本申請是以下申請的分案申請：申請日2010年2月24日，申請?zhí)?01080010073.9，發(fā)明名稱“通過選擇性酶促酯交換生產(chǎn)蓖麻油酸酯的方法”。一般說來，本發(fā)明涉及油酯化學(xué)(oleochemistry)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及從純的或混合的植物油，特別地蓖麻油，制備蓖麻油酸酯的方法，所述方法至少包括酶促酯交換的一個步驟，該步驟在輕質(zhì)醇的存在下和通過類型選擇性(typoselective)脂肪酶進(jìn)行，并且產(chǎn)生富集蓖麻油酸酯的級分。
背景技術(shù)：
：：脂肪酸酯通常是在催化劑，特別地酸或堿催化劑的存在下通過精制植物油的化學(xué)酯交換獲得的。產(chǎn)生脂肪酸酯的這種路線使以良好的收率獲得所述酯成為可能；然而它具有許多缺點(diǎn)，特別地與需要除去所用的催化劑，難以回收甘油和高能量消耗有關(guān)的缺點(diǎn)。這類方法仍然是費(fèi)力的，因?yàn)樗ㄔS多物理化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟，這導(dǎo)致由此產(chǎn)生的脂肪酸酯的高成本。此外，對于脂肪酸的類型來說，所用的酸或堿催化劑不是選擇性的，并且將全部脂肪酸鏈酯交換，產(chǎn)生酯的混合物。然而，將具有較接近的物理性能的各種脂肪酸酯分離是非常困難的。另外，這類方法沒有使從通過酯交換反應(yīng)獲得的脂肪酸酯的混合物選擇性提取官能化的、特別地羥基化的脂肪酸酯成為可能。因此令人期望的是獲得富集羥基化的脂肪酸酯的級分，其包含例如蓖麻油酸甲酯(或12-羥基-順-9-十八烯酸甲酯)，因?yàn)檫@樣的級分是在生產(chǎn)11-氨基十一烷酸(rilsan?11的組成單體，其是由申請人開發(fā)的具有優(yōu)異的物理性能的聚酰胺)中的起點(diǎn)。在生產(chǎn)11-氨基十一烷酸期間，蓖麻油酸甲酯經(jīng)受氣相熱裂化。為此，它必須包含最低量的甘油酯，即甘油三、二和單酯，因?yàn)檫@些產(chǎn)品非常難以汽化，并且常常在汽化前分解，這導(dǎo)致裂化選擇性降低。同樣，蓖麻油酸甲酯必須包含最低量的蓖麻油酸，其同樣難以汽化。根據(jù)上述內(nèi)容，申請人本身設(shè)定了發(fā)現(xiàn)一種用于含蓖麻油酸的植物油的酯交換的方法的目的，該方法解決了已知酯交換方法的上述缺點(diǎn)并且使獲得富集蓖麻油酸酯的級分成為可能。在脂肪酶的存在下酯化或水解植物油中所含的甘油三酯的方法是眾所周知的。這些酶具有若干優(yōu)點(diǎn)：它們不需要輔助因素，常常是市售可得的并且具有高活性和高選擇性，甚至是在非水性體系中。甘油的酯或甘油三酯是它們的天然底物。這些脂肪酶中的一些顯示出位置特異性（spécificitédeposition）(或區(qū)域選擇性（régioséléctivité）)，這使得它們在中心位置(sn-2)和甘油的兩個外部位置(sn-1和sn-3)之間區(qū)分。然而，這種特異性可以在存在于蓖麻油中的蓖麻油酸(ar)的情況下僅僅以收率損失為代價(jià)被利用，因?yàn)楹笳咧饕蒩r殘基構(gòu)成(85至90wt%)，存在的其它脂肪酸殘基特別地是油酸，亞油酸，硬脂酸，棕櫚酸和亞麻酸的那些。蓖麻油酸優(yōu)選地占據(jù)外部位置，但也可能在內(nèi)部位置中被發(fā)現(xiàn)。此外，文獻(xiàn)沒有描述在酯交換反應(yīng)中對ar特異性的任何脂肪酶。甚至從蓖麻油植物提取的脂肪酶，在水解反應(yīng)期間其顯示出對于ar的優(yōu)先性，沒有顯示出與此相關(guān)的類型選擇性(typoselectivity)。其它脂肪酶相對于脂肪酸的性質(zhì)顯示出類型選擇性(typoselectivity)或特異性。因此已知在酯化或水解反應(yīng)中，從白地霉(geotrichumcandidum)提取的脂肪酶，類酵母真菌(ayeast-likefungus)，顯示出對順-9單不飽和的脂肪酸的強(qiáng)特異性。文件de4124248描述了從白地霉提取的胞外脂肪酶用于特別地?cái)嚅_油酸酯(ch3(ch2)7ch=ch(ch2)7cooh)的用途。文件us5633151描述了相同的脂肪酶用于特別地?cái)嚅_芥酸酯(ch3(ch2)7ch=ch(ch2)11cooh)的用途。fogliat.a.等的出版物,eur.jlipidsci.technol.102(2000):612-617描述了用于測定某些脂肪酶對植物來源的脂肪酸的選擇性的測試結(jié)果。表1中所示的結(jié)果表明在借助于商業(yè)固定的脂肪酶(commercialimmobilizedlipase)的在30℃進(jìn)行1至4小時(shí)的蓖麻油部分水解反應(yīng)期間，白地霉脂肪酶是對蓖麻油酸(以下由ar表示)有認(rèn)別性的。此外，表2中所示的結(jié)果表明在游離脂肪酸與1-丁醇的混合物的酯化反應(yīng)期間這種酶也對ar具有認(rèn)別性。在白地霉的存在下的酯化，在24小時(shí)的反應(yīng)后，導(dǎo)致由12%的脂肪酸丁酯和88%的游離脂肪酸組成的混合物(按質(zhì)量計(jì))，ar占所述游離脂肪酸的94.5%。所述混合物因此包含大約83%的ar。在水解反應(yīng)期間相對于底物的酶的特定性能沒有使在酯交換或酯化反應(yīng)期間預(yù)見其對相同底物的性能成為可能。脂肪酶的特異性在彼此反應(yīng)類型之間不同。vayssel.等的出版物,enzymemicrob.technol.31(2002):648-655通過表1和2中所示的結(jié)果顯示，在水解，酯交換和酯化反應(yīng)期間相同脂肪酶可以分別地對相同脂肪酸酯或游離脂肪酸具有不同的性能。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：申請人已經(jīng)進(jìn)行研究，目的在于確定在蓖麻油酯交換反應(yīng)期間白地霉脂肪酶對存在于蓖麻油中的脂肪酸，特別地蓖麻油酸(ch3(ch2)5ch(oh)ch2ch=ch(ch2)7cooh)的作用。這些研究已經(jīng)表明，令人驚訝地，所述脂肪酶在輕質(zhì)醇的存在下在酯交換反應(yīng)中對ar具有認(rèn)別性。本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種酯交換的方法，其允許蓖麻油酸酯的生物選擇性提取，并且因此從蓖麻油或任何其它含ar殘基的油中產(chǎn)生富集這種酯(包含多于85wt%的酯)的級分。為此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種用于從含蓖麻油酸的植物油，特別地蓖麻油中生產(chǎn)蓖麻油酸酯的方法，包括以下步驟：i)在輕質(zhì)醇(alcoolléger)和從白地霉提取的脂肪酶的存在下進(jìn)行的第一酯交換反應(yīng)，產(chǎn)生含ar甘油單、二和三酯、非ar的脂肪酸的酯、和醇的混合物m；ii)將所述混合物m分離為至少兩種級分的轉(zhuǎn)化步驟，包括富含ar甘油酯的級分a和富含非ar的脂肪酸的酯的級分b；iii)將所述ar甘油酯轉(zhuǎn)化為ar酯的步驟，形成富集ar酯的級分c和富集醇的級分。有利地，所述脂肪酶選擇性地?cái)嚅_涉及非ar的脂肪酸，特別地油酸和亞油酸的酯鍵，并且?guī)缀趿粝峦暾纳婕癮r殘基的?；I。實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法使獲得特別富集蓖麻油酸酯的級分c成為可能。因此，根據(jù)第二方面，本發(fā)明涉及富集ar酯的級分，當(dāng)原材料是純蓖麻油時(shí)，其含至少91wt%，并且優(yōu)選地94至98wt%，的蓖麻油酸甲酯。這樣的級分非常有利地適于用作合成中間化學(xué)產(chǎn)品如11-氨基十一烷酸的原材料。根據(jù)另一實(shí)施方案，實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法使獲得富集蓖麻油酸酯的級分c成為可能。因此，根據(jù)第三方面，當(dāng)原材料是具有低蓖麻油酸含量的油時(shí)，如下文限定的，根據(jù)本發(fā)明的方法使獲得含至少75wt%并且優(yōu)選地82至91wt%的蓖麻油酸甲酯的富集ar酯的級分成為可能。這樣的級分特別適合用作合成中間化學(xué)產(chǎn)品如11-氨基十一烷酸的原材料，因?yàn)樗缓缶哂邢喈?dāng)于常規(guī)蓖麻油的蓖麻油酸含量。附圖說明其它特性和優(yōu)點(diǎn)將從隨后的根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)蓖麻油酸酯的方法的詳細(xì)說明和所附的圖1至10顯露出來，圖1至10是：-圖1舉例說明了以游離形式和各種商用脂肪酶的形式用白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶獲得的在甲醇的存在下在酯交換反應(yīng)中乙酯轉(zhuǎn)化至甲酯的轉(zhuǎn)化率。-圖2顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的酯交換反應(yīng)期間在蓖麻油中的最初以甘油酯的形式的蓖麻油?；?ricinoleoyl)，亞油?；?linoleoyl)和油?；?oleoyl)基團(tuán)轉(zhuǎn)化為甲酯或相應(yīng)脂肪酸的動力學(xué)；-圖3舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的蓖麻油的酯交換期間偏甘油酯（partialglycerides）級分的ar濃度的變化；-圖4顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w(按重量計(jì))蓖麻油/三亞油精（castoroil/trilinolein）混合物的酯交換反應(yīng)期間亞油酰基(linoleoyl)基團(tuán)和?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)化為甲酯的動力學(xué)的比較；-圖5舉例說明了[ar/(ar+al)]和[mear/(mear+meal)]比例的變化，其代表了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換反應(yīng)期間白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對蓖麻油?；?ricinoleoyl)基團(tuán)的識別力和其對于亞油?；?linoleoyl)基團(tuán)的選擇性；-圖6表示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換期間偏甘油酯級分中ar濃度的變化；-圖7舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換反應(yīng)期間亞油?；?linoleoyl)基團(tuán)和?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)化為甲酯的動力學(xué)的比較；-圖8舉例說明了[ar/(ar+al)]和[mear/((mear+meal))]比例的變化，其代表了在甲醇的存在下90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換反應(yīng)期間白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基團(tuán)的識別力和其對于亞油?；?linoleoyl)基團(tuán)的選擇性；-圖9顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換期間偏甘油酯級分的ar濃度的變化；-圖10顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的固定的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換反應(yīng)期間最初以甘油酯的形式的蓖麻油?；?ricinoleoyl)和亞油?；?linoleoyl)基團(tuán)轉(zhuǎn)化為甲酯或相應(yīng)的脂肪酸的動力學(xué)。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及與化學(xué)或酶促酯交換的方法聯(lián)系的含蓖麻油酸（acidericinoléique）的植物油的酶促酯交換的方法，以便產(chǎn)生富集蓖麻油酸酯的級分。特征上，該方法使用了一種酶，其顯示出對蓖麻油酸的"抗"-選擇性(也稱為識別力（discrimination）)，即其優(yōu)選地對鏈而不是蓖麻油酸進(jìn)行酯交換。這種效果特別地顯示在非蓖麻油的蓖麻油酸的兩個主要的脂肪酸上：油酸和亞油酸。本發(fā)明的酶促酯交換的方法特別合適于"具有低含量"的蓖麻油酸，即包含小于82wt%的蓖麻油酸的油。這種情況是具有低蓖麻油酸含量的蓖麻油的情況，或者包括蓖麻油及來源于至少一種其它產(chǎn)油的（oleaginous）、產(chǎn)油的/產(chǎn)蛋白的（oleaginous/protein-producing）或產(chǎn)蛋白（protein-producing）的植物的其他植物油的混合物的情況，所述混合物包含至少10wt%的蓖麻油酸，或者來源于單獨(dú)地產(chǎn)生蓖麻油酸的基因修飾植物或來源于產(chǎn)生蓖麻油酸的基因修飾植物與任選地被基因修飾的產(chǎn)油的植物的混合物并且包含至少10wt%的蓖麻油酸的油的情況。參考pilarrijas-barros等在cropscience44(2004):76-80,and45(2005):157-162中的出版物，表述"具有低蓖麻油酸含量的蓖麻油"還被理解為是指來源于突變株如ole-1的油，其描述于這些出版物中并且產(chǎn)生含約10%的蓖麻油酸的油。參考k.m.hosamani在chemistryandphysicsoflipids,152(2008)9-12中的文章，表述"具有低蓖麻油酸含量的油"還被理解為是指橡膠樹(heveabrasiliensis)和棉葉麻風(fēng)樹(jatrophagosypiifolia)的油，其中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蓖麻油酸的含量為大約18%。參考同一作者在phytochemistry,vol.37,no.6,pp.1621-1624，1994中發(fā)表的另一篇文章，所述表述還被理解為是指斯里蘭卡毛束草(trichodesmazeylanicum)的油，其看起來包含22%的蓖麻油酸。也可提及非洲黃果藤黃木(mammeaafricana)，其在它的果實(shí)的籽中包含20%的蓖麻油酸，以及蓮子草(alternantheratriandra)syn.a.無柄籽(sessilisseed)的油，其包含大約22%的蓖麻油酸(k.m.hosamanietal.,industrialcropsandproducts,2004,19(2),133-136)。因此，表述"含蓖麻油酸的植物油"，在本發(fā)明的范圍中，覆蓋了蓖麻油以及全部這些上述的油和油混合物?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從白地霉微生物提取的胞外的脂肪酶在輕質(zhì)醇的存在下進(jìn)行的含蓖麻油酸的植物油的酯交換反應(yīng)期間相對于非蓖麻油酸的在順-9位單不飽和的脂肪酸有選擇性。根據(jù)第一方面，本發(fā)明的主題是從含蓖麻油酸的植物油，特別地蓖麻油產(chǎn)生蓖麻油酸酯的方法，包括以下步驟：i)在輕質(zhì)醇和從白地霉菌株提取的類型選擇性(typoselective)脂肪酶的存在下進(jìn)行的第一酶促酯交換反應(yīng)，產(chǎn)生含ar甘油單、二和三酯、非ar的脂肪酸的酯、和醇的混合物m；ii)將所述混合物m分離為至少兩種級分的步驟，包括富含ar甘油酯的級分a，和富含非ar的脂肪酸的酯的級分b；iii)將級分a中所含的所述ar甘油酯轉(zhuǎn)化為ar酯的步驟，以便形成富集ar酯的級分c和富集醇的級分。有利地，在步驟i)期間，酯交換反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間是至多1小時(shí)，優(yōu)選地至多30分鐘，其相應(yīng)于在混合物m的偏甘油酯級分中，相對于其它脂肪酸的至少90wt%的ar的含量。根據(jù)第一實(shí)施方案，酯交換方法的步驟iii)由以下構(gòu)成：在堿性催化劑如氫氧化鈉的存在下在包括ar甘油酯和醇的相上進(jìn)行的化學(xué)酯交換反應(yīng)，以便獲得富集ar酯的所述級分c。根據(jù)第二種實(shí)施方案，步驟iii)由以下構(gòu)成：在輕質(zhì)醇和例如選自南極假絲酵母b（candidaantarcticab)(特別地固定形式的n.435?，novonordisk)，米黑根毛霉(rhizomucormiehei)(特別地固定形式的rm?im，novozymes)，thermomyceslanuginosa(特別地固定形式的tl?im，novozymes)，洋蔥假單胞菌（pseudomonascepacia），黑曲霉（aspergillusniger），米根霉（rhizopusoryzae），少根根霉（rhizopusarrhizu），皺褶假絲酵母（candidarugosa），爪哇毛霉(mucorjavanicus)，豬胰脂肪酶（porcinepancreaticlipase）和產(chǎn)生富集ar酯的所述級分c的任何其它脂肪酶的脂肪酶的存在下進(jìn)行的第二酶促酯交換反應(yīng)。所用的輕質(zhì)醇是低級脂族醇如甲醇，乙醇，異丙醇和正丙醇，和優(yōu)選地是甲醇。在步驟i)中的底物/醇比例為1:4.5至1:0.75，在一次或多次添加中添加所述醇。假定蓖麻油的組成(見實(shí)施例1)，非ar的脂肪酸的最主要的酯是油酸酯和亞油酸酯。分離蓖麻油酸甘油酯/油酸的甲酯/亞油酸的甲酯的混合物的步驟ii)包括至少一種選自以下的操作：蒸餾，離心，潷析，用非極性有機(jī)溶劑如己烷或石油醚的液-液萃取，和通過選擇吸附的色譜分離。白地霉是dipodascaceae科的endomycete，其具有接近于絲狀真菌的形態(tài)。其野生廣泛分布并且在許多食物，包括乳制品中被發(fā)現(xiàn)。它也是人和動物中的消化道的腐生菌。表述"從白地霉提取的脂肪酶"意圖在本文中是指根據(jù)例如在文件de4124248中描述的規(guī)程從這種酵母中提取的胞外脂肪酶的粗制混合物，和通過異種表達(dá)編碼這些脂肪酶之一的白地霉基因獲得的酶。以提供良好的收率以便在工業(yè)規(guī)模上使用為目的，這種酶優(yōu)選地以固定(immobilisée)形式用于本發(fā)明的范圍中。在酯交換階段期間使用白地霉的脂肪酶的條件是以下的：-溫度20至40℃，優(yōu)選地大約30℃；-脂肪酶/底物比例大于或等于0.5%；-充分?jǐn)嚢枰员懔己玫木g歇類型的反應(yīng)介質(zhì)，或者足夠的流速以便最佳的接觸時(shí)間(催化床)；-大氣壓或更高，這取決于所進(jìn)行的方法。在低溫和接近于大氣壓力的壓力下進(jìn)行該方法。停留時(shí)間也是受限制的，因?yàn)椴灰鈭D將全部脂肪族鏈轉(zhuǎn)化，而僅僅是存在的雜質(zhì)(非蓖麻油酸的脂肪酸)。在一個實(shí)施方案變化中，含源于根據(jù)本發(fā)明方法的蓖麻油酸酯的級分c可以有利地直接用于合成11-氨基十一烷酸。當(dāng)蓖麻油酸酯不是足夠純的，另外的提純步驟可能是必需的，然后使其經(jīng)受熱解反應(yīng)。這樣獲得的11-氨基十一烷酸主要地意圖于根據(jù)以下系列反應(yīng)通過聚酰胺11或rilsan?11的縮合來合成：-裂解或裂化蓖麻油酸酯，特別地甲酯，產(chǎn)生庚醛和十一碳烯酸甲酯；-十一碳烯酸甲酯的水解，產(chǎn)生十一烯酸；-十一烯酸的溴氫化，產(chǎn)生11-溴十一烷酸，和-11-溴十一烷酸的胺化，產(chǎn)生11-氨基十一烷酸。根據(jù)一種實(shí)施方案變化，富集非ar的脂肪酸的酯的級分b經(jīng)受一系列的化學(xué)和/或物理反應(yīng)，產(chǎn)生生物柴油。在這種情況下，脂肪酸酯可以通過各種另外的分離技術(shù)經(jīng)受分離反應(yīng)，例如通過蒸餾，包括分子蒸餾，通過液-液萃取(在甲醇/己烷介質(zhì)中的逆流色譜)或通過模擬移動床色譜分離。當(dāng)閱讀以下非限制性示范性實(shí)施方案后，本發(fā)明將更清楚地被理解。1.蓖麻油的脂肪酸組成分析來源于印度的蓖麻油的樣品其的脂肪酸組成。為該測定，根據(jù)包括兩個相繼步驟的程序，將油轉(zhuǎn)化為甲酯：堿性甲醇醇解，隨后酸性酯化。在第一步驟中，甘油酯(甘油單、二和三酯)通過甲醇鈉的作用，被轉(zhuǎn)化為甲酯，游離脂肪酸，其可能存在，被轉(zhuǎn)化為皂。在第二步驟期間，添加乙酰氯的甲醇溶液導(dǎo)致這些皂轉(zhuǎn)化為甲酯。然后通過氣相色譜法(agilent6890系列g(shù)c，裝備有火焰電離檢測器-fid)分析這樣獲得的甲酯。在supelcowax10柱(agilenttechnologies，30m×0.32mm×0.25μm；載體氣體：1ml/分鐘的氦；最初的烘箱溫度150℃，5℃/分鐘的溫度程序直至225℃并且在這一溫度保持7分鐘)上進(jìn)行分離。通過這種技術(shù)識別的主要的脂肪酸是：-蓖麻油酸86.0wt%；-亞油酸5.3wt%；-油酸4.1wt%；-硬脂酸1.5wt%；-棕櫚酸1.3wt%。2.生產(chǎn)白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶使用文件de4124248中描述的操作規(guī)程獲得來源于這種酵母的胞外脂肪酶的粗制提取物。此外，利用重組技術(shù)通過巴斯德畢赤氏酵母(yeastpichiapastoris)的發(fā)酵也獲得脂肪酶。因此，在30小時(shí)的發(fā)酵后，收集含胞外脂肪酶的發(fā)酵上清液。在這個階段，上清液特征在于蛋白質(zhì)濃度為2.46mg/ml并且對油酸乙酯測量的特定的水解活性(30℃)為90u/毫升(其中u=1μmol的水解的乙酯/每分鐘，在30℃，ph6.5)。然后，上清液經(jīng)受一系列過濾，目的在于使其澄清并且將其濃縮，而沒有影響脂肪酶的特定活性，其包含：i)膜微量過濾(中止閾值5μm然后0.45μm)，膜超濾，目的在于將上清液濃縮14倍，然后用50mm磷酸鈉緩沖溶液(ph6.5)滲濾。所獲得的濃縮物的蛋白質(zhì)含量為18mg/ml，對于油酸乙酯的特定活性為522u/毫升，對于橄欖油的特定活性為900u/毫升(30℃)。脂肪酶的固定從白地霉提取的脂肪酶的混合物(或根據(jù)上述規(guī)程在發(fā)酵后獲得的濃縮物)被固定在選自以下的載體上：-微孔聚丙烯，例如accurel?mp1000型，由accurelsystems,membarnagmbh,obernburg,germany制造；-deae纖維素；-celite(硅藻土)。舉例來說，將白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶固定在accurel?mp1000上包括，在第一步驟中，物理吸附，接著在第二步驟中在戊二醛的存在下交聯(lián)。3.在甲醇的存在下在酯交換反應(yīng)中在模擬底物（modèle）上白地霉的游離類型選擇性(typoselective)脂肪酶的活性和特異性在甲醇的存在下在酯交換反應(yīng)中白地霉的游離類型選擇性(typoselective)脂肪酶的活性可與商品化酶(南極假絲酵母b，n?435，novonordisk；米根霉，fap15?,amano；r.mieihei，lipozymerl-im，novozymes；tl-im，lipozyme，novozymes)(c.antarcticab,n?435,novonordisk;r.oryzae,fap15?,amano;r.mieihei,lipozymerl-im,novozymes;tl-im,lipozyme,novozymes)的活性相比。油酸、亞油酸和蓖麻油酸的乙酯(油酸乙酯、亞油酸乙酯、蓖麻酸乙酯（ricinoléated’ethyle）)的等摩爾混合物與酶(脂肪酶/底物重量比：5%)接觸。以1.5:1的甲醇/底物摩爾比添加甲醇，并且然后在30℃培養(yǎng)混合物24小時(shí)。根據(jù)實(shí)施例1中詳述的方法，通過氣相色譜法量化所形成的甲酯。在附圖1中給出了所獲得的結(jié)果，其舉例說明用白地霉的游離類型選擇性(typoselective)脂肪酶和各種商品化脂肪酶獲得的，在甲醇的存在下在酯交換反應(yīng)中乙酯至甲酯的轉(zhuǎn)化率(24小時(shí)，30℃，3份相同樣品，脂肪酶/底物比例=1.5%w/w，甲醇/底物摩爾比=1.5:1)。無論酶如何，對于油酸乙酯和亞油酸乙酯來說，獲得了40%至50%的轉(zhuǎn)化率。對于蓖麻酸乙酯，僅僅白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶產(chǎn)生了小于40%的轉(zhuǎn)化，值為2%至5%。這些結(jié)果表明白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對油?；蛠営王；?linolenoyl)基團(tuán)的作用的非常強(qiáng)的選擇性，并且因此，對蓖麻油?；?ricinoleoyl)基團(tuán)的識別力的非常強(qiáng)的選擇性。4.在甲醇的存在下在酯交換反應(yīng)中在蓖麻油上白地霉的游離類型選擇性(typoselective)脂肪酶的活性和特異性在分子篩(3埃，perlform，直徑2mm)的存在下，其數(shù)量為10%w/w的底物(蓖麻油)，在大氣壓力，在30℃，進(jìn)行甲醇醇解反應(yīng)。將白地霉類型選擇性(typoselective)脂肪酶濃縮物蛋白/底物比例調(diào)節(jié)到1.5%w/w并且在反應(yīng)的0、2和4小時(shí)在3次順序添加中建立4.5:1的甲醇/蓖麻油甘油三酯摩爾比。通過渦旋(10秒)均化整個反應(yīng)介質(zhì)。在各個時(shí)間，從反應(yīng)介質(zhì)中取出等分試樣，并且在丙酮/乙腈(1:1v/v)中稀釋，然后通過以下所述的色譜技術(shù)進(jìn)行分析。有可能通過薄層色譜法(tlc)和高效液相色譜法(hplc)表征酯交換反應(yīng)動力學(xué)。更具體地說，tlc使顯現(xiàn)所形成的脂質(zhì)實(shí)體的類型成為可能，同時(shí)在標(biāo)定曲線確定后通過hplc可以量化這些實(shí)體中的一些。通過將以10mg/ml溶解在丙酮/乙腈(50/50v/v)中的樣品沉積到預(yù)涂有二氧化硅的玻璃板(100×200mm，sig60，merck)上，進(jìn)行tlc分離。用自動沉積設(shè)備(linomativ,camag)進(jìn)行沉積(10μl)。在用由己烷/二乙醚/乙酸(40:60:1v/v)構(gòu)成的流動相洗脫后，通過用硫酸銅的飽和溶液和磷酸(50:50v/v)噴霧和培養(yǎng)(10分鐘，180℃)顯示所存在的實(shí)體。通過與標(biāo)準(zhǔn)化合物的比較，確定以下表i中給出的保持系數(shù)。脂質(zhì)種類保持系數(shù)*單蓖麻油酸甘油酯0.02非羥基化的甘油單酯0.07二蓖麻油酸甘油酯0.13單羥基化的甘油二酯(1,2)0.17單羥基化的甘油二酯(1,3)0.22三蓖麻精(rrr)0.36蓖麻油酸(ar)0.42二羥基化的甘油三酯0.47蓖麻醇酸甲酯0.58非羥基化的脂肪酸0.65單羥基化的甘油三酯0.69其它酯0.95*保持系數(shù)=實(shí)體遷移距離/溶劑前沿遷移距離tablei。使用基于泵(p1000xr)、樣品轉(zhuǎn)換器(as1000)和光散射檢測器(alltech500elsd)的自動系統(tǒng)(thermo-finningan,courtaboeuf,farnce)進(jìn)行通過hplc的產(chǎn)品分離。使用串聯(lián)安裝的兩個interchimc18柱(5μm;4.6×250mm,modulocartqs,lichrosphere500ds2)用于分離。根據(jù)丙酮/乙腈/甲酸(70:30:1，v/v；x)和氯仿(y)的混合物的梯度洗脫樣品(1mg/ml)。根據(jù)以下線性梯度以1ml/min的流速進(jìn)行洗脫：0分鐘100%x，30分鐘90%x，50分鐘90%x，在5分鐘的過程中回到初始條件并且保持這些條件另外的15分鐘。在以下表ii中給出了根據(jù)上述規(guī)程通過hplc分析的主要實(shí)體的停留時(shí)間。在甲醇的存在下在酯交換期間獲得的產(chǎn)品基本上是蓖麻油酸(ar)，亞油酸(al)，油酸(ao)和相應(yīng)甲酯，蓖麻醇酸甲酯(mear)，亞油酸甲酸(meal)和油酸甲酯(meao)。所分析的實(shí)體停留時(shí)間(分鐘)蓖麻油酸7.2蓖麻醇酸甲酯8.1單蓖麻油酸甘油酯9.3亞油酸9.5二蓖麻油酸甘油酯11.5亞油酸甲酸11.8油酸12.3油酸甲酯14.6三蓖麻精19.8三亞油精22.6表ii。在圖2中舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的酯交換反應(yīng)期間在蓖麻油中的最初以甘油酯的形式存在的蓖麻油?；?ricpresentinoleoyl)，亞油?；?lpresentinoleoyl)和油酰基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為甲酯或相應(yīng)脂肪酸的動力學(xué)(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質(zhì)/底物比例=1.5%w/w，在t=0，2和4小時(shí)的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比=4.5:1)。蓖麻油酰基(ricinoleoyl)，亞油酰基(linoleoyl)和油?；鶊F(tuán)(最初在蓖麻油中酯化)轉(zhuǎn)化為脂肪酸和甲酯導(dǎo)致偏甘油酯級分的出現(xiàn)，其中ar含量在反應(yīng)0.5至2小時(shí)的時(shí)候處于其最大值。附圖3舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的蓖麻油的酯交換期間偏甘油酯級分的ar濃度的變化(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質(zhì)/底物比例=1.5%w/w，在t=0，2和4小時(shí)的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比=4.5:1)。5.在甲醇的存在下在酯交換反應(yīng)中在混合物中的蓖麻油上白地霉的游離類型選擇性(typoselective)脂肪酶的活性和特異性在以下全部實(shí)施例中，在類似于實(shí)施例3中所述的條件下，進(jìn)行甲醇醇解反應(yīng)。5.1蓖麻油/三亞油精50/50w/w附圖4顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的在50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物上進(jìn)行的酯交換反應(yīng)期間亞油酰基(linoleoyl)基團(tuán)和酰基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為甲酯的動力學(xué)的比較(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質(zhì)/底物比例=1.5%w/w，在t=0，2和4小時(shí)的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)。在6小時(shí)的反應(yīng)中達(dá)到了最初在油混合物中酯化的亞油?；?linoleoyl)基團(tuán)的80%的轉(zhuǎn)化率。在反應(yīng)產(chǎn)品中蓖麻油?；?ricinoleoyl)基團(tuán)與全部蓖麻油酰基(ricinoleoyl)和亞油?；?linoleoyl)基團(tuán)的比例表征了脂肪酶對蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基團(tuán)的識別力，并且相反地，其對亞油酰基(linoleoyl)基團(tuán)的選擇性。與這種甲醇醇解反應(yīng)平行，由脂肪酶濃縮物提供的水分子導(dǎo)致通過水解反應(yīng)形成游離脂肪酸(ar，al)。這種識別力在甲醇醇解反應(yīng)中大于在水解反應(yīng)中，如附圖5中所表示的。該圖舉例說明了[ar/(ar+al)]和[mear/((mear+meal))]比例的變化，其代表了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的在50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物上進(jìn)行的酯交換反應(yīng)期間白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對蓖麻油?；?ricinoleoyl)基團(tuán)的識別力和其對于亞油酰基(linoleoyl)基團(tuán)的選擇性(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質(zhì)/底物比例為1.5%w/w，在t=0，2和4小時(shí)的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)。最后，這種識別力導(dǎo)致在6小時(shí)的反應(yīng)后將最初的35%的ar濃度(在起始油混合物中以甘油酯的形式的ar)富集為反應(yīng)介質(zhì)的偏甘油酯級分中的多于77%，如在附圖6中所表示的，其舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換期間偏甘油酯級分的ar濃度的變化(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質(zhì)/底物比例為1.5%w/w，在t=0，2和4小時(shí)的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)。5.2蓖麻油/三亞油精10/90w/w比較在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的在90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物上進(jìn)行的酯交換反應(yīng)期間亞油?；?linoleoyl)基團(tuán)和酰基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為甲酯的動力學(xué)(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質(zhì)/底物比例為1.5%w/w，在t=0，2和4小時(shí)的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)，并且所獲得的結(jié)果示于附圖7中。圖8顯示了[ar/(ar+al)]和[mear/((mear+meal))]比例的變化，其代表了在甲醇的存在下在90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物上進(jìn)行的酯交換反應(yīng)期間白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對蓖麻油酰基(ricinoleoyl)基團(tuán)的識別力和其對于亞油?；?linoleoyl)基團(tuán)的選擇性(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質(zhì)/底物比例為1.5%w/w，在t=0，2和4小時(shí)的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)。圖9顯示了在甲醇的存在下通過白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的90:10w/w蓖麻油/三亞油精混合物的酯交換期間偏甘油酯級分的ar濃度的變化(30℃，3份相同樣品，脂肪酶提取蛋白質(zhì)/底物比例為1.5%w/w，在t=0，2和4小時(shí)的三次分別添加過程中甲醇/甘油三酯摩爾比為4.5:1)。5.3蓖麻油/亞麻子油50/50w/w以與蓖麻油的混合物形式使用的亞麻子油由主要地包括亞油酰基(linolenoyl)(45%)，亞油酰基(linoleoyl)(25%)和油?；?19%)基團(tuán)的甘油酯組成。在類似于實(shí)施例3中所述的反應(yīng)條件下，在2小時(shí)后達(dá)到17%的這些?；良柞サ目傓D(zhuǎn)化率。于是，甲酯級分中蓖麻醇酸甲酯(mear)的水平是6%。這些結(jié)果表明白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶對亞油酰基(linolenoyl)基團(tuán)的選擇性類似于對亞油?；?linoleoyl)基團(tuán)的選擇性。5.4蓖麻油/亞麻子油10/90w/w在類似于實(shí)施例3中所述的反應(yīng)條件下，在2小時(shí)后達(dá)到12%的這些?；良柞サ目傓D(zhuǎn)化率。然后，甲酯級分中蓖麻醇酸甲酯(mear)的水平是2%。6.在甲醇的存在下在酯交換反應(yīng)中在混合物中的蓖麻油上白地霉的固定類型選擇性(typoselective)脂肪酶的活性和特異性在甲醇的存在下在50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物上在酯交換反應(yīng)中(30℃，3份相同樣品，酶/底物比例為1.5%w/w，甲醇/甘油三酯摩爾比為1.5:1)測試固定在accurel?mp1000載體上的白地霉的類型選擇性(typoselective)脂肪酶。圖10舉例說明了在甲醇的存在下通過白地霉的固定的類型選擇性(typoselective)脂肪酶催化的在50:50w/w蓖麻油/三亞油精混合物上進(jìn)行的酯交換反應(yīng)期間(30℃，3份相同樣品，酶/底物比例為1.5%w/w，甲醇/甘油三酯摩爾比為1.5:1)最初以甘油酯的形式的蓖麻油?；?ricinoleoyl)和亞油酰基(linoleoyl)基團(tuán)轉(zhuǎn)化為甲酯或相應(yīng)的脂肪酸的動力學(xué)。這些結(jié)果表明固定的脂肪酶保持了其對亞油酰基(linoleoyl)基團(tuán)的非常強(qiáng)的選擇性，盡管它的活性顯著地下降。固定的酶的水合(aw=0.96)導(dǎo)致水解反應(yīng)并且與甲酯一起出現(xiàn)游離脂肪酸。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12