本發(fā)明生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及羥基酪醇在制備防治阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病作為老年癡呆癥的主要類型，是老年人口中發(fā)病率最高的神經(jīng)退行性疾病。其發(fā)病過程緩慢，隨著時間不斷惡化成持續(xù)性神經(jīng)功能障礙，引起諸多并發(fā)癥，確診后平均生命時間為三到九年，患者逐漸喪失身體機能，最終導(dǎo)致死亡。

目前，阿爾茨海默病的具體發(fā)病機制尚不明確，因此，新的治療阿爾茨海默病的方法是目前研究者努力研究的方向。腦內(nèi)線粒體氧化應(yīng)激出現(xiàn)在在阿爾茨海默病早期，并貫穿整個阿爾茨海默病病理過程。阿爾茨海默病病理進程產(chǎn)生淀粉樣蛋白Aβ入侵線粒體，促使線粒體產(chǎn)生超氧自由基，進而將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫，導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)生，激活JNK/MAPK信號通路，進一步引起NFkB釋放炎癥相關(guān)的白介素和細胞因子。

不健康的飲食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)搭配影響阿爾茨海默病發(fā)病進程，因此，從營養(yǎng)干預(yù)角度出發(fā)減輕阿爾茨海默病并發(fā)癥并減緩阿爾茨海默病發(fā)病進程急需重視。以橄欖為食材制造食品是地中海飲食的標志，有助于降低認知損傷及阿爾茨海默病。前期研究發(fā)現(xiàn)具有抗氧化功能的多酚類化合物羥基酪醇作為橄欖類制品的重要生物活性成分，在多種疾病模型例如肥胖、糖尿病、肌肉萎縮、產(chǎn)前應(yīng)激中顯著調(diào)控氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、及神經(jīng)毒性損傷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的問題在于提供一種羥基酪醇在制備防治阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用，穿越血腦屏障的羥基酪醇分子靶向腦內(nèi)線粒體，修復(fù)線粒體功能，以JNK/MAPK為靶點改善神經(jīng)炎癥，從而達到改善阿爾茨海默病的目的。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

羥基酪醇在制備防治阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。

所述的藥物是口服藥物，該藥物能夠穿越血腦屏障，提高腦組織中羥基酪醇含量。

所述的藥物是改善神經(jīng)功能、改善學(xué)習(xí)認知能力的藥物。

所述的藥物是改善神經(jīng)細胞線粒體功能的藥物。

所述的藥物是不影響Aβ的積累加工，逆轉(zhuǎn)腦組織的線粒體功能障礙、恢復(fù)線粒體蛋白羰基化異常的藥物。

所述的藥物是提高抗氧化損傷能力，提高SOD-2蛋白表達的藥物。

所述的藥物是改善腦內(nèi)炎性損傷的藥物。

所述的藥物是通過調(diào)控線粒體功能，靶向JNK/MAPK信號通路改善神經(jīng)炎癥信號，修復(fù)神經(jīng)功能損傷的藥物。

羥基酪醇在制備防治阿爾茨海默病的保健品、功能性食品或飲料中的應(yīng)用。

羥基酪醇在制備靶向JNK/MAPK信號通路以改善腦內(nèi)炎性損傷的藥物、保健品、功能性食品或飲料中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

羥基酪醇源于天然營養(yǎng)素，安全性高，對人體無毒副作用。地中海飲食相同日攝取劑量的羥基酪醇可穿越血腦屏障改善阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)功能；羥基酪醇顯著改善由Aβ所引起的線粒體氧化應(yīng)激，修復(fù)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)線粒體功能；通過調(diào)控線粒體功能，靶向JNK/MAPK信號通路改善神經(jīng)炎癥信號，從而達到修復(fù)阿爾茨海默病的神經(jīng)功能損傷的作用，達到改善阿爾茨海默病的目的，在防治阿爾茨海默病相關(guān)的保健食品及藥物的應(yīng)用中具有良好的前景。

附圖說明

圖1A～圖1D表示羥基酪醇穿越血腦屏障改善阿爾茲海病小鼠神經(jīng)功能。

圖2A～圖2D表示羥基酪醇不影響Aβ加工。

圖2E是Aβ降解酶IDE的mRNA表達檢測結(jié)果。

圖3A～圖3G表示羥基酪醇顯著改善線粒體功能障礙。

圖4A～圖4E表示羥基酪醇作用JNK/MAPK信號通路顯著修復(fù)阿爾茨海默小鼠腦內(nèi)炎性損傷。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在給予羥基酪醇之后，羥基酪醇可穿越血腦屏障提高腦組織的羥基酪醇含量，顯著改善阿爾茨海默病小鼠腦神經(jīng)功能及學(xué)習(xí)記憶能力。而且，羥基酪醇還可以逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默小鼠腦內(nèi)的線粒體功能障礙及線粒體蛋白羰基化異常，提高SOD-2蛋白表達，進而改善二項酶系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。更為重要的是，由于阿爾茨海默病腦內(nèi)存在長期炎癥損傷，在羥基酪醇的干預(yù)下，以JNK/MAPK為靶點，阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)炎性損傷顯著得到改善，達到預(yù)防和治療阿爾茨海默病發(fā)生與發(fā)展的作用。下面基于動物實驗?zāi)Ｐ蛠韺Ρ景l(fā)明進行詳細的說明。

1、動物飼養(yǎng)及藥物處理

實驗組APP/PS1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠、對照野生型C57雌性小鼠購自國家遺傳工程小鼠資源庫。小鼠飼養(yǎng)在可控溫度(23度到25度)和濕度(60％)的房間內(nèi)，房間的燈光維持在12小時白天、12小時黑夜的循環(huán)中，在實驗進行中小鼠能夠自由進食和進水。

APP/PS1是家族性阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過在C57BL/6J小鼠中同時表達人早老素PS1基因和嵌合淀粉樣前提蛋白APPswe基因繁殖篩選而成。從3月齡(Aβ沉積起始月齡)起至9月齡結(jié)束(小鼠出現(xiàn)顯著阿爾 茨海默病癥狀)，對APP/PS1轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠進行6個月的羥基酪醇灌胃處理，羥基酪醇劑量為5mg/kg小鼠/天，該劑量根據(jù)地中海飲食中每天羥基酪醇的攝取量換算而來。

實驗小鼠分為三組：1.野生型C57BL/6J小鼠；2.AD模型APP/PS1小鼠，灌胃等體積生理鹽水；3.APP/PS1小鼠，灌胃等體積羥基酪醇5mg/kg小鼠/天。飼喂結(jié)束后，通過腦電學(xué)檢測方法檢測小鼠神經(jīng)功能，Morris水迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫熒光染色、蛋白印記、RT-PCR、及ELISA等生物化學(xué)及分子生物學(xué)方法檢測Aβ前體蛋白加工過程、線粒體功能、炎癥信號。

2、腦內(nèi)羥基酪醇濃度檢測

小鼠腦內(nèi)羥基酪醇濃度采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用方法(AgilentTechnologies,Waldbronn,Germany)，檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測方法，用于定量分析的離子反應(yīng)為：m/z 153.1→m/z 123.1。

圖1A為腦組織中羥基酪醇含量的檢測結(jié)果，橫坐標為各處理組：AD表示阿爾茨海默病小鼠、HT表示羥基酪醇，縱坐標為羥基酪醇的含量；結(jié)果顯示阿爾茨海默病小鼠灌胃羥基酪醇后，每克腦組織中羥基酪醇含量可達8.19±3.77ng/mL，而未飼喂羥基酪醇的阿爾茨海默病小鼠每克腦組織中羥基酪醇含量僅為2.14±0.34ng/mL(羥基酪醇為腦內(nèi)多巴胺代謝物之一，因此未經(jīng)飼喂的小鼠腦內(nèi)仍可檢測出少量羥基酪醇)。

圖1B為模型小鼠的頻率檢測結(jié)果，橫坐標為頻率，縱坐標為不同頻率下的功率譜；結(jié)果顯示阿爾茨海默病小鼠Delta波段功率譜較高，Theta，Alpha，Beta波段功率譜降低，與阿爾茨海默病患者腦內(nèi)結(jié)果一致，羥基酪醇改善不同波段功率譜。

3、神經(jīng)功能及學(xué)習(xí)記憶能力測試

學(xué)習(xí)記憶能力的下降是AD病人的臨床特征，為了檢測HT是否具有減 緩AD神經(jīng)損傷的作用，以進行了神經(jīng)功能及學(xué)習(xí)記憶能力測試。

神經(jīng)功能通過腦電描記法進行檢測，記錄特定頻率范圍為2.8-4Hz(Delta),4-5.5Hz(Theta 1),5.5-8Hz(Theta 2),8-30Hz(Alpha and Beta)的功率譜。學(xué)習(xí)記憶能力通過Morris水迷宮方法進行檢測，連續(xù)6天記錄小鼠從不同象限放入迷宮后游向固定象限水下平臺的時間和路程，后對其進行統(tǒng)計學(xué)分析。

圖1C為水迷宮實驗中，小鼠在訓(xùn)練的六天內(nèi)游向平臺的路程的檢測結(jié)果，其中橫坐標為訓(xùn)練天數(shù)，縱坐標為游泳距離。圖1D為圖1C的統(tǒng)計圖，經(jīng)過圖1C計算曲線下面積所得。其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為曲線下面積。結(jié)果顯示，在給予羥基酪醇灌胃處理之后模型小鼠的在水迷宮實驗中的路程顯著增強，其學(xué)習(xí)能力得到了提高。

結(jié)果顯示，APP/PS1是小鼠模型較好的模擬了阿爾茨海默病，而在飼喂羥基酪醇之后，羥基酪醇能夠穿越血腦屏障從而增加腦組織中羥基酪醇含量，而訓(xùn)練結(jié)果表明羥基酪醇的增加能夠改善小鼠模型的學(xué)習(xí)能力，能夠改善阿爾茨海默病小鼠的神經(jīng)功能。

4、Aβ檢測

研究發(fā)現(xiàn)，Aβ斑塊是AD的經(jīng)典病理特征，為了檢測HT是否影響A否積累加工，下面進行Aβ檢測。

免疫熒光染色石蠟固定的腦組織切片，激光共聚焦顯微鏡分析皮層及海馬部位Aβ形態(tài)學(xué)沉積。Aβ沉積數(shù)量通過ELISA試劑盒(Invitrogen,Camarillo,CA,USA)進行檢測量化。Aβ前體蛋白AβPP及加工產(chǎn)物BACE通過免疫印跡檢測并量化，Aβ降解酶NEP和IDE分別通過免疫印跡和實時定量PCR檢測并量化。

圖2A為免疫熒光染色石蠟固定的腦組織切片，結(jié)果顯示在正常C57小鼠腦海馬和皮層部位均無Aβ斑塊，阿爾茨海默病小鼠和灌胃羥基酪醇的阿 爾茨海默病小鼠腦海馬和皮層部位有Aβ斑塊，但無組間差異。

圖2B為ELISA檢測Aβ斑塊數(shù)量的結(jié)果圖，其中，橫坐標為各處理組，縱坐標Aβ40、Aβ42分別為Aβ的兩種亞型；結(jié)果顯示經(jīng)ELISA檢測Aβ斑塊數(shù)量在灌胃羥基酪醇和生理鹽水兩組對比中無顯著差異。

圖2C為蛋白免疫印跡法檢測的AβPP、BACE、NEP的蛋白表達結(jié)構(gòu)，其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為蛋白名稱，AβPP是Aβ前體蛋白，BACE是AβPP加工成Aβ的中間產(chǎn)物；NEP是Aβ降解酶。圖2D是圖2C的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果。

圖2E是Aβ降解酶IDE的mRNA表達檢測結(jié)果。其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為IDE的mRNA水平。結(jié)果顯示IDE的mRNA表達并沒有顯著的變化，

結(jié)果表明，APP/PS1小鼠模型在飼喂羥基酪醇之后，羥基酪醇不影響Aβ積累加工，包括其前體、降解酶都沒有特別的差異。

5、線粒體功能檢測

研究發(fā)現(xiàn)Aβ能夠引起氧化壓力，因此，下面檢測了蛋白、脂質(zhì)氧化水平，以進一步檢測AβPP引起的氧化壓力是否涉及到線粒體功能的損傷，我們進行了線粒體復(fù)合物表達和活性的檢測。

線粒體氧化損傷通過蛋白羰基化試劑盒記性檢測(Cell Biolabs,SanDiego,CA,USA)；圖3A中橫坐標為各處理組，縱坐標為線粒體蛋白羰基化水平。結(jié)果顯示線粒體蛋白羰基化水平在阿爾茨海默病小鼠中較高，給予羥基酪醇處理后可將羰基化蛋白水平恢復(fù)至與正常小鼠相當。圖3B是圖3A的統(tǒng)計圖。

抗氧化活力通過ELISA檢測4-羥基壬稀酸(4-HNE，RD systems,Minneapolis,MN,USA)、谷胱甘肽(GSH，Beyotime,Jiangsu,China)、氧化型谷胱甘肽(GSSG，Beyotime,Jiangsu,China)。

圖3C顯示4-HNE水平在阿爾茨海默病小鼠腦組織中較高，羥基酪醇處理可將4-HNE水平恢復(fù)至與正常小鼠相當。其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為4-HNE的量。

圖3D顯示羥基酪醇處理顯著提高GSH水平，降低氧化型GSSG，同時GSH和GSSG的比值也顯著升高。其中，橫坐標為各處理組，縱坐標分別為GSH、GSSG含量及二者的比值。

圖3E顯示免疫印跡法檢測的線粒體相關(guān)蛋白表達，阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)SOD-2表達水平較低，HO-1表達水平較高，羥基酪醇處理后將蛋白表達量恢復(fù)至正常小鼠腦內(nèi)水平。圖3F是圖3E的統(tǒng)計圖，其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為蛋白名稱。

線粒體復(fù)合物活性通過分光光度法檢測。

圖3G顯示線粒體復(fù)合物I，II，III，IV活力變化，阿爾茨海默病小鼠復(fù)合物I活力較高，復(fù)合物II，III，IV活力較低，羥基酪醇處理后，復(fù)合物I，II，III，IV活力都得到顯著恢復(fù)。其中，橫坐標分別表示復(fù)合物I，II，III，IV，縱坐標表示復(fù)合物活力值相對于正常組的活力變化。

6、神經(jīng)炎癥分子檢測

NFκB是AD炎癥激活的關(guān)鍵分子，JNK/MAPK是NFκB的上游信號分子，為了檢測HT是否能夠減緩AD炎癥信號，下面進行NFκB，JNK/MAPK信號分子的檢測。采用蛋白免疫印跡法檢測JNK/MAPK信號通路分子p-JNK、p-ERK、p-p38、NFkB，以及炎性小體Caspase 1、Cleaved caspase 1，IL-18，以管家基因Actin作為參照；實時定量PCR檢測白介素和細胞因子：IL-6、COXII。

圖4A顯示免疫印跡法檢測的JNK/MAPK信號通路標志蛋白表達水平，JNK，ERK，p38，NFkB磷酸化水平在阿爾茨海默病小鼠中顯著升高，而羥基酪醇處理降低以上蛋白的磷酸化水平。圖4B是圖4A的統(tǒng)計圖。其中，橫 坐標是各處理組，縱坐標是蛋白名稱。

圖4C顯示炎性小體蛋白免疫印跡表達，阿爾茨海默病小鼠中Caspase-1和IL-18表達水平顯著升高，羥基酪醇飼喂后，Caspase-1，Cleaved caspase-1，IL-18表達水平顯著降低。圖4D是圖4C的統(tǒng)計圖。其中，橫坐標是各處理組，縱坐標是蛋白表達含量相對于正常組的百分比。

圖4E顯示炎性相關(guān)白介素和細胞因子IL-6，COXII的mRNA水平，阿爾茨海默病小鼠炎性反應(yīng)明顯，有較高的IL-6和COXII水平，羥基酪醇灌胃后IL-6和COXII水平恢復(fù)至正常小鼠水平。其中，橫坐標為各處理組，縱坐標為白介素和細胞因子名稱。

結(jié)果表明羥基酪醇作用JNK/MAPK信號通路顯著修復(fù)阿爾茨海默小鼠腦內(nèi)炎性損傷。

7、統(tǒng)計學(xué)分析

以上所有統(tǒng)計學(xué)結(jié)果采用均值±平均數(shù)標準誤差，組間差異分析方法采用單因素方差分析或雙因素方差分析，統(tǒng)計學(xué)分析顯著性標準定為p<0.05。

通過以上試驗結(jié)果證明羥基酪醇能有效穿越血腦屏障，在不影響Aβ加工的條件下，通過調(diào)控線粒體功能，靶向JNK/MAPK信號通路改善神經(jīng)炎癥信號，從而達到修復(fù)阿爾茨海默病的神經(jīng)功能損傷的作用。為制備阿爾茨海默病相關(guān)保健食品及藥物提供科學(xué)依據(jù)。羥基酪醇作為食物中的功能分子，其有效作用濃度低，長期服用無毒副作用，應(yīng)用前景廣闊。

以上給出的實施例是實現(xiàn)本發(fā)明較優(yōu)的例子，本發(fā)明不限于上述實施例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案的技術(shù)特征所做出的任何非本質(zhì)的添加、替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。