本發(fā)明屬于生物工程和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種珠蛋白肽的制備方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)代動物營養(yǎng)理論正由傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)、氨基酸營養(yǎng)理論向小肽營養(yǎng)理論過渡，小肽營養(yǎng)成為繼蛋白質(zhì)營養(yǎng)后的又一熱點(diǎn)。近年來國內(nèi)外的研究表明，機(jī)體對蛋白質(zhì)利用并不局限于游離氨基酸的形式，還有相當(dāng)一部分是以2-3個氨基酸組成的二肽與三肽形式吸收。隨著研究的不斷深入，具有多種功能的小肽已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，如免疫肽、抗菌肽、抗氧化肽、激素肽等，小肽營養(yǎng)越來越受到人們的關(guān)注。當(dāng)前，肽類飼料添加劑已越來越受到國內(nèi)外飼料行業(yè)的重視，它具有提高機(jī)體免疫力、減少抗生素在飼料中的應(yīng)用、提高飼料轉(zhuǎn)化率和畜禽健康狀況、促進(jìn)動物的正常發(fā)育和生長、提高動物的繁殖力和生產(chǎn)性能等多種作用。我國畜禽產(chǎn)量居世界前列，畜禽血液供應(yīng)量可達(dá)387萬噸。但目前豬血加工量僅約占血液總量的23％，且國內(nèi)飼用畜禽血液制品市場主流產(chǎn)品以噴霧干燥血漿蛋白粉、噴霧干燥血球蛋白粉為主。因此，動物血深加工還有較大的開發(fā)空間。當(dāng)前，從血紅蛋白中分離血紅素制備血紅蛋白等產(chǎn)物的方法主要包括：溶劑脫色法、吸附劑脫色法、氧化劑脫色法、酸化氧化脫色法、酶解吸附等，但大都在工業(yè)化生產(chǎn)和實際應(yīng)用中存在限制，如工藝繁瑣、生產(chǎn)成本高、有機(jī)溶劑殘留、蛋白回收率低等。因此，本領(lǐng)域迫切需要研發(fā)出一種高效便捷、可適用于規(guī)?；a(chǎn)的珠蛋白肽制備方法，提高動物血的綜合利用率和附加價值，減少環(huán)境污染。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種珠蛋白肽的制備方法及采用該方法獲得的珠蛋白肽的用途。本發(fā)明的第一方面，提供一種制備珠蛋白肽的方法，包括步驟：(a)提供一血紅蛋白液i；(b)對所述血紅蛋白液i進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括在ph9-12和/或溫度60-85℃下處理一段時間h，從而獲得經(jīng)預(yù)處理的血紅蛋白液ii；(c)用堿性蛋白酶對所述血紅蛋白液ii進(jìn)行第一酶解反應(yīng)，從而得到血紅蛋白酶解液iii；(d)將所述血紅蛋白液iii的ph調(diào)節(jié)至ph5.5-8.5(弱堿性、中性或弱酸性)，從而得到血紅蛋白酶解液iv；(e)用中性蛋白酶對所述血紅蛋白酶解液iv進(jìn)行第二酶解反應(yīng)，從而得到珠蛋白酶解液v；(f)從所述珠蛋白酶解液v中分離出含分子量w范圍介于100-2500道爾頓的肽的溶液，即得到珠蛋白肽液vi；和(g)任選地對所述珠蛋白肽液vi進(jìn)行干燥，得到經(jīng)干燥的珠蛋白肽。在另一優(yōu)選例中，所述的血紅蛋白液i通過以下方法制備：(a0)對分離的血球進(jìn)行破膜處理，從而得到含細(xì)胞膜和被釋放的血球內(nèi)含物的第一混合物；(a1)對所述第一混合物用孔徑0.01-0.50微米的微濾膜進(jìn)行微濾，從而獲得去除細(xì)胞膜的濾液，即血紅蛋白液i。在另一優(yōu)選例中，所述的微濾膜的孔徑為0.05-0.45微米，更佳地為0.10-0.40微米。在另一優(yōu)選例中，在所述步驟(a)和(b)之間或步驟(a1)和(b)之間，所述方法還包括步驟：對所述的血紅蛋白液i用水進(jìn)行1-10倍(較佳地2-5倍)的稀釋處理，從而獲得經(jīng)稀釋的血紅蛋白液i。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，所述預(yù)處理包括用ph調(diào)節(jié)劑i調(diào)節(jié)血紅蛋白液i的ph至ph9-12，然后升溫至60-80℃，并保持一段時間h。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，所述的一段時間h為0.1-6小時，較佳地為0.2-3小時，更佳地為0.5-2小時。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中，用ph調(diào)節(jié)劑i調(diào)節(jié)所述血紅蛋白液i的ph值，并且所述的ph調(diào)節(jié)劑i選自下組：naoh、koh、碳酸鈉、碳酸鉀、或其組 合。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中，預(yù)處理的ph范圍為9.5-11，較佳地為9.8-11。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中，預(yù)處理溫度為65-80℃，較佳地70-75℃。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)中，所述酶解溫度為40-95℃，較佳地為50-80℃，更佳地為65-85℃。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)中，酶解時間為1-30小時，較佳地為5-25小時，更佳地為10-20小時。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)中，所述血紅蛋白液ii中肽類物質(zhì)(即蛋白酶的酶解底物)的濃度(按干重計)為2-20％，較佳地為4％-18％，更佳地為6％-10％。在另一優(yōu)選例中，所述的“肽類物質(zhì)”指由n個氨基酸殘基構(gòu)成的多肽物質(zhì)，其中n為≥2的正整數(shù)，包括寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)中，所述堿性蛋白酶的用量為血紅蛋白液ii中肽類物質(zhì)總重量(干重)的0.2％-5％，較佳地為0.5-4％，更佳地為1-3％。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d)中，用ph調(diào)節(jié)劑ii調(diào)節(jié)所述血紅蛋白液ii的ph值，并且所述的ph調(diào)節(jié)劑ii選自下組：檸檬酸、鹽酸、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d)中，將所述血紅蛋白液iii的ph調(diào)至6-8，較佳地為7-7.5。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(e)中，所述酶解溫度為35-65℃，較佳地為40-55℃，更佳地為45-50℃。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(e)中，酶解時間為1-30小時，較佳地為5-25小時，更佳地為10-20小時。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(e)中，所述血紅蛋白液iv中肽類物質(zhì)(即蛋白酶的酶解底物)的濃度(按干重計)為2-20％，較佳地為4％-18％，更佳地為6％-15％在另一優(yōu)選例中，所述步驟(e)中，所述中性蛋白酶的用量為血紅蛋白液iv中肽類物質(zhì)總重量(干重)的0.1％-5％，較佳地為1-4％。在另一優(yōu)選例中，在步驟(f)中，所述珠蛋白肽液vi中分子量w范圍介于100-2500道爾頓的肽的含量≥90％(較佳地≥92％)，按100-2500道爾頓的肽占樣品總蛋白百分比計。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(f)中，所述分離包括用納濾膜進(jìn)行過濾。在另一優(yōu)選例中，所述的“用納濾膜進(jìn)行過濾”包括用截斷值為d1的第一納濾膜進(jìn)行第一納濾，和用截斷值為d2的第二納濾膜進(jìn)行第二納濾，其中d1為 100-300道爾頓，d2為1000-3000道爾頓。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(g)中，還包括對所述珠蛋白肽液vi進(jìn)行濃縮。在另一優(yōu)選例中，所述濃縮的濃縮倍數(shù)為2-5倍。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(g)中，所述干燥方法選自下組：噴霧干燥、冷凍干燥、或其組合。在另一優(yōu)選例中，在步驟(f)或(g)中，所述的珠蛋白肽液vi或所述干燥的珠蛋白肽中，分子量在180-1000da的寡肽含量在80％以上，按所述珠蛋白肽液vi或所述干燥的珠蛋白肽中肽類物質(zhì)的總量計。在另一優(yōu)選例中，所述的血球來源選自下組：家畜、家禽、或其組合；較佳地選自下組：豬、牛、羊、雞、鴨、和鵝。本發(fā)明第二方面，提供一種珠蛋白肽產(chǎn)品，所述珠蛋白肽產(chǎn)品是用本發(fā)明第一方面所述的方法制備的。在另一優(yōu)選例中，所述珠蛋白肽中≥80wt％肽(較佳地≥85wt％，更佳地≥90wt％)的分子量為150-1000da。在另一優(yōu)選例中，所述珠蛋白肽中≤8wt％肽(較佳地≤7wt％，更佳地≤6wt％，最佳地≤5wt％)分子量在150-2000da范圍之外。在另一優(yōu)選例中，所述珠蛋白肽中≤15wt％肽(較佳地≤14wt％，更佳地≤13wt％，最佳地≤10wt％)分子量在150-1000da范圍之外。在另一優(yōu)選例中，所述珠蛋白肽在150-1000道爾頓(更佳地180-1000道爾頓)之間的肽含量≥80％，更佳地≥85％，按所述珠蛋白肽產(chǎn)品中肽類物質(zhì)的總量計。在另一優(yōu)選例中，在150-500道爾頓(更佳地180-500道爾頓)之間的肽含量≥40％，更佳地50-65％，較佳地55-60％，按所述珠蛋白肽產(chǎn)品中肽類物質(zhì)的總量計。在另一優(yōu)選例中，所述的珠蛋白肽產(chǎn)品的灰分≤8wt％，較佳地≤6wt％，更佳地≤5wt％，最佳地≤4.5wt％。本發(fā)明第三方面，提供一種飼料組合物，所述飼料組合物含有本發(fā)明第二方面所述的珠蛋白肽產(chǎn)品。在另一優(yōu)選例中，所述飼料組合物含有0.05-20wt％所述的珠蛋白肽產(chǎn)品，按 飼料組合物總重量計。在另一優(yōu)選例中，所述飼料組合物含有0.1-10wt％，較佳地0.2-5wt％所述的珠蛋白肽產(chǎn)品，按飼料組合物總重量計。在另一優(yōu)選例中，所述的飼料組合物含有所述的珠蛋白肽產(chǎn)品和飼料上可接受的其它飼料原料和/或輔料。在另一優(yōu)選例中，所述的飼料原料包括谷物、干草等。本發(fā)明第四方面，提供一種制備飼料組合物的方法，包括步驟：(i)用本發(fā)明第一方面所述的方法制備所述的珠蛋白肽液vi；和任選地對所述珠蛋白肽液vi進(jìn)行干燥，得到經(jīng)干燥的珠蛋白肽；(ii)將所述的珠蛋白肽液vi或所述的經(jīng)干燥的珠蛋白肽與飼料上可接受的其它飼料原料和/或輔料進(jìn)行混合，從而獲得飼料組合物。本發(fā)明第五方面，提供一種如本發(fā)明第一方面所述的珠蛋白肽的用途，用作飼料添加劑、動物保健品添加劑、動物食品添加劑。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了本發(fā)明制備珠蛋白肽的方法的流程示意圖。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過大量篩選和對工藝的優(yōu)化，首次開發(fā)了一種大規(guī)模的制備寡肽含量高、灰分低的珠蛋白肽方法。本發(fā)明方法制備的珠蛋白肽中分子量≤1000道爾頓的寡肽占絕大部分，灰分極低且安全性高，故具有更好的刺激家畜等動物產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的功能。此外，本發(fā)明優(yōu)化工藝綜合了微濾技術(shù)、預(yù)處理、程序化酶解、以及特定納膜過濾等技術(shù)，從而顯著提高動物血資源的綜合利用率，避免了資源浪費(fèi)，有效減少了環(huán)境污染。此外，本發(fā)明方法還具有方便快捷、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語說明除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，術(shù)語“血球”和“血細(xì)胞”可互換使用，指血液中的紅血球細(xì)胞。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時，術(shù)語“約”意指該值可以從列舉的值變動不多于1％。例如，如本文所用，表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。如本文所用，術(shù)語“含有”或“包括(包含)”可以是開放式、半封閉式和封閉式的。換言之，所述術(shù)語也包括“基本上由…構(gòu)成”、或“由…構(gòu)成”。珠蛋白肽本發(fā)明提供了一種珠蛋白肽產(chǎn)品，所述珠蛋白肽中≥80wt％肽(較佳地≥85wt％，更佳地≥90wt％)的分子量為150-1000da。在另一優(yōu)選例中，所述珠蛋白肽中≤8wt％肽(較佳地≤7wt％，更佳地≤6wt％，最佳地≤5wt％)分子量在150-2000da范圍之外。在另一優(yōu)選例中，所述珠蛋白肽中≤15wt％肽(較佳地≤14wt％，更佳地≤13wt％，最佳地≤10wt％)分子量在150-1000da范圍之外。在另一優(yōu)選例中，所述珠蛋白肽在150-1000道爾頓(更佳地180-1000道爾頓)之間的肽含量≥80％，更佳地≥85％，按所述珠蛋白肽產(chǎn)品中肽類物質(zhì)的總量計。在另一優(yōu)選例中，在150-500道爾頓(更佳地180-500道爾頓)之間的肽含量≥40％，更佳地50-65％，較佳地55-60％，按所述珠蛋白肽產(chǎn)品中肽類物質(zhì)的總量計。在另一優(yōu)選例中，所述的珠蛋白肽產(chǎn)品的灰分≤8wt％，較佳地≤6wt％，更佳地≤5wt％，最佳地≤4.5wt％。在另一優(yōu)選例中，所述珠蛋白肽具有如下功能特性：(1)生物安全性高；(2)寡肽含量高；(3)灰分低。血球原料本發(fā)明所述的血球來源于動物，包括畜類和禽類等。來源于動物血液的血球均可作為本發(fā)明中生產(chǎn)珠蛋白肽的原料。所述的畜類和禽類如(但不限于)：豬、牛、羊、雞、鴨等。較佳地，采用新鮮健康的血球作為生產(chǎn)珠蛋白肽的原料。從血液中分離出血球是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，本發(fā)明對此不作特別的限制。將血液抗凝、分離，可得到血漿和血球，將血球破膜處理后后作為生產(chǎn)珠蛋白肽的原料。制備方法本發(fā)明制備珠蛋白肽的方法，包括步驟：(a)提供一血紅蛋白液i；(b)對所述血紅蛋白液i進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括在ph9-12和/或溫度60-85℃下處理一段時間h，從而獲得經(jīng)預(yù)處理的血紅蛋白液ii；(c)用堿性蛋白酶對所述血紅蛋白液ii進(jìn)行第一酶解反應(yīng)，從而得到血紅蛋白酶解液iii；(d)將所述血紅蛋白液iii的ph調(diào)節(jié)至ph5.5-8.5(弱堿性、中性或弱酸性)，從而得到血紅蛋白酶解液iv；(e)用中性蛋白酶對所述血紅蛋白酶解液iv進(jìn)行第二酶解反應(yīng)，從而得到珠蛋白酶解液v；(f)從所述珠蛋白酶解液v中分離出含分子量w范圍介于100-2500道爾頓的肽的溶液，即得到珠蛋白肽液vi；和(g)任選地對所述珠蛋白肽液vi進(jìn)行干燥，得到經(jīng)干燥的珠蛋白肽。檢測方法對于本發(fā)明的珠蛋白肽產(chǎn)品或制備過程的其它產(chǎn)品或樣品，可用常規(guī)方法測定其肽類物質(zhì)的含量以及分子量分布。對于小肽含量檢測，一般利用常規(guī)方法(包括但不限于tca處理法)測定珠蛋白肽或其它樣品中的肽含量。典型地，先利用三氯乙酸(tca)作蛋白質(zhì)沉淀劑，將樣品蛋白中的蛋白質(zhì)和肽鏈較長的肽沉淀，并將其中的短鏈小肽用酸溶解出來，經(jīng)過過濾、離心、消化、蒸餾，測定其蛋白質(zhì)含量，并以其占樣品粗 蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)來表示含量。對于總蛋白含量測定，代表性的測定方法包括(但并不限于)：凱氏定氮法。對于珠蛋白肽或其它樣品的分子量分布，代表性的測定方法包括(但并不限于)：凝膠過濾色譜法。如果采用高效凝膠過濾色譜法測定，一般以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進(jìn)行分離，在肽鍵的紫外吸收波長220納米條件下檢測，使用凝膠色譜測定分子量分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即gpc軟件)，對色譜圖及其數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計算得到珠蛋白肽的相對分子量大小及分布范圍(參照國家標(biāo)準(zhǔn)gb/t22729-2008海洋魚低聚肽粉中規(guī)定的利用高效凝膠過濾色譜法測定肽分子量分布)。珠蛋白肽用途本發(fā)明的珠蛋白肽可用作飼料原料、動物保健品原料及載體。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明方法制備的珠蛋白肽中分子量≤1000道爾頓的寡肽占絕大部分，灰分極低且安全性高，故具有更好的刺激家畜等動物產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的功能。(2)本發(fā)明的珠蛋白肽產(chǎn)品具有高水溶性、高流動性，可用于多種動物在不同發(fā)育階段的飼料中，也可用作動物保健品原料及載體。(3)本發(fā)明的優(yōu)化工藝綜合了微濾技術(shù)、預(yù)處理、程序化酶解、以及特定納膜過濾等技術(shù)，從而顯著提高動物血資源的綜合利用率，避免了資源浪費(fèi)，有效減少了環(huán)境污染。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。本發(fā)明中的質(zhì)量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。通用方法1.凱氏定氮法檢測的粗蛋白含量檢測步驟：準(zhǔn)確稱取樣品6g，準(zhǔn)確加入15％三氯乙酸50ml，混合均勻，靜置5min。以中速定性濾紙過濾，棄去少許初始濾液，將濾液轉(zhuǎn)移至離心管，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min。準(zhǔn)確移取一定體積v的離心上清(建議2ml或4ml)，進(jìn)行粗蛋白測定。測定樣品總粗蛋白。計算方法及重復(fù)性：小肽％＝離心上清粗蛋白含量％*50/v/樣品總蛋白粗蛋白含量*100％，每個試樣的兩個平行樣間允許相對偏差為其算術(shù)平均值的10％，以其算式平均值為上報結(jié)果。所得結(jié)果是指小肽占粗蛋白的百分含量。2.tca處理法測定肽含量(如測定珠蛋白肽中的肽含量)利用三氯乙酸(tca)作蛋白質(zhì)沉淀劑，將樣品蛋白中的蛋白質(zhì)和肽鏈較長的肽沉淀，并將其中的短鏈小肽用酸溶解出來，經(jīng)過過濾、離心、消化、蒸餾，測定其蛋白質(zhì)含量，并以其占樣品粗蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)來表示含量。使用的試劑和儀器：100ml燒杯；50ml、10ml移液管；過濾裝置；測定粗蛋白設(shè)備、15％三氯乙酸、4000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)。3.肽分子量分布測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)gb/t22729-2008海洋魚低聚肽粉中規(guī)定，利用高效凝膠過濾色譜法測定肽分子量分布。實施例1制備珠蛋白肽no.1制備方法包括以下步驟：(a0)破膜處理：對于新鮮血球(已經(jīng)與血漿分離開)，采用常規(guī)的破膜處理，從而從血球中釋放出血紅蛋白(新鮮血球因其具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使血紅蛋白包裹在以脂類為主要成份的細(xì)胞膜內(nèi)，因此破膜處理有助于提高珠蛋白肽的最終收率)；(a1)脫膜：將破膜處理后的含所述釋放的血紅蛋白的溶液作為原料，經(jīng)0.3微米濾膜微濾，濾去細(xì)胞膜，獲得去除膜組分的血紅蛋白液i；(b)預(yù)處理：用ph調(diào)節(jié)劑naoh，調(diào)節(jié)血紅蛋白液i的ph至約10，升溫 至約75℃，保溫1小時，獲得經(jīng)預(yù)處理的血紅蛋白液ii(經(jīng)測定，肽類物質(zhì)的含量為wt％。)；(c)第一酶解：加入堿性蛋白酶(加入量2％(酶/底物蛋白質(zhì)量百分比))，對所述血紅蛋白液ii進(jìn)行第一酶解反應(yīng)(溫度58℃，時間6小時)，從而得到血紅蛋白酶解液iii；(d)調(diào)節(jié)ph值至弱堿性、中性或弱酸性：用ph調(diào)節(jié)劑檸檬酸，將所述血紅蛋白液iii的ph調(diào)節(jié)ph至約7，從而得到血紅蛋白酶解液iv(經(jīng)測定，肽類物質(zhì)的含量為wt％。)；(e)第二酶解：用中性蛋白酶(加入量2％(酶/底物蛋白質(zhì)量百分比))，對所述血紅蛋白酶解液iv進(jìn)行第二酶解反應(yīng)(溫度45℃，酶解時間8小時)，從而得到珠蛋白酶解液v；(f)分離珠蛋白肽：采用不同截斷值的納濾膜(1kd和180道爾頓)進(jìn)行組合納濾，對所述珠蛋白酶解液v進(jìn)行納濾，從而從所述珠蛋白酶解液v中分離出含分子量w范圍為180-1000道爾頓的肽的溶液，即為得到珠蛋白肽液vi；和(g)干燥：對所述珠蛋白肽液vi進(jìn)行噴霧干燥，從而得到經(jīng)干燥的珠蛋白肽。實施例2制備珠蛋白肽no.2重復(fù)實施例1，不同點(diǎn)在于，在步驟(a1)中，用0.45微米微濾替換0.3微米濾膜微濾。對比例1制備珠蛋白肽no.c1重復(fù)實施例1，不同點(diǎn)在于，在步驟(a1)中，用4000轉(zhuǎn)/min離心15分鐘從而去除細(xì)胞膜及其它雜質(zhì)。(即替換“0.3微米濾膜微濾”)對實施例1-2以及對比例1制備的珠蛋白肽產(chǎn)品，進(jìn)行珠蛋白肽產(chǎn)品中粗蛋白和肽的含量測定，結(jié)果列于下表a：表a實施例/對比例產(chǎn)品編號處理條件粗蛋白肽含量實施例1no.10.3微米微濾91.2％82.1％實施例2no.20.45微米微濾90.9％81.3％對比例1no.c14000轉(zhuǎn)/min離心85.3％73.9％結(jié)果表明，雖然微濾和離心都可有效去除膜成分，但是微濾可減少分離過 程中蛋白物質(zhì)的損失，制備的珠蛋白肽中蛋白含量、肽含量更高。對比例2制備珠蛋白肽no.c2重復(fù)實施例1，不同點(diǎn)在于，僅省略步驟(d)。對比例3制備珠蛋白肽no.c3重復(fù)實施例1，不同點(diǎn)在于，僅省略步驟(c)。對比例4制備珠蛋白肽no.c4重復(fù)實施例1，不同點(diǎn)在于，省略步驟(c)并且在步驟(d)中將ph調(diào)節(jié)至3，并在步驟(e)中用酸性蛋白酶(用量為2％(酶/底物蛋白質(zhì)量百分比)，進(jìn)行第二酶解(溫度、時間相同)。對比例5制備珠蛋白肽no.c5重復(fù)實施例1，不同點(diǎn)在于，省略步驟(c)并且在步驟(d)中將ph調(diào)節(jié)至7，并在步驟(e)中用木瓜蛋白酶(用量為2％(酶/底物蛋白質(zhì)量百分比))，進(jìn)行第二酶解(溫度、時間相同)。實施例3制備珠蛋白肽no.3重復(fù)實施例1，不同點(diǎn)在于，在步驟(d)中將ph調(diào)節(jié)至3，并在步驟(e)中用酸性蛋白酶(用量為2％(酶/底物蛋白質(zhì)量百分比))，進(jìn)行第二酶解(溫度、時間相同)。實施例4制備珠蛋白肽no.4重復(fù)實施例1，不同點(diǎn)在于，在步驟(d)中將ph調(diào)節(jié)至7，并在步驟(e)中 用木瓜蛋白酶(用量為2％(酶/底物蛋白質(zhì)量百分比))，進(jìn)行第二酶解(溫度、時間相同)。對上述實施例1和3-4以及對比例2-5制備的珠蛋白肽產(chǎn)品，進(jìn)行肽含量測定，結(jié)果列于下表b：表b實施例/對比例產(chǎn)品編號酶種類肽含量對比例2c2堿性蛋白酶61.1％對比例3c3中性蛋白酶61.3％對比例4c4酸性蛋白酶56.8％對比例5c5木瓜蛋白酶69.5％實施例1no.1堿性蛋白酶+中性蛋白酶82.1％實施例3no.3堿性蛋白酶+酸性蛋白酶71.3％實施例4no.4堿性蛋白酶+木瓜蛋白酶73.2％表b結(jié)果表明，采用堿性蛋白酶+中性蛋白酶程序化酶解(二次酶解)的提取效率大大提高，達(dá)到80％以上。對比例6制備珠蛋白肽no.c6重復(fù)實施例1，不同點(diǎn)在于，省略步驟(b)。結(jié)果表明，與實施例1相比，省略預(yù)處理步驟，雖然有助于節(jié)約一定時間，但是血紅蛋白溶液的粘度較高，液態(tài)流動性差，不利于后續(xù)操作。對上述實施例1以及對比例6制備的珠蛋白肽產(chǎn)品，進(jìn)行肽含量測定，結(jié)果列于下表：表c實施例/對比例產(chǎn)品編號肽含量實施例1no.182.1％對比例6c650.9％這表明，預(yù)處理不僅有助于提高最終產(chǎn)品中的寡肽含量(可能是因為有助于使得酶解更充分)，而且經(jīng)上述預(yù)處理后的血紅蛋白溶液的流動性有出乎意料的顯著改善，利于后續(xù)程序化酶解操作。實施例5-10制備珠蛋白肽no.5至no.10重復(fù)實施例1，為工藝穩(wěn)定性試驗。所得珠蛋白肽產(chǎn)品的測定結(jié)果如表d所示。表d程序化酶解效果結(jié)果表明，本發(fā)明的制備方法工藝穩(wěn)定性良好，適于工業(yè)應(yīng)用。實施例11-14制備珠蛋白肽no.11至no.14重復(fù)實施例1，不同點(diǎn)在于，在分離珠蛋白肽，采用表e所示的不同截斷值的納濾膜，進(jìn)行單獨(dú)納濾或組合納濾。結(jié)果如表e所示。表e酶解液膜過濾實施例no.納濾膜種類肽含量灰分11no.112k分子膜81.20％10.10％12no.121k分子膜82.10％10.20％13no.13180分子膜83.10％4.30％14no.14180-1k組合84.70％4.10％小肽％＝離心上清粗蛋白含量％*50/v/樣品總蛋白粗蛋白含量*100％，每個試樣的兩個平行樣間允許相對偏差為其算術(shù)平均值的10％，以其算式平均值為上報結(jié)果。所得結(jié)果是指小肽占粗蛋白的百分含量。在上述實施例11-14中，采用了膜過濾分離技術(shù)，通過選擇一定截斷分子 量的過濾膜對酶解液進(jìn)行處理，獲取目標(biāo)肽溶液進(jìn)行噴霧干燥。結(jié)果表明，截斷值(cut-off)過大時，會導(dǎo)致產(chǎn)品中灰分較高，截斷值(cut-off)過小會導(dǎo)致產(chǎn)品中大分子蛋白增加。結(jié)果表明，采用例如180da和1000da進(jìn)行組合納濾，不僅可有效降低產(chǎn)品灰分，還可進(jìn)一步提高寡肽含量。實施例15：中試試驗本實施例中，對血球前處理、程序化酶解和組合膜過濾進(jìn)行集成并進(jìn)行中試試驗，最終通過噴霧干燥獲得珠蛋白肽，中試參數(shù)如表f所示。每次中試處理的血球原料量為2噸。表f中試參數(shù)表方案程序化酶解底物濃度10％酶濃度2％第一步ph10第一步時間6第二步ph7.5第二步時間8調(diào)酸過濾鹽酸調(diào)酸，過濾分離180-1k分子量組合膜過濾干燥噴霧干燥利用凝膠色譜法對產(chǎn)品的分子量分布進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的肽絕大部分集中在2至8個氨基酸分子量水平，因此，利用本發(fā)明的程序化酶解技術(shù)制備的產(chǎn)品中的肽絕大多數(shù)是寡肽，珠蛋白肽分子量分布測試結(jié)果列于表g。表g珠蛋白肽粉分子量分布測試實施例16：珠蛋白肽對豬瘟抗體效價的影響選擇35日齡、體重胎次相近的“長×大”二元去勢公豬40頭?；A(chǔ)日糧由上海高得飼料有限公司生產(chǎn)，營養(yǎng)水平為：代謝能13.6mj/kg，粗蛋白19.3％，鈣0.7％，磷0.6％，賴氨酸1.2％。試驗組日糧為基礎(chǔ)日糧中添加0.5％的珠蛋白肽，由上海杰隆生物制品有限公司提供。按單因素完全隨機(jī)設(shè)計把實驗用仔豬隨機(jī)分為2組：對照組(n＝20)：基礎(chǔ)日糧試驗組(n＝20)：基礎(chǔ)日糧+0.5wt％珠蛋白肽(如實施例15制備)，每組2個重復(fù)，每個重復(fù)10頭仔豬，試驗期30天。試驗動物統(tǒng)一采用高床平養(yǎng)雙列式保育舍飼養(yǎng)，每天早中晚各飼喂1次，自由采食和飲水，每天清洗豬欄一次，疾病預(yù)防和飼養(yǎng)管理均按豬廠的常規(guī)程序進(jìn)行。跟蹤檢測實驗豬的疫苗接種后的抗體滴度。采用豬瘟抗體檢測試劑盒(classicalswinefevervirusantibodytestkit(csfvab))進(jìn)行檢測，測定方法機(jī)理豬瘟病毒抗體elisa檢測試劑盒是用來檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體的檢測試劑盒。該試劑盒是用豬瘟病毒抗原包被的微量反應(yīng)板，利用阻斷elisa原理來檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體。如果被檢樣品中存在豬瘟病毒抗體，它們就會阻斷辣根過氧化物酶標(biāo)記(hrpo)的抗豬瘟病毒的單克隆抗體。單克隆抗體與豬瘟病毒抗原的結(jié)合可以通過辣根過氧化物酶與底物的顯色程度進(jìn)行判定，即用酶標(biāo)儀在單波長450nm或雙波長450nm與620nm測定該反應(yīng)體系的吸光度。當(dāng)被檢樣品中含有豬瘟病毒抗體(陽性結(jié)果)時，顯色就會變淺，當(dāng)被檢樣品中不含有抗豬瘟病毒抗體(陰性結(jié)果)時，顯色就會變深。樣本的阻斷率可以通過450nm波長樣本吸光度與陰性對照吸光度的比值來確定。試劑準(zhǔn)備包被的微量反應(yīng)板，樣品稀釋液，陽性對照，陰性對照，酶標(biāo)二抗，底物溶液和終止液使用前無需處理。洗滌液(10×)濃縮的洗滌液在使用前必須用超純水進(jìn)行10倍稀釋。被稀釋 了的洗滌液可以在4℃的條件下保存3天，或冰凍條件下保存一年。如：250ml的洗滌液需用25ml的濃縮洗滌液和225ml的超純水充分混合配成而成。注意：如果濃縮液中含有結(jié)晶，在使用之前必須將它融化，應(yīng)將該液溫水浴30分鐘以上。樣品準(zhǔn)備新鮮的、冷藏(4℃少于8天)的、冰凍的血清或血漿都可以用于檢測。操作步驟1.在使用時，所有的試劑盒組分都必須恢復(fù)到室溫18-25℃。使用前應(yīng)將各組分放置于室溫至少一小時。2.分別將50μl樣品稀釋液加入每個檢測孔和對照孔中。3.分別將50μl的陽性對照和陰性對照加入相應(yīng)的對照孔中，注意不同對照的吸頭要更換，以防污染。4.分別將50μl的被檢樣品加入剩下的檢測孔中，注意不同檢樣的吸頭要分開，以防污染。5.輕彈微量反應(yīng)板或用振蕩器振蕩，將反應(yīng)板中的溶液混勻。6.將微量反應(yīng)板用封條封閉或于濕箱中(18-25℃)孵育2小時，也可以將微量反應(yīng)板用封條封閉或于濕箱中孵育過夜。7.吸出反應(yīng)孔中的液體，并用稀釋好的洗滌液洗滌3次，注意每次洗滌時都要將洗滌液加滿反應(yīng)孔，棄去反應(yīng)孔中的洗滌液并拍干反應(yīng)板。也可以用洗板機(jī)洗滌3次，每個反應(yīng)孔應(yīng)加300μl左右的洗滌液。注意洗板時要小心，以免樣本之間的交叉污染。8.分別將100μl的抗-csfv酶標(biāo)二抗(即取即用)加入反應(yīng)孔中，用封條封閉反應(yīng)板并于室溫下或濕箱中孵育30分鐘。9.洗板(見6)后，分別將100μl的底物溶液加入反應(yīng)孔中，并于避光、室溫條件下放置10分鐘。加完第一孔后即可計時。10.在每個反應(yīng)孔中加入100μl的終止液終止反應(yīng)。注意要按加酶標(biāo)二抗的順序加終止液。11.在450nm處測定樣本以及對照的吸光度值，也可用雙波長(450nm和620nm)測定樣本以及對照的吸光度值，空氣調(diào)零。12.計算樣本和對照的平均吸光度值(見計算)。計算方法計算被檢樣本的平均值od450(＝odtest)、陽性對照的平均值(＝odpos)、陰性對照的平均值(＝odneg)。根據(jù)以下公式計算被檢樣本和陽性對照的阻斷率；(陽性對照阻斷率以同樣方法計算)阻斷率＝(odneg-odtest)/odneg×100％試驗有效性陰性對照的平均od450應(yīng)大于0.50。陽性對照的阻斷率應(yīng)大于50％。結(jié)果判定如果被檢樣本的阻斷率大于或等于40％，該樣本就可以被判為陽性(有csfv抗體存在)。如果被檢樣本的阻斷率小于或等于30％，該樣本就可以被判為陰性(無抗csfv抗體存在)。如果被檢樣本的阻斷率在30-40％之間，就應(yīng)在數(shù)日后再對該動物進(jìn)行重測，檢測結(jié)果見表h。表h結(jié)果判定注：a-1至a-20為對照組的20只豬的編號。b-1至b-20為試驗組的20只豬的編號。通過對試驗組豬的疫苗接種后的抗體滴度跟蹤，珠蛋白肽組的抗體比對照組高至少2個滴度評分。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁12