本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中大豆花粉育性的分子標記檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雄性和雌性生殖器官在植物種子發(fā)育中起著非常重要的作用。雄蕊或雌蕊發(fā)育過程中相關(guān)基因的任何突變均可引起植物育性的改變。根據(jù)雌性與雄性配子育性的不同，將相關(guān)突變體劃分為雌性-雄性不育、雄性不育-雌性可育、雄性可育-雌性不育。目前，大豆中已經(jīng)鑒定出了多個雄性不育-雌性可育突變體(簡稱為雄性不育突變體)。

雜種優(yōu)勢利用在玉米、水稻、高粱、油菜、花生、部分蔬菜等育種與生產(chǎn)中已獲得巨大的生產(chǎn)效益，而大豆等部分作物仍以常規(guī)種生產(chǎn)為主。在最近的作物雜種優(yōu)勢利用國際會議上部分學者就利用雄性不育體系對大豆生產(chǎn)有著積極的雜種優(yōu)勢效應(yīng)做了相關(guān)報告(lietal.2012；sun.2012,yangetal.2012；zongetal.2012)。大豆雜交品種培育在我國已有多年的育種實踐，并取得了一定成績。大豆是一個嚴格的自花授粉作物，需要在開花之前去除花藥，依靠人工雜交手段獲得大量大豆雜交種非常困難而且耗費時費力。如果獲得一個不依賴于種植環(huán)境的雄性不育體系，將會極大地促進大豆雜交品種培育及大豆雜種優(yōu)勢利用。目前急需一種可以快速鑒定大豆花粉粒育性的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何鑒定大豆花粉粒育性。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了利用大豆花粉育性連鎖分子標記10-0871及其對應(yīng)的引物對x1(將用來得到分子標記10-0871的引物對命名為x1)鑒定或輔助鑒定大豆花粉粒育性的方法。

本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定大豆花粉粒育性的方法，包括如下步驟：

分別以待鑒定大豆、冀豆12和雄性不育突變體(pst1)的基因組dna為模板，用名稱為x1的pcr引物對進行pcr擴增，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測所得到的pcr產(chǎn)物，按照下述方法確定所述待鑒定大豆的花粉粒育性：

將冀豆12的pcr擴增產(chǎn)物的帶型命名為a，將雄性不育突變體(pst1)的pcr擴增產(chǎn)物的帶型命名為b，如果待鑒定大豆的pcr擴增產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的帶型為所述a，所述待鑒定大豆為或候選為花粉?？捎蠖?，如果待鑒定大豆的pcr擴增產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的帶型為所述b，所述待鑒定大豆為或候選為花粉粒敗育大豆，如果待鑒定大豆的pcr擴增產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的帶型為h帶型，所述h帶型為含有所述a帶型和所述b帶型的帶型，所述待 鑒定大豆為或候選為花粉粒部分可育大豆；

所述x1由seqidno.1和seqidno.2所示的兩條單鏈dna組成。

上述方法中，所述非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，所述非變性聚丙烯酰胺凝膠的濃度為6％，

上述方法中，所述pcr擴增中的引物退火溫度為55℃。

上述方法中，所述pcr擴增中的引物退火條件為55℃30s。

上述方法中，所述待鑒定大豆選自雄性不育突變體(pst1)×冀豆12的雜種后代中的f2及其以后世代的家系。

上述方法中，所述花粉粒部分可育大豆是指單株大豆的可育花粉粒占該株花粉?？倲?shù)的比例為15-90％。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述的方法在大豆育種中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述方法在預(yù)測大豆花粉粒育性中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定大豆花粉粒育性的引物對。

本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定大豆花粉粒育性的引物對，為所述x1。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定大豆花粉粒育性的系統(tǒng)。

本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定大豆花粉粒育性的系統(tǒng)，包括所述引物對、進行pcr擴增所需的試劑和/或儀器、和/或進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳所需的試劑和/或儀器。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述引物對或所述系統(tǒng)在下述a)、b)、c)或d)中的應(yīng)用：

a)大豆育種中的應(yīng)用；

b)預(yù)測或輔助預(yù)測大豆花粉粒育性；

c)制備鑒定或輔助鑒定大豆花粉粒育性的產(chǎn)品；

d)鑒定或輔助鑒定大豆花粉粒育性。

實驗證明，利用分子標記10-0871及其對應(yīng)的引物對x1對大豆花粉粒育性的鑒定結(jié)果與利用常規(guī)檢測方法的鑒定結(jié)果完全一致：將冀豆12(jd12)的帶型命名為a，將雄性不育突變體(pst1)的帶型命名為b，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，f2中的58個花粉粒敗育個體的帶型均為b，20個花粉?？捎齻€體的電泳帶型均為a，18個半不育個體的帶型均相同，均為h帶型，h帶型為含有a帶型和b帶型的帶型。表明，可利用分子標記10-0871與其對應(yīng)的引物對x1對大豆花粉粒育性進行鑒定，也可用于對大豆雄性不育表型的分子標記輔助選擇。

附圖說明

圖1為雄性不育突變體(pst1)和冀豆12的花粉粒育性的檢測結(jié)果。其中a冀豆12(左)，b為雄性不育突變體(pst1，右)。

圖2為bsa法育性基因連鎖標記篩選結(jié)果。其中，a為ssr-10-0810，b為ssr-10-0871，c為ssr-10-0753；1為可育池fj，2為敗育池sj，3為突變體(pst1)。

圖3為育性基因連鎖標記的驗證結(jié)果。

圖4為分子標記10-0871對f2個體的基因型檢測結(jié)果。pst1表示雄性不育突變體。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明做進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的雄性不育突變體(pst1)為大豆(glycinemax(l.)merr.)品種中品661的ems誘變突變體，花粉粒高度敗育，統(tǒng)一編號為zdd25365，來源于中國國家種質(zhì)資源庫。公眾也可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的大豆(glycinemax(l.)merr.)品種冀豆12：記載于“陳強,閆龍,楊春燕，等.冀豆12遺傳背景下3個回交組合高低蛋白含量后代品系ssr標記分析.中國農(nóng)業(yè)科學,2014年02期”，公眾可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的花粉粒育性的檢測方法如下：取即將開放花蕾，剝出花藥后用鑷子夾裂，放在載玻片上并滴上10微升碘-碘化鉀溶液(m/v,0.1％)，后放入光學顯微鏡下觀察花粉粒染色效果。若花粉粒粒形狀規(guī)則似球形，且呈深黑色則為可育；反之，花粉粒形狀不規(guī)則，淺染或者不染色則為敗育花粉粒。雄性不育突變體(pst1)和冀豆12的花粉粒育性的檢測結(jié)果如圖1所示。雄性不育突變體(pst1)的花粉粒全部敗育，冀豆12的花粉粒全部可育。

實施例1、大豆雄性不育位點的鑒定

以冀豆12(jd12,♂)為父本、突變體(pst1,♀)為母本進行雜交，得到其子代f1，子代f1自交獲得f2分離群體。根據(jù)f2個體花粉粒育性檢測結(jié)果，選取10株可育(花粉粒敗育率為0)個體混和提取dna，構(gòu)建可育池(fj)，同時選取10株敗育(花粉粒敗育率為100％)個體混和提取dna，構(gòu)建敗育池(sj)。

在均勻分布于全基因組的543對ssr中，兩親本間共檢測到有多態(tài)性標記285對，用這些多態(tài)性標記引物對突變體(pst1)、可育池(fj)及敗育池(sj)的基因組dna分別進行pcr擴增，部分引物如表1所示，擴增產(chǎn)物用6％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測(圖2)。結(jié)果顯示，位于gm10上的3對標記擴增產(chǎn)物在可育池(fj)與敗育池(sj)間存在差異，這3個標記分別為ssr-10-0753、10-0810、10-0871，這些標記可能與育性位點存在連鎖。

用ssr-10-0753、ssr-10-0810和ssr-10-0871等三個標分別記檢測f2花粉粒完全敗育個體基因型(圖3)。結(jié)果：28株花粉粒完全敗育f2個體中，5株個體的這三個標記擴增結(jié)果均為雜合帶型(將該帶型命名為h)，2株個體的帶型與jd12的帶型相同(將該帶型命名為a)，其余個體的帶型與突變體(pst1)的帶型相同(將該帶型命名為b)。經(jīng)對花粉粒育性的重新檢測，得知與jd12帶型相同的2株個體為花粉粒可育株。因此可知，ssr-10-0753、ssr-10-0810和ssr-10-0871標記與育性基因存在真實連鎖關(guān)系，ssr-10-0753與ssr-10-0871位點兩側(cè)連鎖標記相距7.5mb。

標記ssr-10-0753、10-0810兩者物理距離為5.2mb，在該區(qū)間內(nèi)新合成17對ssr進行混池篩選。結(jié)果：gm10上新檢測到標記10-0768、10-0773、10-0790與育性基因存在連鎖。選取部分敗育個體驗證上述結(jié)果。49株花粉粒完全敗育f2個體中，12株個體的三對標記擴增結(jié)果均為雜合帶型(h)，其余個體基因型均為突變體(pst1)帶型(b)。

現(xiàn)有定位群體中，育性基因連鎖區(qū)間為10-0753～10-0871，物理區(qū)間約7.5mb，其中區(qū)間內(nèi)五個標記間未發(fā)現(xiàn)交換(ssr-10-0753～10-0810，兩者物理距離為5.2mb)，同時結(jié)合專業(yè)網(wǎng)站phytozome大豆基因組染色體結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，故推測該定位區(qū)間可能位于chrome10的著絲粒區(qū)。為縮小定位區(qū)間，篩選交換單株，進一步擴大定位群體。從現(xiàn)有f2分離群體中，篩選出了敗育個體58株與可育個體185株，用現(xiàn)有連鎖標記進行了基因型檢測，將大豆花粉粒雄性不育基因定位到了標記10-0810～10-0871之間，物理區(qū)間長度縮為2.3mb。

上述過程中用到的部分引物的序列如表1所示，反應(yīng)體系與反應(yīng)程序如下：

pcr反應(yīng)體系：dna:2μl(20ng/μl)，easytaq酶:0.3μl，10×pcrbuffer:2μl，2.5mmdntps:2μl，引物(f/r):3.0μl(2μm)，ddh2o:10.7μl。

pcr反應(yīng)程序：先94℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，擴增36個循環(huán)；最后72℃延伸5min，4℃forever。

非變性凝膠電泳檢測基本流程：制膠、上樣、電泳、銀染、水洗、顯影等，基本步驟類似變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

表1、pst1×jd12組合f2群體基因型檢測所用分子標記及其對應(yīng)引物序列

實施例2、標記10-0871在鑒定大豆雄性不育中的應(yīng)用

以冀豆12(jd12)為父本、雄性不育突變體(pst1)為母本進行雜交，得到其子代f1，子代f1自交獲得f2。共有94個f2單株，利用碘-碘化鉀溶液染色方法檢測這94個f2單株的花粉粒育性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)f2中共有56個花粉粒敗育個體、20個花粉?？捎齻€體和18個半不育個體，其中半不育個體是指單株大豆的可育花粉粒占該株花粉粒的比例為15-90％的個體。提取得到冀豆12(jd12)、雄性不育突變體(pst1)以及f2各單株的基因組dna。

利用分子標記10-0871的引物對x1分別對冀豆12(jd12)、雄性不育突變體(pst1)以及f2各單株的基因組dna進行pcr擴增。x1為由10-0871f：5’-agactagctcggttccctcc-3’(序列表中序列1)和10-0871r：5’-gtccatgacaaattcctggc-3’(序列表中序列2)組成的引物對。反應(yīng)體系如下：dna:2μl(20ng/μl)，easytaq酶:0.3μl，10×pcrbuffer:2μl，2.5mmdntps:2μl，引物(f/r):3.0μl(2μm)，ddh2o:10.7μl。pcr反應(yīng)程序：先94℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，擴增36個循環(huán)；最后72℃延伸5min，4℃forever。pcr反應(yīng)結(jié)束后，用6％的非變性凝膠電泳對pcr產(chǎn)物進行檢測。

將冀豆12(jd12)的帶型命名為a，將雄性不育突變體(pst1)的帶型命名為b，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，f2中的58個花粉粒敗育個體的帶型均為b，20個花粉粒可育個體的電泳帶型均為a，18個半不育個體的帶型均相同，均含有a和b的帶型，將該種帶型命名 為h，結(jié)果如圖4所示。利用分子標記10-0871及其引物對x1對大豆花粉粒育性的鑒定結(jié)果與利用碘-碘化鉀溶液的鑒定結(jié)果一致，表明分子標記10-0871是與大豆花粉育性連鎖的分子標記，可利用分子標記10-0871及其引物對x1對大豆花粉粒育性進行輔助鑒定。