本發(fā)明涉及植物中有效成分的制備方法，具體設(shè)計(jì)羥基酪醇的提取制備方法。
背景技術(shù)：
3,4-二羥基苯乙醇（羥基酪醇）的分子式維C8H10O3，結(jié)構(gòu)式
是一種天然的多酚類化合物，它主要是以酯化物橄欖苦甙的形式存在于橄欖的各個(gè)部位，橄欖苦甙經(jīng)過水解后可得到游離的羥基酪醇。研究發(fā)現(xiàn)羥基酪醇具有很多有益于人體健康的生物藥理活性，近年來深受生物和醫(yī)學(xué)界的重視。
羥基酪醇在橄欖中主要是以橄欖苦甙的形式存在，橄欖苦甙在橄欖各個(gè)部位都占有相當(dāng)?shù)谋壤?，在干燥的橄欖葉子中占6%~9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，也是橄欖果實(shí)具有強(qiáng)烈?guī)煳坏脑?。在橄欖油加工過程中，為出去橄欖油中的酸澀味道，水解橄欖苦甙后得到多酚類化合物，羥基酪醇是這些酚類混合物的主要成分。目前羥基酪醇主要是從橄欖果、葉以及在制備橄欖油過程中產(chǎn)生的殘?jiān)蛷U水中分離出來的。而羥基酪醇的純化主要采用色譜分離的方法，如硅膠柱、離子交換柱。如公開號(hào)為CN1665764的發(fā)明專利，公開了一種制備富含羥基酪醇的組合物的方法，包括①用橄欖制備植物液；②將酸加入植物液中，由此制得算話的植物液；③將酸化的植物液培養(yǎng)一段時(shí)間直至植物液中原先存在的油橄欖苦甙（環(huán)烯醚萜類葡糖苷油橄欖苦甙）有至少50%轉(zhuǎn)化成羥基酪醇，其中所說的一段時(shí)間至少為2個(gè)月，通常為2~12個(gè)月。雖然該方法可以使植物液中原先存在的油橄欖苦甙的90%轉(zhuǎn)化為羥基酪醇，但完成這一轉(zhuǎn)化需要花費(fèi)的時(shí)間太長(zhǎng)，導(dǎo)致生產(chǎn)周期長(zhǎng)，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。又如公開號(hào)為CN10129811的發(fā)明專利，公開了一種從橄欖提取物液中提取羥基酪醇的方法，包括如下步驟：①將橄欖提取液加入去離子水稀釋；②過聚乙烯類樹脂層析柱，用去離子水沖洗，棄去前300mL~500mL的流出液，然后開始收集透明洗脫液；③濃縮所述透明洗脫液，用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯層濃縮，回收乙酸乙酯，濃縮汁不能再濃縮，得淺橘黃膠狀物；④將淺橘黃膠狀物進(jìn)行分子蒸餾，得到羥基酪醇粗品。該發(fā)明所得產(chǎn)品的純度較高，也較大程度的保持了天然物的原有品質(zhì)，但該方法并沒有將橄欖提取液中油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇這一步驟，只是將提取液中單獨(dú)存在的羥基酪醇提取分離出來而已，因此該申請(qǐng)的得率比較低。公開號(hào)CN101973853的發(fā)明專利，公開了一種生產(chǎn)周期短、成本低且原料多樣化的羥基酪醇的提取方法，包括如下步驟：①玄參科、木犀科、冬青科、金絲桃科、紫草科或馬鞭草科和橄欖科橄欖屬植物為原料，制備提取液；②取上述提取液，加入濃鹽酸，煮沸2~4h水解，水解液過大孔吸附樹脂，用10~30%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，干燥，得到羥基酪醇。該發(fā)明雖然將提取液算話后通過煮沸工序?qū)崿F(xiàn)羥基酪醇的轉(zhuǎn)化，并縮短了轉(zhuǎn)化時(shí)間，但高溫煮沸破壞了羥基酪醇的分子結(jié)構(gòu)，因此是羥基酪醇的純度和得率偏低。目前的技術(shù)還不能大量的將羥基酪醇從含有不同分子量的多酚類化合物的廢水中萃取并分離出來。
羥基酪醇因其特殊的生物和藥理活性，用途十分廣泛。在食品工業(yè)中，可作為天然的防腐劑，防止食品的氧化變質(zhì)；在營養(yǎng)保健領(lǐng)域，可作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑、抗菌劑，添加到各種食品中；還可以添加到化妝品中，利用其捕捉自由基的能力，減少紫外線對(duì)皮膚的損傷作用，延緩皮膚老化。
目前國外已經(jīng)相繼有羥基酪醇的膠囊、片劑和粉末產(chǎn)品問世：Life Extension（延壽機(jī)構(gòu)）的注冊(cè)商標(biāo)產(chǎn)品為Polyphen-oilTM（顆粒）；Indena公司的產(chǎn)品為OleaselectTM（片劑）；西班牙公司的Genosa的產(chǎn)品為HytoliveTM（顆粒）；法國Seppic公司的產(chǎn)品ProlivolsTM（片劑）；CreAgri公司和荷蘭帝斯曼（DSM）公司合作開發(fā)了HIDROXTM（干粉）。除了將羥基酪醇作為一種營養(yǎng)性、功能性的物質(zhì)直接使用以外，對(duì)于其一些衍生物，如橄欖苦甙、羥基酪醇的乙?；苌铮瑤в卸嗖伙柡椭炬湹难苌锏鹊膽?yīng)用研究也不斷進(jìn)行。這對(duì)于不斷增加羥基酪醇的應(yīng)用具有很重要的促進(jìn)作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明是采用酶法耦合膜技術(shù)制備羥基酪醇的方法。采用該方法制備羥基酪醇，轉(zhuǎn)化率高、收率高。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
①制備橄欖提取液，所述原料為橄欖科橄欖屬植物的果肉、莖或葉；
②取上述任一種提取液，加入固定化糖苷酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，50~55℃水浴反應(yīng)2~4h。
③膜過濾水解液。
④濃縮，噴霧干燥，得到羥基酪醇。
在本發(fā)明所述的羥基酪醇的制備方法中，所述步驟②中加入的固定化糖苷酶，選用海藻酸鈉為載體，與戊二醛交聯(lián)后，將糖苷酶包埋成球狀固定化酶。
在本發(fā)明所述的羥基酪醇的制備方法中，所述步驟③進(jìn)一步包括使用微濾膜、超濾膜和納濾膜過濾所述提取液。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用固定化酶水解提取液，與酸水解液比較，結(jié)果表明酸水解會(huì)產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，且橄欖苦甙沒有被完全轉(zhuǎn)化；而固定化酶水解，專一性強(qiáng)，橄欖苦甙可被完全轉(zhuǎn)化為羥基酪醇，酶解條件溫和，提高了羥基酪醇的收率。此外，酶的固定化起到保護(hù)酶的作用，為酶的重復(fù)利用提供了可能。從整個(gè)制備過程中縮短了生產(chǎn)周期，節(jié)約了生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施方式
下面以實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1：
①以橄欖葉為原料，粉碎成粗粉，加入6倍重量的50%乙醇水溶液中，在多功能提取罐中進(jìn)行動(dòng)態(tài)循環(huán)提取，提取兩次，每次提取1h，獲得提取液；
②濃縮提取液，攪拌均勻進(jìn)行水沉12小時(shí)；
③將上述水沉液體板框過濾，分離獲得清亮的濾液；
④濾液中加入10U固定化酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，50℃反應(yīng)3小時(shí)；
⑤將上述水解液，加入到膜P型UF-19膜超濾裝置的料液桶中，用截留相對(duì)分子量為3萬的有機(jī)膜，進(jìn)行連續(xù)式的超濾，超濾時(shí)物料溫度控制在30℃左右，調(diào)節(jié)回流閥，控制料液出口的壓力為100PSI，收集過濾液體；
⑥濃縮至浸膏，噴霧干燥，得到羥基酪醇，純度40%，收率85%。
實(shí)施例2：
①以橄欖葉為原料，粉碎成粗粉，加入6倍重量的30%乙醇水溶液中，在多功能提取罐中進(jìn)行動(dòng)態(tài)循環(huán)提取，提取兩次，每次提取1h，獲得提取液；
②濃縮提取液，攪拌均勻進(jìn)行水沉12小時(shí)；
③將上述水沉液體板框過濾，分離獲得清亮的濾液；
④濾液中加入10U固定化酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，55℃反應(yīng)2小時(shí)；
⑤將上述水解液，加入到膜P型UF-19膜超濾裝置的料液桶中，用截留相對(duì)分子量為1萬的有機(jī)膜，進(jìn)行連續(xù)式的超濾，超濾時(shí)物料溫度控制在30℃左右，調(diào)節(jié)回流閥，控制料液出口的壓力為100PSI，收集過濾液體；
⑥濃縮至浸膏，噴霧干燥，得到羥基酪醇，純度42%，收率88%。
實(shí)施例3：
①以橄欖葉為原料，粉碎成粗粉，加入6倍重量的70%乙醇水溶液中，在多功能提取罐中進(jìn)行動(dòng)態(tài)循環(huán)提取，提取兩次，每次提取1h，獲得提取液；
②濃縮提取液，攪拌均勻進(jìn)行水沉12小時(shí)；
③將上述水沉液體板框過濾，分離獲得清亮的濾液；
④濾液中加入10U固定化酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，52℃反應(yīng)2.5小時(shí)；
⑤將上述水解液，加入到膜P型UF-19膜超濾裝置的料液桶中，用截留相對(duì)分子量為1萬的有機(jī)膜，進(jìn)行連續(xù)式的超濾，超濾時(shí)物料溫度控制在30℃左右，調(diào)節(jié)回流閥，控制料液出口的壓力為100PSI，收集過濾液體；
⑥濃縮至浸膏，噴霧干燥，得到羥基酪醇，純度45%，收率86%。