管中。血液收集試管包括抽血管或其他類似容器。便利地，當(dāng)樣品是全血時(shí)，肝素化血液收集管?；蛘?，血液收集后向試管加入肝素。
盡管全血特別加以考慮且是最方便的樣品，本發(fā)明也延伸到含有免疫細(xì)胞的其他樣品，例如淋巴液，腦液，組織液和包括鼻腔和肺液在內(nèi)的呼吸液以及經(jīng)歷細(xì)胞清除的樣品。提及“全血”，包括沒有被稀釋(例如用組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基，試劑，賦形劑等)的全血。在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語“全血”包括至少10％全血體積的試驗(yàn)樣品(即反應(yīng)混合物)?？杉尤腩~外試劑，例如培養(yǎng)基，酶，賦形劑、抗原等，而不離開包括“全血”的樣品。
血液體積可為約0.5μ1至200ml。本發(fā)明還提供聲微流在改善試驗(yàn)的組分的混合中的應(yīng)用。聲微流公開于國際專利申請(qǐng)pct/au01/00420中。
因此，本文考慮在容器中混合一種或多種淋巴細(xì)胞與本發(fā)明組合物的方法，所述方法包括提供約0.5μl～150μl的液體，所述液體包含所述容器中的成分以建立聲阻抗中的不連續(xù)并施加聲信號(hào)以引起所述液體內(nèi)的混合。還可以應(yīng)用第二聲信號(hào)，第一和第二信號(hào)具有各自頻率，各以交替方式選自約1hz至約20,000hz的頻率，以在流體內(nèi)產(chǎn)生混沌混合。
血液收集管的應(yīng)用與標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)相容，這些可適合大量和隨機(jī)存取抽樣的分析。血液收集管也使處理成本最小化并減少實(shí)驗(yàn)室暴露于全血和血漿，因而降低實(shí)驗(yàn)室人員接觸病原體的風(fēng)險(xiǎn)，例如hiv，乙型肝炎病毒(hbv)或丙型肝炎病毒(hcv)。
孵育步驟和收集管的組合特別有效并提高試驗(yàn)的靈敏度，還提高了在單糖例如右旋糖或葡萄糖存在下孵育細(xì)胞的可選特性。
在對(duì)象抽血后的延長期后，細(xì)胞介導(dǎo)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞喪失了增加全血中免疫應(yīng)答的能力，并且無干擾的應(yīng)答在抽血后約24小時(shí)常常嚴(yán)重降低或缺失。和對(duì)專門塑料制品的需求允許在護(hù)理地點(diǎn)用所述肽抗原進(jìn)行細(xì)胞介導(dǎo)的刺激，例如醫(yī)師診所、診所、門診設(shè)施和獸醫(yī)檢驗(yàn)或農(nóng)場上。一旦抗原刺激完成，不再需要新鮮和活性細(xì)胞。ifn-γ和其他細(xì)胞因子或免疫效應(yīng)物分子在血漿中穩(wěn)定，因此，樣品能存儲(chǔ)或運(yùn)輸而不需要特殊條件或快速時(shí)間要求。
孵育步驟可為1-50小時(shí)，例如1-40小時(shí)或8-24小時(shí)。24小時(shí)時(shí)間段特別適合。
檢測細(xì)胞介導(dǎo)免疫的能力對(duì)評(píng)價(jià)對(duì)象的下述能力重要：對(duì)病原體例如微生物或病毒或寄生蟲感染的應(yīng)答，增加自體免疫應(yīng)答例如自體免疫糖尿病或保護(hù)抵御癌癥或其他腫瘤病癥或檢測炎性病癥或檢測對(duì)象對(duì)毒性試劑例如鈹?shù)谋┞痘蛎舾行?。本文所述試?yàn)也能檢測導(dǎo)致免疫抑制或藥物誘導(dǎo)免疫抑制的病癥。因此，提及“檢測對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”，包括和涵蓋傳染和自體免疫疾病的免疫診斷，免疫活性標(biāo)記和炎癥、癌癥和毒性試劑的標(biāo)記。重要的是，組合的先天和/或獲得性免疫應(yīng)答力得到測定。另外，使用小體積血液的能力使得試驗(yàn)在例如兒童、老年和體弱人群中簡單易行。本文所述的試驗(yàn)使免疫應(yīng)答力的早期檢測或更敏感的檢測可行。
在一個(gè)實(shí)施方式中，造成免疫抑制的病癥包括慢性感染和癌癥。能導(dǎo)致免疫抑制的藥物包括那些用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，癌癥和炎癥性腸病的藥物。
病原體或感染劑包括細(xì)菌、寄生蟲和病毒。細(xì)菌的示例包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性微生物，例如分枝桿菌屬(mycobacterium)，葡萄球菌屬(staphylococcus)，鏈球菌屬(streptococcus)，大腸桿菌(escherichiacoli)，沙門氏菌(salmonella)，梭狀芽孢桿菌屬(clostridium)，志賀菌屬(shigella)，變形桿菌屬(proteus)，芽孢桿菌屬(bacillus)，嗜血桿菌屬(hemophilus)，伯疏氏螺旋體屬(borrelia)等。結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)以及結(jié)核分枝桿菌感染產(chǎn)生的病癥例如結(jié)核病(tb)是特別有用的靶標(biāo)。病毒示例包括肝炎病毒(乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)，皰疹病毒和人類免疫缺陷病毒(hiv)和其產(chǎn)生的疾病。寄生蟲包括瘧原蟲屬(plasmodium)，環(huán)癬，肝寄生蟲等等。其他病原體包括真核細(xì)胞，例如酵母和真菌。
在一個(gè)實(shí)施方式中，其他結(jié)核病抗原是tb7.7或tb37.6。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述對(duì)象被hiv感染。
本發(fā)明特別用于篩選對(duì)結(jié)核分枝桿菌的暴露。因此，本公開內(nèi)容指導(dǎo)用于檢測對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答活性的方法，所述方法包括使所述對(duì)象的淋巴細(xì)胞接觸本發(fā)明組合物，其中片段任選包含來自其他抗原的肽選自結(jié)核分枝桿菌的tb7.7和tb37.6，并檢測由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的免疫效應(yīng)物分子的水平，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的水平指示所述對(duì)象針對(duì)結(jié)合分歧桿菌的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力的水平。
本文所述用于檢測的自身免疫疾病包括脫發(fā)斑禿，強(qiáng)直性脊柱炎，抗磷脂綜合癥，自身免疫阿狄森氏病，多發(fā)性硬化癥，腎上腺自體免疫疾病，自體免疫溶血性貧血，自體免疫性肝炎，自體免疫卵巢炎和睪丸炎，白塞氏病，大皰性類天皰瘡，心肌病，口炎性腹瀉皮炎(celiacsprue-dermatitis)，慢性疲勞綜合癥(cfids)，慢性炎癥脫髓鞘，慢性炎癥多神經(jīng)病，變應(yīng)性肉芽腫性血管炎，瘢痕性類天皰瘡，crest綜合癥，冷凝集素病，克隆氏病，皰疹樣皮炎，盤狀紅斑狼瘡，基本混合冷球蛋白血癥，纖維組織肌痛，腎小球腎炎，格雷弗氏病，格林-巴利癥，，橋本甲狀腺炎，特發(fā)性肺纖維化，特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)，iga腎病，胰島素依賴型糖尿病(i型)，扁平苔蘚，紅斑狼瘡，梅尼埃病，混合性結(jié)締組織病，多發(fā)性硬化癥，重癥肌無力，心肌炎，尋常性天皰瘡，惡性貧血，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，多軟骨炎，多腺體綜合癥(polyglancularsyndromes)，風(fēng)濕性多肌痛，多發(fā)性肌炎和皮肌炎，原發(fā)性無丙種球蛋白血癥，原發(fā)性膽汁性肝硬化，牛皮癬，雷諾氏現(xiàn)象，賴特爾綜合癥，風(fēng)濕熱，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，結(jié)節(jié)病，硬皮病，舍格倫綜合癥，全身肌強(qiáng)直綜合癥，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，多發(fā)性大動(dòng)脈炎，顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎，潰瘍性結(jié)腸炎，葡萄膜炎，血管炎和白癜風(fēng)。
評(píng)價(jià)暴露于傳染實(shí)體的對(duì)象中潛在或?qū)嶋H的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答力通常是重要的。本發(fā)明方法也能用于檢測這些情況是否出現(xiàn)以及疾病過程的水平和階段。
能導(dǎo)致免疫抑制的其他病癥包括炎癥病癥。
本公開內(nèi)容描述的炎癥病癥示例包括但不限于，導(dǎo)致某些區(qū)域變紅、腫脹、疼痛和發(fā)熱感覺應(yīng)答的疾病和紊亂，其用于保護(hù)受損傷或疾病影響的組織。能使用本發(fā)明方法治療的炎性疾病包括但不限于：痤瘡、心絞痛、關(guān)節(jié)炎、吸入性肺炎、疾病、積膿癥、腸胃炎、炎癥、腸流感、nec、壞死性腸炎、盆腔炎、咽炎、pid、胸膜炎、喉嚨發(fā)炎、紅腫、發(fā)紅、喉嚨痛、腸胃感冒和尿路感染、慢性炎癥脫髓鞘多神經(jīng)病、慢性炎癥脫髓鞘多神經(jīng)根神經(jīng)病、慢性炎癥脫髓鞘多神經(jīng)病、慢性炎癥脫髓鞘多神經(jīng)根神經(jīng)病。關(guān)于非人類應(yīng)用，本發(fā)明也檢測馬的eiph和各種動(dòng)物病癥，例如袋獾面部腫瘤。
癌癥治療部分取決于細(xì)胞介導(dǎo)免疫和腫瘤本身或用于治療腫瘤的藥物可導(dǎo)致免疫抑制。本文所述腫瘤包括一組疾病和紊亂，其特征為細(xì)胞生長失控(例如腫瘤形成)且這些細(xì)胞沒有分化為任何專門且不同的細(xì)胞。這些疾病和紊亂包括：abl1原癌基因、aids相關(guān)癌癥、聽神經(jīng)瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞白血病、腺樣囊腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、特發(fā)性髓樣化生、禿頭癥、泡軟組織肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、基底細(xì)胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦干膠質(zhì)瘤、腦和cns腫瘤、乳腺癌、cns腫瘤、類癌瘤、子宮頸癌、兒童腦腫瘤、兒童癌癥、兒童白血病、兒童軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、結(jié)直腸癌、皮膚t細(xì)胞淋巴瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、促纖維組織增生性小細(xì)胞癌、導(dǎo)管癌、內(nèi)分泌癌、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、肝外膽道癌、眼癌(eyecancer)、眼：黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、輸卵管癌、范科尼貧血、纖維肉瘤、膽膀胱癌、胃癌、胃腸道癌、胃腸道類癌腫瘤、泌尿生殖系統(tǒng)的癌癥、生殖細(xì)胞瘤、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、婦科癌癥、惡性血液腫瘤、毛細(xì)胞白血病、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、遺傳乳腺癌、組織細(xì)胞增生癥、何杰金氏病、人類乳頭狀瘤病毒、水囊狀胎塊、高鈣血癥、下咽癌、眼內(nèi)黑色素瘤、胰島細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、郎格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增多病、喉頭癌、平滑肌肉瘤、白血病、李-佛美尼綜合癥、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴性水腫、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、腎惡性橫紋肌腫瘤、髓母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、默克爾細(xì)胞癌、間皮瘤、轉(zhuǎn)移癌、口腔癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤、蕈樣肉芽腫、骨髓增生異常綜合癥、骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻腔癌、鼻咽癌、腎胚細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤病、奈梅亨破損綜合癥、非黑色素瘤皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌(nsclc)、眼癌(ocularcancers)、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口術(shù)卵巢癌、胰腺癌、鼻竇癌、副甲狀腺癌、腮腺腫瘤、陰莖癌、周邊神經(jīng)外胚層腫瘤、垂體腫瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、前列腺癌、罕見癌癥和相關(guān)疾病、腎細(xì)胞癌、成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、先天性皮膚異色癥、唾液腺腫瘤、肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、塞扎里綜合癥、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌(sclc)、小腸腫瘤、軟組織肉瘤、脊髓腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌(皮膚)、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、移行細(xì)胞癌(膀胱)、移行細(xì)胞癌(腎-腎盂-/-輸尿管)、滋養(yǎng)細(xì)胞癌、尿道癌、泌尿系統(tǒng)的癌癥、膜板塊蛋白、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、外陰癌、沃爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥和腎母細(xì)胞瘤。
在上述方面中，所述抗原可獲自所述病原劑，與所述病癥或癌癥相關(guān)或是所述毒劑。或者，感染、疾病病癥、癌癥或毒劑可抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，此時(shí)可使用對(duì)象先前已接觸的任何抗原。
免疫效應(yīng)物分子的檢測可以在蛋白或核酸水平檢測。因此，免疫效應(yīng)物分子的“出現(xiàn)或水平”包括直接和間接數(shù)據(jù)。例如，細(xì)胞因子mrna的高水平是顯示細(xì)胞因子水平增加的間接數(shù)據(jù)。
免疫效應(yīng)物的配體對(duì)檢測和/或定量這些分子特別有用。免疫效應(yīng)物的抗體特別有用。本文所述試驗(yàn)的技術(shù)為本領(lǐng)域已知，并包括，例如放射性免疫試驗(yàn)、夾心法試驗(yàn)，elisa和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法。提及“抗體”包括抗體的部分，哺乳動(dòng)物化(例如人源化)抗體，去免疫抗體，重組或合成抗體以及雜交和單鏈抗體。對(duì)于人皮膚實(shí)驗(yàn)，本文特定描述人源化或去免疫抗體用于檢測效應(yīng)物分子。
多克隆和單克隆抗體都可用免疫效應(yīng)物分子或其抗原片段免疫得到，且任一類型都可用于免疫試驗(yàn)。獲取兩種血清的方法為本領(lǐng)域熟知。
多克隆血清不太優(yōu)選，但相對(duì)易于制備，通過向合適實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物注射有效劑量的免疫效應(yīng)物或其抗原部分，從動(dòng)物收集血清，并用任何已知免疫吸附劑技術(shù)分離特定血清。盡管此種方法生產(chǎn)的抗體可用于幾乎任何類型的免疫分析，但是它們通常因?yàn)楫a(chǎn)品的潛在異質(zhì)性而不受青睞。
免疫分析中應(yīng)用單克隆抗體特別有用，因?yàn)槠淠艽罅可a(chǎn)且產(chǎn)品具有同質(zhì)性?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)通過融合永生細(xì)胞系和對(duì)免疫原性制品敏感的淋巴細(xì)胞來獲得用于單克隆抗體生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞系制備物。
因此，另一方面本發(fā)明提供檢測對(duì)象含淋巴細(xì)胞的樣品中免疫效應(yīng)物分子的方法，所述方法包括將樣品或等分樣品與對(duì)免疫效應(yīng)物分子或其抗原片段具有特異性的抗體在足以形成抗體-效應(yīng)物復(fù)合體情況下接觸一段時(shí)間，并且然后檢測復(fù)合體，其中在淋巴細(xì)胞與本發(fā)明組合物孵育后產(chǎn)生免疫效應(yīng)物分子。
“樣品”包括全血或其包括淋巴細(xì)胞的部分。方法包括平板或球形固體支持物上的微陣列，宏陣列和納米陣列?？捎梦⒒蚝觋嚵??！皹悠贰边€包括約0.5μl至1000μl，包括5μl、10μl、20μl、50μl和100μl的小體積樣品，以及較大體積例如1ml至約200ml，例如1ml、2ml、5ml、10ml或20ml樣品。
可使用多種免疫試驗(yàn)技術(shù)，參見美國專利號(hào)4,016,043、4,424,279和4,018,653。
下面是一類試驗(yàn)的描述。沒有標(biāo)記的抗體固定于固體底物，待檢測免疫效應(yīng)物分子(如細(xì)胞因子)的樣品與結(jié)合分子接觸。經(jīng)過一段合適時(shí)間的孵育，時(shí)間足以形成抗體-免疫效應(yīng)物分子復(fù)合體，然后加入對(duì)效應(yīng)物分子特異的二抗、標(biāo)記有能產(chǎn)生檢測信號(hào)的報(bào)道分子，孵育且時(shí)間足以形成另一抗體-效應(yīng)物-標(biāo)記抗體復(fù)合物。洗去任何沒有反應(yīng)的物質(zhì)，通過觀察報(bào)道分子產(chǎn)生的信號(hào)來測定效應(yīng)物分子的存在。結(jié)果可以通過簡單觀察可見信號(hào)來定量，或通過對(duì)比含已知抗原量的對(duì)照樣品來定量。此廣義技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，可以是多種變化中的任一種。
在這些試驗(yàn)中，對(duì)即時(shí)免疫效應(yīng)物具有特異性的一抗可共價(jià)或被動(dòng)結(jié)合到固體表面。該固體表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物可以是試管，珠，球，微孔板盤，或其他適合作免疫分析的合適表面。結(jié)合過程為本領(lǐng)域熟知，并通常由共價(jià)交聯(lián)結(jié)合或物理吸附組成，洗滌聚合體-抗體復(fù)合物以制備檢測樣品。檢測的等份樣品隨后加入固相復(fù)合物并在合適情況下(例如約20℃-約40℃)孵育足夠時(shí)間(例如2-120分鐘或更合適的時(shí)間，過夜)以使抗體中存在的任何亞基結(jié)合。孵育期后，洗滌抗體亞基固相并干燥，用對(duì)部分效應(yīng)分子具有特異性的二抗孵育。二抗連接報(bào)道分子，用于指示二抗與效應(yīng)分子的結(jié)合。
此試驗(yàn)存在很多變化。一個(gè)特別有用的變化是所有或很多成分基本同時(shí)混合時(shí)同時(shí)分析。另外，抗體與細(xì)胞因子的結(jié)合可以通過與針對(duì)首先提及抗體的經(jīng)標(biāo)記抗體的結(jié)合來測定。
本說明書所用的“報(bào)道分子”，指通過分子其化學(xué)性質(zhì)提供可分析鑒定的信號(hào)，從而檢測結(jié)合抗原的抗體。檢測可以是定性或定量的。該類型的試驗(yàn)中最常用的報(bào)告分子是酶、熒光團(tuán)或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化學(xué)發(fā)光分子。合適熒光團(tuán)的示例在表1中提供。在酶免疫試驗(yàn)的情況下，酶偶聯(lián)至二抗，通常通過還原戊二醛或高碘酸鹽的方式。然而，應(yīng)理解存在多種不同偶聯(lián)技術(shù)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。常用的酶包括辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。通常選擇與特異性酶一起使用的底物以用于在使用相應(yīng)酶進(jìn)行水解后生成可檢測的顏色變化。合適的酶的示例包括堿性磷酸酶和過氧化物酶。也可以使用熒光底物，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物而不是上面提及的發(fā)色底物。所有情況中，將酶標(biāo)記的抗體加入第一抗體-抗原復(fù)合物中，使之結(jié)合，然后洗去多余試劑。然后將含合適底物的溶液加入抗體-抗原-抗體復(fù)合物中。底物與連接二抗的酶反應(yīng)，產(chǎn)生定性可見信號(hào)，通常可用分光光度分析進(jìn)一步定量，指示樣品中存在的抗原量。再者，本方面延伸至基本同時(shí)的分析。
或者，熒光化合物例如熒光素和若丹明，可以化學(xué)偶聯(lián)于抗體上而不改變其結(jié)合能力。當(dāng)用特定波長光照射激活時(shí)，熒色物標(biāo)記抗體吸收光能，誘導(dǎo)分子激發(fā)性狀態(tài)，然后發(fā)射用光學(xué)顯微鏡視覺可檢測的特征性顏色的光。熒光標(biāo)記抗體可結(jié)合第一抗體-抗原復(fù)合物。洗去未結(jié)合試劑后，剩余三元復(fù)合物隨后暴露在合適波長光下，觀察到的熒光指示感興趣抗原的存在。免疫熒光和酶學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)都是本領(lǐng)域中非常成熟的且對(duì)本方法特別優(yōu)選。然而，也可使用其他報(bào)道分子，例如放射性同位素，化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子。
可以使用一系列其它檢測系統(tǒng)，包括膠體金和本公開內(nèi)容涵蓋的所有這種檢測系統(tǒng)。
本公開內(nèi)容也包括遺傳分析，例如涉及pcr分析以檢測編碼免疫效應(yīng)物的遺傳序列的rna表達(dá)產(chǎn)物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，使用引物對(duì)完成pcr，引物之一或兩者一般用相同報(bào)道分子或能給出可區(qū)分信號(hào)的不同報(bào)道分子標(biāo)記。使用熒光團(tuán)在本發(fā)明實(shí)踐中特別有用。合適熒光團(tuán)的示例可選自表1中給出的列表。其他標(biāo)記包括發(fā)光和磷光以及紅外染料。這些染料或熒光團(tuán)也可用作抗體的報(bào)道分子。
表1
合適熒光團(tuán)的列表
ex：激發(fā)峰波長(nm)em：發(fā)射峰波長(nm)
本文包括分析熒光發(fā)射的任何合適方法。就此而言，本文指導(dǎo)的技術(shù)包括但不限于：2光子和3光子時(shí)間分辨熒光光譜，如lakowicz等，biophys.j.72:567，1997所公開，熒光壽命成像，如eriksson等，biophys.j.2:64，1993所公開，和熒光共振能量轉(zhuǎn)移，如youvan，biotechnologyetelia3:1-18，1997所公開。
發(fā)光和磷光可分別由本領(lǐng)域已知的合適的發(fā)光或磷光標(biāo)記物產(chǎn)生。任何可以鑒定這種標(biāo)記物的光學(xué)方法能用于此方面。
紅外輻射可由合適的紅外線染料產(chǎn)生?？捎糜诒景l(fā)明的紅外染料示例包括但不限于，lewis等，dyespigm.42(2):197，1999，tawa等，mater.res.soc.symp.proc.488[electrical,opticalandmagneticpropertiesoforganicsolid-statematerialsiv(有機(jī)固態(tài)材料的電學(xué)，光學(xué)和磁學(xué)屬性iv)]，885-890，daneshvar等，j.immunol.methods226(1-2):1-128，1999，rapaport等，appl.phys.lett.74(3):329-33，1999和durig等，j.ramanspectrosc.24(5):2-285，1993所公開染料。任何合適紅外光譜法可以用于檢測紅外染料。例如，為此可使用傅里葉變換紅外光譜，如rahman等，j.org.chem.63:6196，1998所述。
合適地，電磁散射可由包括光和x射線在內(nèi)的入射電磁輻射的衍射，反射，偏振或折射產(chǎn)生。這種散射可用于定量mrna水平或蛋白質(zhì)水平。
流式細(xì)胞術(shù)在分析熒光團(tuán)發(fā)射中特別有用。
如本領(lǐng)域已知，流式細(xì)胞儀是高通量技術(shù)，涉及到快速分析粒子的物理和化學(xué)特性(例如，標(biāo)記的mrna，dna或蛋白)，因?yàn)槠鋺腋∮谝后w流時(shí)通過一個(gè)或多個(gè)激光束路徑。因?yàn)槊總€(gè)粒子截?cái)嗉す馐?，可檢測每個(gè)細(xì)胞或粒子發(fā)射的散射光和熒光并通過任何合適追蹤算法例如下述算法來記錄。
現(xiàn)代流式細(xì)胞儀能完成這些任務(wù)達(dá)到每秒每個(gè)粒子100,000個(gè)細(xì)胞。通過使用濾鏡和二向色鏡的光學(xué)陣列，能分開不同波長熒光并同時(shí)檢測。另外，可使用有許多不同激發(fā)波長的激光。因此，可采用各種熒光定位和檢測例如，一個(gè)樣品內(nèi)的不同免疫效應(yīng)物或多個(gè)對(duì)象的免疫效應(yīng)物。
可用于本公開內(nèi)容的方法的合適流式細(xì)胞儀包括使用單個(gè)激發(fā)激光測量5-9個(gè)光學(xué)參數(shù)(見表2)，通常在15mw以其488nm光譜線操作氬離子冷卻式激光器。更先進(jìn)的流式細(xì)胞儀能使用多個(gè)激發(fā)激光，例如氬離子激光(488或514nm)以外的hene激光(633nm)或hecd激光(325nm)。
表2
可通過流式細(xì)胞儀測量的示例性光學(xué)參數(shù)
使用488nm激發(fā)激光
"長通濾波器
例如，biggs等(1999)，cytometry36:36-45使用三個(gè)激發(fā)激光已經(jīng)構(gòu)建了11參數(shù)的流式細(xì)胞儀，并顯示使用正向和側(cè)向散射檢測以外的九個(gè)可區(qū)分熒光團(tuán)，以免疫分型(即分類)粒子。參數(shù)的選擇能充分使用，主要根據(jù)所有熒光團(tuán)之間的消光系數(shù)，量子產(chǎn)率和光譜重疊數(shù)量(malemed等(1990)，“flowcytometryandsorting(《流式細(xì)胞術(shù)和分選》)”，第二版，紐約的約翰威立(wiley-liss))。應(yīng)理解本發(fā)明不限于任何特定流式細(xì)胞儀或任何特定參數(shù)組。就此而言，本公開內(nèi)容還包括使用微型流式細(xì)胞儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)流式細(xì)胞儀，例如fu等(1999)，naturebiotechnology17:1109-1111所公開。
本文提供的試驗(yàn)可以自動(dòng)或半自動(dòng)，用于從一個(gè)對(duì)象中高通量篩選或用于篩選許多免疫效應(yīng)物。通過計(jì)算機(jī)軟件可方便控制自動(dòng)操作。
因此本公開內(nèi)容還包括基于網(wǎng)絡(luò)和非基于網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)，其中對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答力數(shù)據(jù)通過客戶服務(wù)器或其他結(jié)構(gòu)平臺(tái)提供到中央處理器，其分析和對(duì)比對(duì)照且任選考慮其他信息例如患者年齡，性別，體重，和其他醫(yī)學(xué)條件，然后提供報(bào)告，例如，疾病嚴(yán)重性或進(jìn)展或狀態(tài)或疾病發(fā)展可能性指數(shù)的風(fēng)險(xiǎn)因子。因此也提供商業(yè)方法，其中在運(yùn)輸管中收集血液，然后在定義位點(diǎn)分析細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力，然后所述結(jié)果通過客戶服務(wù)器或其他結(jié)構(gòu)平臺(tái)以電子報(bào)告形式送達(dá)臨床護(hù)理提供者。
因此，基于知識(shí)的計(jì)算機(jī)軟件和硬件也形成本公開內(nèi)容的部分。這有助于臨床護(hù)理確定包括感染、炎癥癌癥或藥物或毒劑的病癥是否誘導(dǎo)或與免疫抑制相關(guān)。
本公開內(nèi)容提供的試驗(yàn)可用于現(xiàn)有或新開發(fā)的與病理學(xué)行業(yè)相關(guān)的基于知識(shí)的結(jié)構(gòu)或平臺(tái)。例如，試驗(yàn)結(jié)果通過通訊網(wǎng)絡(luò)(例如因特網(wǎng))或電話聯(lián)系傳到處理系統(tǒng)，其中算法被存儲(chǔ)并用于產(chǎn)生預(yù)測后驗(yàn)概率值，其轉(zhuǎn)換成細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答力或免疫抑制指數(shù)，再以診斷或預(yù)測報(bào)告形式轉(zhuǎn)入終端使用。本報(bào)告也形成臨床護(hù)理管理和個(gè)性化醫(yī)療的基礎(chǔ)。
因此，所述試驗(yàn)可采用試劑盒或基于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的形式，包括在淋巴細(xì)胞暴露于本發(fā)明組合物之后檢測所述免疫效應(yīng)物分子的濃度的所需試劑，和用以協(xié)助確定并傳送報(bào)告至臨床醫(yī)師的計(jì)算機(jī)硬件和/或軟件。
例如，本發(fā)明包括允許用戶測定對(duì)象細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力狀態(tài)的方法，所述方法包括：
(a)通過通訊網(wǎng)絡(luò)接收免疫效應(yīng)物分子的水平或濃度形式的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)相校對(duì)照提供與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力狀態(tài)的相關(guān)性，其中在淋巴細(xì)胞暴露于本發(fā)明組合物之后檢測所述免疫效應(yīng)物分子；
(b)通過單變量或多變量分析處理對(duì)象數(shù)據(jù)以提供免疫應(yīng)答力值；
(c)根據(jù)免疫應(yīng)答力值結(jié)果，與預(yù)定值相比，測定對(duì)象狀態(tài)；和
(d)通過通信網(wǎng)絡(luò)將對(duì)象狀態(tài)指示轉(zhuǎn)移到用戶。
提及“單變量”或“多變量”分析，包括執(zhí)行單變量或多變量解析函數(shù)的算法。
便利地，所述方法一般還包括：
(a)使用戶使用遠(yuǎn)程終端站測定數(shù)據(jù)；和
(b)通過通訊網(wǎng)絡(luò)從終端站向基站轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)。
所述基站能包括第一和第二處理系統(tǒng)，其中所述方法包括：
(a)轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)到第一處理系統(tǒng)；
(b)轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)到第二處理系統(tǒng)；和
(c)使第一處理系統(tǒng)執(zhí)行單變量或多變量解析函數(shù)以產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答力值。
所述方法還可包括：
(a)轉(zhuǎn)移單變量或多變量解析函數(shù)的結(jié)果到第一處理系統(tǒng)；和
(b)使第一處理系統(tǒng)測定對(duì)象狀態(tài)。
本情況中，所述方法也包括一下的至少一個(gè)：
(a)通訊網(wǎng)絡(luò)和第一處理系統(tǒng)之間通過第一防火墻轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)；和
(b)在第一和第二處理系統(tǒng)之間通過第二防火墻轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)。
所述第二處理系統(tǒng)可以連接到適應(yīng)存儲(chǔ)預(yù)定數(shù)據(jù)和/或單變量或多變量解析函數(shù)的數(shù)據(jù)庫，所述方法包括：
(a)查詢數(shù)據(jù)庫以得到至少所選預(yù)定數(shù)據(jù)或訪問數(shù)據(jù)庫中單變量或多變量解析函數(shù)；和
(b)對(duì)比所選預(yù)定數(shù)據(jù)和對(duì)象數(shù)據(jù)或產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答力或免疫抑制的水平的預(yù)測的可能性指數(shù)。
所述第二處理系統(tǒng)能連接到數(shù)據(jù)庫，所述方法包括在數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。
所述方法還包括使基站：
(a)測定支付信息，支付信息代表用戶支付條款；和
(b)響應(yīng)測定支付信息進(jìn)行對(duì)比。
本公開內(nèi)容還提供相對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力或免疫抑制測定對(duì)象狀態(tài)的基站，所述基站包括：
(a)存儲(chǔ)方法；
(b)處理系統(tǒng)，處理系統(tǒng)適合于：
通過通訊網(wǎng)絡(luò)從所述用戶接收對(duì)象數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)包括免疫效應(yīng)物分子的水平，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的水平相較對(duì)照與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，其中，在淋巴細(xì)胞暴露于本發(fā)明組合物之后測定所述免疫效應(yīng)物分子；
(d)完成算法函數(shù)，包括對(duì)比數(shù)據(jù)與預(yù)定數(shù)據(jù)；
(e)根據(jù)包括對(duì)比的算法函數(shù)結(jié)果測定對(duì)象狀態(tài)；和
(c)通過通訊網(wǎng)絡(luò)輸出對(duì)象狀態(tài)指示到用戶。
所述處理系統(tǒng)能適應(yīng)從適于測定數(shù)據(jù)的遠(yuǎn)程終端站接受數(shù)據(jù)。
所述處理系統(tǒng)可以包括：
(a)第一處理系統(tǒng)，適用于：
(i)接受數(shù)據(jù)；和
(ii)根據(jù)包括對(duì)比數(shù)據(jù)的單變量或多變量解析函數(shù)測定對(duì)象狀態(tài)；和
(b)第二處理系統(tǒng)，適用于：
(i)從處理系統(tǒng)接受數(shù)據(jù)；
(ii)完成包括對(duì)比的單變量或多變量解析函數(shù)；和
(iii)轉(zhuǎn)移結(jié)果到第一處理系統(tǒng)；
所述處理系統(tǒng)能連接到數(shù)據(jù)庫，所述處理系統(tǒng)適合在數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。
根據(jù)此實(shí)施方式，免疫效應(yīng)物分子水平可以單獨(dú)篩選或聯(lián)合其他生物標(biāo)記或疾病指示物?！案淖儭钡乃街该庖咝?yīng)物分子濃度的增加或提高或下降或降低。
免疫效應(yīng)物分子濃度或水平的測定能基于相對(duì)對(duì)照的濃度建立診斷方法?；蛘撸\斷規(guī)則是基于統(tǒng)計(jì)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法的應(yīng)用。這種算法使用訓(xùn)練數(shù)據(jù)(有已知疾病或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力狀態(tài))中觀察到的效應(yīng)分子和疾病狀態(tài)之間的關(guān)系來推斷關(guān)系，然后用于預(yù)測未知狀態(tài)對(duì)象的狀態(tài)。能用算法來提供對(duì)象有某一水平細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力和/或病癥的可能性指數(shù)。算法執(zhí)行單變量或多變量解析函數(shù)。
因此，本公開內(nèi)容提供基于統(tǒng)計(jì)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法的應(yīng)用的診斷規(guī)則。這種算法使用訓(xùn)練數(shù)據(jù)(有已知免疫狀態(tài))中觀察到的效應(yīng)分子和細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答力或免疫抑制之間的關(guān)系來推斷關(guān)系，然后用于預(yù)測未知免疫狀態(tài)患者的狀態(tài)。本數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域從業(yè)者認(rèn)識(shí)到，訓(xùn)練數(shù)據(jù)中推斷關(guān)系的很多不同形式能在沒有實(shí)質(zhì)性改變本發(fā)明情況下使用。
本公開內(nèi)容還包括使用訓(xùn)練數(shù)據(jù)的知識(shí)庫，對(duì)比對(duì)象免疫效應(yīng)物分子水平和已知細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力水平以產(chǎn)生算法，在輸入未知免疫應(yīng)答力水平對(duì)象中包括相同免疫效應(yīng)物分子水平的第二數(shù)據(jù)知識(shí)庫后，提供可能性參數(shù)，預(yù)測細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力的性質(zhì)。
術(shù)語“訓(xùn)練數(shù)據(jù)”包括相對(duì)于對(duì)照的免疫效應(yīng)物分子水平的知識(shí)，其中在淋巴細(xì)胞暴露于本發(fā)明組合物后測定免疫效應(yīng)物分子。“對(duì)照”包括對(duì)象免疫效應(yīng)物分子水平與“正?！泵庖邞?yīng)答力的對(duì)比，或可根據(jù)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)上測定水平。
因此，術(shù)語“訓(xùn)練數(shù)據(jù)”包括免疫效應(yīng)物分子水平。
免疫效應(yīng)物分子的水平或濃度提供輸入測試數(shù)據(jù)，本文稱為“第二數(shù)據(jù)知識(shí)庫”。第二數(shù)據(jù)知識(shí)庫視作相對(duì)于對(duì)照或輸入包括已知免疫狀態(tài)的對(duì)象免疫效應(yīng)物水平信息的“第一數(shù)據(jù)知識(shí)庫”產(chǎn)生的算法。第二數(shù)據(jù)知識(shí)庫來自未知狀態(tài)對(duì)象，涉及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力。算法輸出或與對(duì)照對(duì)比是對(duì)象有某一水平的免疫應(yīng)答力或免疫抑制的可能性或風(fēng)險(xiǎn)因子，本文稱為“可能性指數(shù)”。
從免疫效應(yīng)物分子水平得到的數(shù)據(jù)是輸入數(shù)據(jù)。包括免疫效應(yīng)水平的輸入數(shù)據(jù)與對(duì)照作比較，或輸入到算法中，所述算法提供對(duì)象有例如免疫抑制病癥的可能性風(fēng)險(xiǎn)值。也可監(jiān)控治療方案以確定任何免疫抑制的出現(xiàn)。免疫抑制水平可以增加對(duì)象繼發(fā)感染或復(fù)發(fā)(例如腫瘤治療或病原性感染治療期間)的風(fēng)險(xiǎn)。
如上所述，診斷免疫應(yīng)答力或免疫抑制病癥的方法，通過免疫效應(yīng)物分子水平測定對(duì)象加強(qiáng)先天和/或獲得性免疫應(yīng)答程度，由已知免疫狀態(tài)對(duì)象的第一數(shù)據(jù)知識(shí)庫或相同效應(yīng)分子水平產(chǎn)生的算法中，提供第二數(shù)據(jù)知識(shí)庫。同時(shí)提供檢測免疫應(yīng)答力方法，包括測定對(duì)象樣品先天和/或獲得性免疫系統(tǒng)刺激后免疫效應(yīng)物分子出現(xiàn)和/或速度?！八俣取敝笇?duì)象樣品中效應(yīng)分子濃度隨著時(shí)間而改變。
如上所述，本文所用的術(shù)語“樣品”指包含一種或多種淋巴細(xì)胞的任何樣品，包括但不限于：全血、全血部分、組織提取物和新鮮收獲的細(xì)胞。
本公開內(nèi)容的方法可用于診斷和疾病分級(jí)。本發(fā)明也可用于監(jiān)控病癥進(jìn)展和監(jiān)控特定治療是否有效。特別地，所述方法能用于監(jiān)控手術(shù)，腫瘤治療或其他或藥物或暴露于毒劑后的免疫抑制。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本公開考慮監(jiān)控對(duì)象免疫抑制的方法，包括：
(a)提供來自對(duì)象的樣品；
(b)測定通過本發(fā)明組合物刺激后的免疫效應(yīng)物分子的水平；
其中，免疫效應(yīng)物的水平相較對(duì)照提供與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性，并使所述水平用于算法以提供對(duì)象具有某一免疫應(yīng)答力水平的可能性指數(shù)。
(c)重復(fù)步驟(a)和(b)，在稍晚的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)比步驟(b)結(jié)果與步驟(c)結(jié)果，其中可能性指數(shù)的差異指示對(duì)象病癥的進(jìn)展。
上述“算法”或“算法函數(shù)”包括執(zhí)行單變量或多變量解析函數(shù)。不同結(jié)構(gòu)和平臺(tái)可以用作上面描述的補(bǔ)充。應(yīng)理解可以使用適于完成本發(fā)明的任何結(jié)構(gòu)形式。然而，一個(gè)有利技術(shù)是使用分布式結(jié)構(gòu)。特別地，許多終端站可以在不同地理位置提供。這能通過降低數(shù)據(jù)帶寬成本和需求來增加系統(tǒng)效率，和保證如果一個(gè)基站堵塞或發(fā)生錯(cuò)誤，其他站點(diǎn)可以接管。這也允許負(fù)載共享或其他以確?？呻S時(shí)訪問系統(tǒng)。
此情況中，需要確?；景ㄏ嗤畔⒑秃灻?，從而能使用不同終端站。
還應(yīng)理解在一個(gè)實(shí)施例中，終端站可以是便攜式設(shè)備，例如pda，移動(dòng)手機(jī)等，能通過通訊網(wǎng)絡(luò)例如因特網(wǎng)轉(zhuǎn)移對(duì)象數(shù)據(jù)到基站，和接受報(bào)告。
在上述方面，術(shù)語“數(shù)據(jù)”是指在涵蓋蛋白質(zhì)抗原的整個(gè)長度的長度為約7至14個(gè)氨基酸殘基的一系列重疊肽刺激后免疫效應(yīng)物的水平或濃度。所述“通訊網(wǎng)絡(luò)”包括因特網(wǎng)和移動(dòng)電話網(wǎng)絡(luò)和電話線。當(dāng)使用服務(wù)器時(shí)，一般是客戶服務(wù)器或更特定是簡單對(duì)象應(yīng)用協(xié)議(soap)。
本公開內(nèi)容的一方面包括通過檢測對(duì)本發(fā)明組合物的應(yīng)答力確定對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力的試驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)樣品，例如外周血液樣品，血液組分或支氣管肺泡灌洗液的白細(xì)胞富集樣品，可從有或懷疑發(fā)生特定疾病(例如自體免疫疾病，病原體感染或暴露于蛋白質(zhì)毒劑)的對(duì)象獲得，通過測定來自效應(yīng)t細(xì)胞(如cd4+t細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞)的效應(yīng)分子檢測免疫應(yīng)答力。
所述免疫結(jié)合方法包括檢測或定量樣品中反應(yīng)成分含量的方法，所述方法需要檢測或定量在結(jié)合過程中形成的任何免疫復(fù)合物。此處，在用本發(fā)明組合物刺激淋巴細(xì)胞之后，可以得到懷疑包括細(xì)胞因子的樣品，將樣品和抗體接觸，然后檢測或定量特定情況下形成免疫復(fù)合物的量。
所選的生物樣品和抗體在有效情況下接觸充分的時(shí)間段以形成免疫復(fù)合物(初級(jí)免疫復(fù)合物)一般是向樣品中加入組合物和孵育混合物一段足夠長的時(shí)間以使抗體與任何存在的效應(yīng)分子形成(即與之結(jié)合)免疫復(fù)合物。之后，樣品-抗體組合物例如組織切片，elisa平板，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)，斑點(diǎn)印跡或western印跡，一般會(huì)經(jīng)清洗以去除任何非特異性結(jié)合抗體物質(zhì)，使僅特異性結(jié)合在所述初級(jí)免疫復(fù)合物中的抗體被檢測。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容指導(dǎo)用于檢測人對(duì)象內(nèi)疾病或病癥的存在、不存在、水平或階段的方法，所述方法包括使含有至少10％反應(yīng)混合物總體積的全血接觸本發(fā)明組合物，并檢測t細(xì)胞的免疫效應(yīng)物分子水平的存在或升高，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的存在或水平指示所述疾病或病癥。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供伴隨上述方法使用的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，考慮免疫檢測試劑盒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，考慮用于分析來自有或懷疑發(fā)生金屬或化學(xué)誘導(dǎo)疾病的對(duì)象的樣品的試劑盒。在一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，考慮用于分析來自有或懷疑發(fā)生疾病的對(duì)象的樣品的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒用于在疾病狀態(tài)已經(jīng)發(fā)展之前或之后或在對(duì)象接受藥物或暴露于毒劑或污染物之前或之后評(píng)估對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答力。如果還使用抗原，試劑盒還可包括特定抗原。
試劑盒的免疫檢測試劑可以用各種形式中的任何一種，包括與給定抗體或抗原相關(guān)或連接的檢測標(biāo)記，與第二結(jié)合配體相關(guān)或連接的檢測標(biāo)記。示例性第二配體是有第一抗體或抗原結(jié)合親和性的第二抗體，和有人體抗體結(jié)合親和性的第二抗體。
適用于本發(fā)明試劑盒的其它合適免疫檢測試劑包括含二抗與三抗的雙組分試劑，所述二抗對(duì)一抗或抗原有結(jié)合親和性，所述三抗對(duì)二抗有結(jié)合親和性，所述三抗連接有可檢測標(biāo)記。
所述試劑盒還可包括適當(dāng)?shù)确值臉?biāo)記或未標(biāo)記抗原或效應(yīng)分子組合物，可用作制備檢測試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
所述試劑盒可包含抗體-標(biāo)記偶聯(lián)物，其可為全偶聯(lián)形式、中間體形式或待試劑盒用戶偶聯(lián)的單獨(dú)部分。所述試劑盒的組分可在水性介質(zhì)中或以凍干形式包裝。
任何試劑盒的容器用具通常包括至少一種小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器用具，其中可放置測試試劑，抗體或抗原，且通常適當(dāng)?shù)确盅b。當(dāng)提供第二或第三結(jié)合配體或額外組分時(shí)，試劑盒通常也包括第二，第三或其他額外容器，其中可放置此配體或組分。本發(fā)明教導(dǎo)的試劑盒通常還包含用于市售的封閉約束形式的含有抗體、衍生自抗原的肽的器具，以及任何其他試劑容器。此類容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其中保留所需小管。
本文還考慮的是一種檢測對(duì)象內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或其水平的改進(jìn)試驗(yàn)，所述試驗(yàn)包括將所述對(duì)象的淋巴細(xì)胞和抗原孵育，并檢測效應(yīng)分子的存在或升高，所述改進(jìn)包括使所述淋巴細(xì)胞與本發(fā)明組合物孵育。
本公開內(nèi)容還提供治療患有病原感染、自體免疫疾病或癌癥或具有發(fā)展所述病癥或疾病的傾向的對(duì)象的方法，所述方法包括使該對(duì)象的淋巴細(xì)胞來源接觸本發(fā)明組合物，并檢測t細(xì)胞的免疫效應(yīng)物分子水平的存在或升高，其中，所述免疫效應(yīng)物分子的存在或升高指示該對(duì)象的細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答力的水平，其指示所述病癥或疾病的存在、不存在、水平或階段，然后治療所述病癥或疾病。
文獻(xiàn)目錄
biggs等(1999)cytometry36:36-45
daneshvar等(1999)j.immunol.methods226(1-2).119-128
durig等(1993)j.ramanspectrosc.24(5):2％\-2％5
eriksson等(1993)biophys.j.2:64
fu等(1999)naturebiotechnology17:1109-1111
lakowicz等(1997)biophys.j.72:567
lewis等(1999)dyespigm.42(2):197
malemed等(1990)"《流式細(xì)胞術(shù)和分選》(flowcytometryandsorting)",第二版,紐約,wiley-liss出版社
petkovic-duran等(2009)biotechniques47:827-834
rapaport等(1999)appl.phys:lett.7(3):329-33\
rahman等(1998)j.org.chem.63:196
tawa等mater.res.soc.symp.proc.488[有機(jī)固態(tài)材料的電學(xué)，光學(xué)和磁學(xué)屬性iv(electrical,opticalandmagneticpropertiesoforganicsolid-statematerialsiv)],885-890
youvan等(1997)biotechnologyetelia3:1-18