本發(fā)明屬于鹿皮膠原蛋白提取工藝技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種梅花鹿鹿皮膠原蛋白的提取方法。

背景技術(shù)：

鹿皮由于鞣制后異常堅韌、柔軟，因此無論在服裝行業(yè)還是在制造擦拭精密儀器等方面都倍受青睞，但是不僅如此，鹿皮中還含有豐富的膠原蛋白。雖然國內(nèi)外對膠原蛋白的研究已相當廣泛，但對于鹿皮中含有的膠原蛋白的研究及提取仍然處于初級階段，鹿皮中的膠原蛋白能夠促進細胞生長，有保持皮膚彈性，延緩肌膚衰老，美容、祛皺等功效，德國研究者表明膠原蛋白中的多肽可以抑制酪氨酸酶的活性，從而有減少色斑的作用。同時膠原蛋白中含有的羥脯氨酸是將血漿中的鈣運輸?shù)焦羌毎闹匾d體并使鈣質(zhì)與骨細胞結(jié)合。膠原蛋白成為補鈣的重要條件之一，并且膠原蛋白能保持血管彈性，防止血栓及血管破裂。膠原蛋白還可以延長分解代謝的過程，燃燒更多的脂肪，從而達到減肥的目的。因此，鹿皮膠原蛋白的提取方法對提取更多更優(yōu)質(zhì)的膠原蛋白及對擴展其應用方面具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要對梅花鹿鹿皮中含有的膠原蛋白的提取方法進行研究，發(fā)現(xiàn)其可以較為簡單的提出膠原蛋白多肽物質(zhì)(分子量在3kda～20kda的活性物質(zhì))。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的目的在于提供更優(yōu)化的梅花鹿鹿皮膠原蛋白的提取方法，具有提取操作簡單、提取率高、環(huán)保高效的特點。為日后應用鹿皮膠原蛋白制備功能性食品、開拓鹿皮膠原蛋白的市場前景等打下一定基礎(chǔ)。

本發(fā)明主要是利用酸水解和酶解聯(lián)合的方式提取鹿皮中的膠原蛋白，并通過優(yōu)化消化時間及添加的酶量等條件從而達到能夠提取較高濃度的膠原蛋白的目的。

本發(fā)明所述的一種梅花鹿鹿皮膠原蛋白的提取方法，其步驟如下：

(1)鹿皮前處理：去除鹿皮上的毛、油脂和粘附組織，用清水反復漂洗至無血色，瀝干后將鹿皮切成小條；

(2)脫脂：將步驟(1)產(chǎn)物放入質(zhì)量分數(shù)為10～20％的醋酸水溶液中浸泡5～10天，再用蒸餾水漂洗、瀝干；

(3)膠原蛋白的提?。簩⒉襟E(2)的產(chǎn)物加蒸餾水定容至200～500ml，勻漿后加純醋酸至醋酸終濃度為0.5mol/l，再加入1～11ml胃蛋白酶的醋酸溶液，胃蛋白酶醋酸溶液中，胃蛋白酶的濃度為15～30mg/ml；然后在37℃條件下攪拌消化8～52h，再用naoh水溶液調(diào)節(jié)ph至9～10，隨后加入與naoh水溶液等體積的蒸餾水后靜置過夜；

(4)用鹽酸將步驟(3)得到的反應體系調(diào)節(jié)ph至3～5，攪拌2～4h，再按終濃度15～25g/l加入經(jīng)鹽酸處理過的硅藻土，然后攪拌、靜置、過濾，去除沉淀物，取膠原蛋白上清液，在-45℃～-50℃條件下冷凍干燥，得白色粉末即為梅花鹿鹿皮膠原蛋白。

上述方法中，經(jīng)鹽酸處理過的硅藻土，是用5～20mmol/l鹽酸浸泡硅藻土1～3h，用蒸餾水清洗數(shù)次得到。

附圖說明

圖1：實施例2～9bca法蛋白定量結(jié)果：消化時間與膠原蛋白濃度的線性關(guān)系曲線；定酶量(30mg)優(yōu)化消化時間，本發(fā)明合適的消化時間范圍是28～36h，其中消化時間為28h時得到的蛋白濃度最高。

圖2：實施例1、實施例10～16bca法蛋白定量結(jié)果：酶量與膠原蛋白濃度的線性關(guān)系曲線；定時間(28h)優(yōu)化酶量，其中酶量220mg時得到的膠原蛋白濃度最高。但200mg和220mg酶量的蛋白濃度(13.46mg/ml、13.81mg/ml)差距并不大，可認為220mg為最優(yōu)酶量，但不計成本條件下也可再適當提高酶量從而達到提高蛋白濃度的目的。本發(fā)明合適的酶量范圍是200～220mg。

圖3：tricine-sds-page凝膠電泳圖譜，由于bca法蛋白定量結(jié)果28h時蛋白濃度最高，因此圍繞28h前后共五個時間點，對膠原蛋白進行分子量分析，從電泳圖譜可以看出20kda以下，12h、24h、28h、32h、36h均有較寬的蛋白條帶，凝膠底端邊緣處也都呈現(xiàn)出較明顯的蛋白條帶，說明提取的膠原蛋白中有很多較小分子的多肽物質(zhì)，并且其中28h組相對其他組在凝膠底端有更明顯的蛋白聚集，與bca法蛋白定量結(jié)果28h時得到的蛋白濃度最高的結(jié)果相呼應。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實施例1為酶量、消化時間的最優(yōu)方案；實施例2～9為相同酶量、不同消化時間制備的膠原蛋白上清液；實施例10～16為相同時間、不同酶量制備的膠原蛋白上清液。

實施例1：

1、將梅花鹿鹿皮剝離后，釘在木板上，用剪刀和刮刀剔除皮上的毛并用刀刮去皮上的油脂和粘附組織；

2、將步驟1處理后的鮮鹿皮用清水反復漂洗至無血色并瀝干；

3、將步驟2處理后的鹿皮用斬切機切成1㎝×2㎝的小細條，用質(zhì)量分數(shù)10％的醋酸水溶液浸泡7天；

4、將步驟3得到的去除了皮毛、油脂和角質(zhì)層的鹿皮，用蒸餾水反復漂洗3次后瀝干；

5、取25g步驟4處理得到的鹿皮，加蒸餾水300ml定容至鹿皮的含量為25g/300ml，用組織搗碎機勻漿；

6、向步驟5的反應體系中加入純醋酸至醋酸濃度為0.5mol/l，組織勻漿；

7、用0.5mol/l醋酸配制胃蛋白酶的醋酸溶液(20mg/ml)，然后將該胃蛋白酶溶液11ml，即質(zhì)量為220mg的胃蛋白酶，加入到步驟6的組織勻漿中，37℃攪拌消化28h；

8、用10mol/lnaoh水溶液(2.8ml)將步驟7產(chǎn)物的ph調(diào)節(jié)至9，靜置過夜；

9、為了后期便于過濾，向步驟8產(chǎn)物中加入等體積(與步驟8中加入的naoh的體積量相同)的蒸餾水，用1.2ml鹽酸調(diào)節(jié)ph至4，攪拌2h(至此步驟，上述反應體系的體積一共為328.54ml)，得到消化液；

10、用10mmol/l鹽酸浸泡硅藻土2h，用蒸餾水清洗數(shù)次；然后按濃度20g/l將處理過的硅藻土(即6.57g鹽酸處理過的硅藻土)，加入步驟9的消化液中，室溫下，攪拌混勻后靜置至上清液與沉淀呈明顯分層狀態(tài)；

11、將玻璃纖維濾紙置于布氏漏斗中對步驟10的產(chǎn)物進行過濾，濾出硅藻土及其他沉淀、雜質(zhì)。如膠原蛋白溶液仍渾濁，可重復過濾一次；

12、收集步驟11過濾得到的膠原蛋白上清液，并用infinite200系列酶標儀測得蛋白濃度為13.81mg/ml。

13、將步驟12得到的上清液用凍干機在-50℃冷凍干燥，從而得到本發(fā)明所述的鹿皮膠原蛋白白色粉末14.20g。

實施例2：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中胃蛋白酶質(zhì)量為30mg，消化時間為8h，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是2.81mg/ml。

實施例3：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中胃蛋白酶質(zhì)量為30mg，消化時間為12h，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是4.10mg/ml。

實施例4：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中胃蛋白酶質(zhì)量為30mg，消化時間為24h，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是4.65mg/ml。

實施例5：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中胃蛋白酶質(zhì)量為30mg，消化時間為28h，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是5.28mg/ml。

實施例6：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7種胃蛋白酶質(zhì)量為30mg，消化時間為32h，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是5.16mg/ml。

實施例7：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中胃蛋白酶質(zhì)量為30mg，消化時間為36h，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是5.10mg/ml。

實施例8：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中胃蛋白酶質(zhì)量為30mg，消化時間為48h，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是5.08mg/ml。

實施例9：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中胃蛋白酶質(zhì)量為30mg，消化時間為52h，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是3.83mg/ml。

通過實施例5得出最優(yōu)的消化時間為28h，以此條件進而優(yōu)化使用酶量進行如下述實施例。

實施例10：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中消化時間為28h，胃蛋白酶質(zhì)量為20mg，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是4.09mg/ml。

實施例11：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中消化時間為28h，胃蛋白酶質(zhì)量為40mg，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是7.09mg/ml。

實施例12：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中消化時間為28h，胃蛋白酶質(zhì)量為60mg，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是7.25mg/ml。

實施例13：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中消化時間為28h，胃蛋白酶質(zhì)量為100mg，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是9.03mg/ml。

實施例14：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中消化時間為28h，胃蛋白酶質(zhì)量為140mg，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是9.61mg/ml。

實施例15：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中消化時間為28h，胃蛋白酶質(zhì)量為180mg，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是11.64mg/ml。

實施例16：

操作及各個條件如實施例1中所述，只是步驟7中消化時間為28h，胃蛋白酶質(zhì)量為200mg，步驟12得到的上清液中的蛋白濃度是13.46mg/ml。

其中實施例1所給出的條件較其他實施例為最優(yōu)條件，且得到的蛋白濃度最高(13.81mg/ml)。