發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明系關(guān)于評估一個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)及罹患肝癌預(yù)后的方法。

發(fā)明背景

一般而言，于所有的癌癥中都可以觀察到dna不正常的甲基化現(xiàn)象。dna甲基化是由dna甲基轉(zhuǎn)移酶所催化，在胞嘧啶的第5個(gè)碳上增加一個(gè)甲基，此作用若發(fā)生在基因的5’端或是啟動子區(qū)域的cpg島，經(jīng)常會抑制該基因的轉(zhuǎn)錄作用而造成非活化。在腫瘤發(fā)生的過程中，不正常的dna甲基化現(xiàn)象經(jīng)常參與抑制dna修復(fù)基因以及腫瘤抑制基因的作用。

一般認(rèn)為不正常的dna甲基化通常發(fā)生在癌癥早期，因此，這些不正常的基因甲基化非常適合作為各種不同的癌癥標(biāo)記，例如：癌癥分類、診斷、預(yù)后、風(fēng)險(xiǎn)評估、化療反應(yīng)等。相較于其他的生物標(biāo)記，dna甲基化有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，其中最重要的優(yōu)點(diǎn)之一就是具有組織與不同癌癥間的專一性。此外，甲基化標(biāo)記是一種dna標(biāo)記，相較于rna與蛋白質(zhì)，其穩(wěn)定性相對較高。特別的是，dna甲基化不僅能在組織檢體中偵測，更能在各種不同的體液中偵測，例如：唾液、痰、精液、腸胃道消化液、呼吸道灌洗液、血漿、血清、尿液及糞便檢體等。

目前之肝癌篩檢，除了檢驗(yàn)胎兒蛋白(alpha-fetoprotein，afp)指數(shù)外，還必須合并腹部超音波檢查，然而，胎兒蛋白(afp)指數(shù)和腹部超音波檢查兩者都有其限制。在統(tǒng)計(jì)上，整體來說有百分之七十至百分之八十肝癌病人的胎兒蛋白指數(shù)會升高，但仍有百分之二十左右的病人即使到肝癌末期胎兒蛋白指數(shù)仍然不會升高。對于早期肝癌的診斷，胎兒蛋白的準(zhǔn)確度更低，有三分之一小型肝癌(小于三公分)病人的胎兒蛋白指數(shù)不會升高。而且還有一些其他因素會導(dǎo)致胎兒蛋白升高，影響肝癌診斷的正確性，例如：肝炎、肝硬化、懷孕、生殖細(xì)胞腫瘤等。而，僅管超音波檢查沒有痛苦，也沒有副作用，但，超音波檢查需要訓(xùn)練精良的醫(yī)師操作，因此檢出率與醫(yī)師的訓(xùn)練、經(jīng)驗(yàn)有關(guān)，除此之外，超音波本身也有其限制，例如，有些腫瘤長在超音波 監(jiān)測的死角、無法分辨腫瘤性質(zhì)、可能遺漏浸潤型的腫瘤或是腫瘤太小等無法檢測出來。

于現(xiàn)階段，手術(shù)切除是肝癌唯一根治性的治療。然而，由于肝癌早期不易發(fā)現(xiàn)，且大多數(shù)病人在肝癌發(fā)現(xiàn)時(shí)因?yàn)楦喂δ懿患?75％以上的病人有潛在的慢性肝病)、兩側(cè)肝葉疾病、或肝外轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致無法進(jìn)行切除。因此，肝癌的整體可切除率只有10～25％。如果肝癌無法切除，預(yù)后很差，中位存活期只有幾個(gè)月。

因此，目前亟需發(fā)展新的肝癌檢測方法，以提高肝癌初期的檢出率。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供一種評估一個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括：(a)分別測定一個(gè)體之一樣本中apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203(microrna-203，mir-203)之基因的甲基化程度；(b)依據(jù)該apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度計(jì)算出一預(yù)測分?jǐn)?shù)a；以及(c)根據(jù)該預(yù)測分?jǐn)?shù)a評估該個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)程度。

本發(fā)明也提供一種評估一感染b型肝炎病毒之個(gè)體罹患b型肝炎相關(guān)肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括：(a)分別測定該感染b型肝炎病毒之個(gè)體之一樣本中apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度；(b)依據(jù)該apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度計(jì)算出一預(yù)測分?jǐn)?shù)b；以及(c)根據(jù)該預(yù)測分?jǐn)?shù)b評估該感染b型肝炎病毒之個(gè)體罹患罹患b型肝炎相關(guān)肝癌的風(fēng)險(xiǎn)程度。

本發(fā)明還提供一種apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因于制備一試劑盒中的用途，其中所述試劑盒可用于評估一個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法。

本發(fā)明提供另一種apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因于制備一試劑盒中的用途，該試劑盒用于預(yù)測一感染b型肝炎病毒之個(gè)體是否罹患b型肝炎相關(guān)肝癌的方法。

本發(fā)明也提供一種評估一已罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的方法，包括：(a)分別測定一已罹患肝癌個(gè)體之一樣本中apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度；(b)依據(jù)該apc之基因、 cox2之基因、rassf1a之基因與微小rna-203之基因的甲基化程度計(jì)算一預(yù)測分?jǐn)?shù)a；以及(c)根據(jù)該預(yù)測分?jǐn)?shù)a評估該已罹患肝癌個(gè)體之五年存活機(jī)率。

本發(fā)明還提供一種評估一已罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的方法，包括：(a)分別測定一已罹患肝癌個(gè)體之一樣本中apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度；(b)依據(jù)該apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因與微小rna-203之基因的甲基化程度，以及依據(jù)年齡、性別、afp值、血管侵犯程度、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否，計(jì)算出一預(yù)后分?jǐn)?shù)；以及(c)根據(jù)該預(yù)后分?jǐn)?shù)評估該已罹患肝癌個(gè)體之五年存活機(jī)率。

本發(fā)明更提供一種偵測微小rna-203的甲基化之試劑盒，包括：一引物對，系由一順向引物與一逆向引物所構(gòu)成；以及一第一探針及/或一第二探針，其中該順向引物之序列包括與seqidno：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而該逆向引物之序列包括與seqidno：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列，又其中，該第一探針之序列包括與seqidno：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而該第二探針之序列包括與seqidno：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。

本發(fā)明又提供一種用于評估一個(gè)體是否罹患肝癌及/或評估罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的試劑盒，包括：用于偵測微小rna-203的甲基化之引物對與探針；用于偵測apc之基因的甲基化之引物對與探針；用于偵測cox2之基因的甲基化之引物對與探針；以及用于偵測rassf1a之基因的甲基化之引物對與探針。

為了讓本發(fā)明之上述和其他目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合所附圖示，作詳細(xì)說明如下：

附圖簡述

圖1顯示，apc基因在不同疾病分群中之甲基化程度。

圖2顯示，cox基因在不同疾病分群中之甲基化程度。

圖3顯示，微小rna-203基因在不同疾病分群中之甲基化程度。

圖4顯示，rassf1a基因在不同疾病分群中之甲基化程度。

圖5顯示，在肝癌族群中，將ln(apc)單變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接 受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖6顯示，在肝癌族群中，將ln(cox2)單變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖7顯示，在肝癌族群中，將ln(mir-203)單變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖8顯示，在肝癌族群中，將ln(rassf1a)單變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖9顯示，在肝癌族群中，將ln(apc)、ln(cox2)、ln(mir-203)與ln(rassf1a)四個(gè)變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖10顯示，在肝癌族群中，將ln(apc)、ln(cox2)、ln(mir-203)與ln(rassf1a)四個(gè)變量以交互驗(yàn)證法分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖11顯示，在肝癌族群中，將afp單變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖12顯示，在b肝相關(guān)肝癌族群中，將ln(apc)單變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖13顯示，在b肝相關(guān)肝癌族群中，將ln(cox2)單變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖14顯示，在b肝相關(guān)肝癌族群中，將ln(mir-203)單變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖15顯示，在b肝相關(guān)肝癌族群中，將ln(rassf1a)單變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖16顯示，在b肝相關(guān)肝癌族群中，將ln(apc)、ln(cox2)、ln(mir-203)與ln(rassf1a)四個(gè)變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖17顯示，在b肝相關(guān)肝癌族群中，將ln(apc)、ln(cox2)、ln(mir-203)與ln(rassf1a)四個(gè)變量以交互驗(yàn)證法分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖18顯示，在b肝相關(guān)肝癌族群中，將afp單變量以邏輯回歸分析后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析之結(jié)果。

圖19顯示，對于肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a小于等于0.45及大于0.45之5年存活單變量分析的結(jié)果。

圖20顯示，使用cox比例風(fēng)險(xiǎn)模式(coxproportionalhazardsmodel)計(jì)算預(yù)后分?jǐn)?shù)，以breslow方式計(jì)算基本存活函數(shù)，并以肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a是否大于0.45為分群，調(diào)整預(yù)后分?jǐn)?shù)中位數(shù)，評估5年內(nèi)存活函數(shù)。

圖21顯示，使用cox比例風(fēng)險(xiǎn)模式計(jì)算預(yù)后分?jǐn)?shù)，以breslow方式計(jì)算基本存活函數(shù)，并以肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a(是否大于0.45)與afp指數(shù)(是否大于20)為分群，調(diào)整預(yù)后分?jǐn)?shù)中位數(shù)，評估不同次群組之5年內(nèi)存活函數(shù)。

發(fā)明詳述

在本發(fā)明一實(shí)施態(tài)樣中，提供一種評估一個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法。適合以本發(fā)明之評估一個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法來評估的肝癌，并無特別限制。而在一實(shí)施例中，適合以本發(fā)明之評估一個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法來評估的肝癌可包括b型肝炎相關(guān)肝癌。

而上述本發(fā)明之評估一個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法，可包括下列步驟，但不限于此。

首先，分別測定一個(gè)體之一樣本中apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度。

上述個(gè)體，可包括，一哺乳動物，例如，人類、猩猩、猴子、貓、狗、兔子、天竺鼠、大鼠或小鼠，但不限于此。在一實(shí)施例中，上述個(gè)體可為人類。

又，上述樣本的例子，可包括，但不限于，血液、血漿、血清、肝組織、唾液、痰、精液、腸道消化液、呼吸道灌洗液、糞便等。在一實(shí)施例中，上述樣本可為血漿或血清。

所偵測之a(chǎn)pc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化位點(diǎn)，并無特別限制。在一實(shí)施例中，微小rna-203之基因的甲基化，可藉由偵測在染色體14之第104,522,452堿基對位置至第104,522,886堿基對位置的序列(根據(jù)ncbihomosapiensannotationrelease107)(seqidno：1)中，第104,522,554堿基對位置與第104,522,557堿基對位置之間的cpg二核苷酸甲基化及/或第104,522,570堿基對位置與第104,522,571堿基對位置之間的cpg二核苷酸甲基化及/或第104,522,579堿基 對位置與104,522,582堿基對位置之間的cpg二核苷酸甲基化等來確認(rèn)。

此外，適用于偵測apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化的方法，可包括，定量甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)(quantitativemethylation-specificpcr，qmsp)、重亞硫酸限制組合分析法(combinedbisulfiterestrictionanalyse，cobra)、重亞硫酸定序法(bisulfitesequencing)、焦磷酸定序法(pyrosequencing)、下一代定序(nextgenerationsequencing，ngs)、dna甲基化數(shù)組芯片分析法(dnamethylationarraychipanalysis)等，但不限于此。在一實(shí)施例中，甲基化程度系由定量甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)所偵測。

又，于一特定實(shí)施例中，甲基化程度系由定量甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)所偵測，而由定量甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)所偵測之微小rna-203之基因的甲基化位點(diǎn)，可如前方實(shí)施例中所述之甲基化位點(diǎn)，于此不再進(jìn)行贅述。

于上述之特定實(shí)施例中，微小rna-203之基因的甲基化可藉由一引物對與一第一探針及/或一第二探針之組合來偵測。上述引物對可包括一順向引物與一逆向引物，且順向引物之序列可包括與seqidno：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而逆向引物之序列可包括與seqidno：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列。又，第一探針之序列可包括與seqidno：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而第二探針之序列可包括與seqidno：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。在一實(shí)施例中，微小rna-203之基因的甲基化可藉由一引物對與一第一探針及/或一第二探針之組合來偵測，其中引物對包括一順向引物與一逆向引物，且順向引物之序列可為seqidno：2之序列，而逆向引物之序列可為seqidno：3之序列，又，第一探針之序列可為seqidno：4之序列，而第二探針之序列可為seqidno：5之序列。

依據(jù)apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度計(jì)算出一預(yù)測分?jǐn)?shù)a。

預(yù)測分?jǐn)?shù)a可藉由將apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度進(jìn)行例如邏輯回歸分析(logisticregressionanalysis)、判別函數(shù)分析(discriminantfunctionanalysis)、山脊回歸分析(ridgeregressionanalysis)等來獲得，但不限于此。在一實(shí)施例中，預(yù)測分?jǐn)?shù)a可藉由將apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因 的甲基化程度進(jìn)行邏輯回歸分析來獲得。

在一實(shí)施例中，預(yù)測分?jǐn)?shù)a可藉由將apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度，以下列公式進(jìn)行計(jì)算所獲得：

預(yù)測分?jǐn)?shù)a＝exp(預(yù)測值a)/(1+exp(預(yù)測值a))，

其中預(yù)測值a＝xl+x2×ln(apc)+x3×ln(cox2)+x4×ln(mir-203)+x5×ln(rassf1a)，

又，其中x1可為1.6148至2.8618，x2可為0.0237至0.1559，x3可為0.1169至0.2581，x4可為0.0058至0.1344，而x5可為0.0436至0.1758。

且，其中l(wèi)n(apc)代表apc基因甲基化程度之自然對數(shù)值，apc甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(apc))*1000；ln(cox2)代表cox2基因甲基化程度之自然對數(shù)值，cox2甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(cox2))*1000；ln(mir-203)代表mir-203基因甲基化程度之自然對數(shù)值，mir-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(mir-203))*1000；ln(rassf1a)代表rassf1a基因甲基化程度之自然對數(shù)值，rassf1a甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(rassf1a))*1000。

在一特定實(shí)施例中，于上方所示之公式中，x1為2.238，x2為0.0898，x3為0.1875，x4為0.0701，而x5為0.1097。

在依據(jù)apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度計(jì)算出預(yù)測分?jǐn)?shù)a之后，根據(jù)此預(yù)測分?jǐn)?shù)a來評估一個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)程度。

若預(yù)測分?jǐn)?shù)a高于一預(yù)先確認(rèn)的參考值，則此個(gè)體被評估為具有罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)。

在一實(shí)施例中，預(yù)先確認(rèn)的參考值為比較一群已知非肝癌個(gè)體以及已知具有肝癌個(gè)體中之a(chǎn)pc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度，代入前方所示公式并進(jìn)一步作出接受者操作特征曲線所獲得的一截?cái)嘀?。在一特定?shí)施例中，預(yù)先確認(rèn)的參考值可為0.45，而若預(yù)測分?jǐn)?shù)a高于0.45，則該個(gè)體被評估為具有罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)。

在本發(fā)明另一實(shí)施態(tài)樣中，提供一種apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因于制備一試劑盒中的用途，其中所 述試劑盒可用于前述任一本發(fā)明之評估一個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法。

在本發(fā)明另一實(shí)施態(tài)樣中，提供一種評估一感染b型肝炎病毒之個(gè)體罹患b型肝炎相關(guān)肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法。

而上述本發(fā)明之評估一感染b型肝炎病毒之個(gè)體罹患b型肝炎相關(guān)肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法，可包括下列步驟，但不限于此。

首先，分別測定一感染b型肝炎病毒之個(gè)體之一樣本中apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度。

有關(guān)個(gè)體、樣本、所偵測微小rna-203之基因的甲基化位點(diǎn)、適用于偵測基因甲基化的方法、以及所用以偵測微小rna-203之基因的甲基化的引物對與探針等的例子，如前方相對應(yīng)段落中之記載所述，故于此不再進(jìn)行贅述。

依據(jù)apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度計(jì)算出一預(yù)測分?jǐn)?shù)b。

預(yù)測分?jǐn)?shù)b可藉由將apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度進(jìn)行例如邏輯回歸分析、判別函數(shù)分析、山脊回歸分析等來獲得，但不限于此。在一實(shí)施例中，預(yù)測分?jǐn)?shù)b可藉由將apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度進(jìn)行邏輯回歸分析來獲得。

在一實(shí)施例中，預(yù)測分?jǐn)?shù)b可藉由將apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度，以下列公式進(jìn)行計(jì)算所獲得：

預(yù)測分?jǐn)?shù)b＝exp(預(yù)測值)/(1+exp(預(yù)測值))，

其中預(yù)測值b＝y(tǒng)l+y2×ln(apc)+y3×ln(cox2)+y4×ln(mir-203)+y5×ln(rassf1a)，

又，其中y1為1.7至3.34，y2為0.045至0.213，y3為0.142至0.32，y4為0.028至0.193，而y5為0.038至0.224，

且，其中l(wèi)n(apc)代表apc基因甲基化程度之自然對數(shù)值，apc甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(apc))*1000；ln(cox2)代表cox2基因甲基化程度之自然對數(shù)值，cox2甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(cox2))*1000；其中l(wèi)n(mir-203)代表mir-203基因甲基化程度之自然對數(shù)值，mir-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(mir-203))*1000；ln(rassf1a)代表rassf1a基因甲基化程度之自然對 數(shù)值，rassf1a甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(rassf1a))*1000。

在一特定實(shí)施例中，于上方所示之公式中，y1為2.447，y2為0.127，y3為0.226，y4為0.1091，而y5為0.1288。

在依據(jù)apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度計(jì)算出預(yù)測分?jǐn)?shù)b之后，根據(jù)此預(yù)測分?jǐn)?shù)b來評估一b肝患者個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)程度。

若預(yù)測分?jǐn)?shù)b高于一預(yù)先確認(rèn)的參考值，則此一b肝患者個(gè)體被評估為具有罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)。

在一實(shí)施例中，預(yù)先確認(rèn)的參考值為比較一群已知非b肝相關(guān)肝癌個(gè)體以及已知具有b肝相關(guān)肝癌個(gè)體中之a(chǎn)pc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度代入前方所示公式，并進(jìn)一步作出接受者操作特征曲線所獲得的一截?cái)嘀怠Ｔ谝惶囟▽?shí)施例中，預(yù)先確認(rèn)的參考值可為0.4，而若預(yù)測分?jǐn)?shù)b高于0.4，則此一b肝患者個(gè)體可被評估為具有罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)。

在本發(fā)明另一實(shí)施態(tài)樣中，提供一種apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因于制備一試劑盒中的用途，其中所述試劑盒可用于前述任一本發(fā)明之評估一b肝患者個(gè)體罹患肝癌之風(fēng)險(xiǎn)的方法。

在本發(fā)明另一實(shí)施態(tài)樣中，提供評估一已罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的方法。以上述本發(fā)明之評估已罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的方法來評估之肝癌病患，并無特別限制。在一實(shí)施例中，以前述本發(fā)明之評估已罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的方法來評估之肝癌病患可包括b型肝炎相關(guān)肝癌之病患以及c型肝炎相關(guān)肝癌之病患。

而上述本發(fā)明之評估已罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的方法，可包括，但不限于，下列步驟。

首先，分別測定一已罹患肝癌個(gè)體之一樣本中apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度。

有關(guān)個(gè)體、樣本、所偵測微小rna-203之基因的甲基化位點(diǎn)、適用于偵測基因甲基化的方法、以及所用以偵測微小rna-203之基因的甲基化的引物對與探針等的例子，如前方相對應(yīng)段落中之記載所述，故于此不再進(jìn)行贅述。

然后，依據(jù)前述測得之a(chǎn)pc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因與微小rna-203之基因的甲基化程度，計(jì)算一預(yù)測分?jǐn)?shù)a，并根據(jù)預(yù)測分?jǐn)?shù)a評估該已罹患肝癌個(gè)體之五年存活機(jī)率。

預(yù)測分?jǐn)?shù)a藉由將apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度以下列公式進(jìn)行計(jì)算所獲得：

預(yù)測分?jǐn)?shù)a＝exp(預(yù)測值a)/(1+exp(預(yù)測值a))，

其中預(yù)測值a＝xl+x2×ln(apc)+x3×ln(cox2)+x4×ln(mir-203)+x5×ln(rassf1a)，

又，其中x1為1.6148至2.8618，x2為0.0237至0.1559，x3為0.1169至0.2581，x4為0.0058至0.1344，而x5為0.0436至0.1758，

且其中l(wèi)n(apc)代表apc基因甲基化程度之自然對數(shù)值，apc甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(apc))*1000；ln(cox2)代表cox2基因甲基化程度之自然對數(shù)值，cox2甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(cox2))*1000；ln(mir-203)代表mir-203基因甲基化程度之自然對數(shù)值，mir-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(mir-203))*1000；ln(rassf1a)代表rassf1a基因甲基化程度之自然對數(shù)值，rassf1a甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(rassf1a))*1000。

在一實(shí)施例中，若預(yù)測分?jǐn)?shù)a大于一預(yù)先確認(rèn)的參考值，則5年存活率為約20-30％，而預(yù)測分?jǐn)?shù)a小于等于一預(yù)先確認(rèn)的參考值，則5年存活率為約60-70％。

上述預(yù)先確認(rèn)的參考值為比較一群已知非肝癌個(gè)體以及已知具有肝癌個(gè)體中之a(chǎn)pc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度，代入前方所示公式并進(jìn)一步作出接受者操作特征曲線所獲得的一截?cái)嘀怠Ｉ鲜鲱A(yù)先確認(rèn)的參考值可為在約0.4-0.5之間的一數(shù)值，但不限于此。在一實(shí)施例中，上述預(yù)先確認(rèn)的參考值可為0.45，而預(yù)測分?jǐn)?shù)a大于0.45，則5年存活率為約26.93％，而預(yù)測分?jǐn)?shù)a小于等于0.45，則5年存活率為約69.63％。

在本發(fā)明又另一實(shí)施態(tài)樣中，提供評估一已罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的方法。適合以上述本發(fā)明之評估已罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的方法來評估之肝癌病患，并無特別限制。在一實(shí)施例中，適合以前述本發(fā)明之評估已罹患肝癌 之個(gè)體之預(yù)后的方法來評估之該癌病患可包括b型肝炎以及c型肝癌相關(guān)肝癌之病患。

而上述本發(fā)明之評估已罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的方法，可包括，但不限于，下列步驟。

首先，分別測定一已罹患肝癌個(gè)體之一樣本中apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度。

有關(guān)個(gè)體、樣本、所偵測微小rna-203之基因的甲基化位點(diǎn)、適用于偵測基因甲基化的方法、以及所用以偵測微小rna-203之基因的甲基化的引物對與探針等的例子，如前方相對應(yīng)段落中之記載所述，故于此不再進(jìn)行贅述。

依據(jù)前述測得之a(chǎn)pc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因與微小rna-203之基因的甲基化程度，并依據(jù)年齡、性別、afp值、血管侵犯程度、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否，進(jìn)行多變量存活分析，計(jì)算出一預(yù)后分?jǐn)?shù)。

在一實(shí)施例中，計(jì)算預(yù)后分?jǐn)?shù)以及存活機(jī)率之步驟可進(jìn)一步包括下列所述步驟，但不限于此：

(i)依據(jù)apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因與微小rna-203之基因的甲基化程度以計(jì)算出一預(yù)測分?jǐn)?shù)a；與(ii)將預(yù)測分?jǐn)?shù)a，結(jié)合年齡、性別、afp值、血管侵犯與否、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否與罹患肝硬化與否，計(jì)算出預(yù)后分?jǐn)?shù)。

于上方所述之步驟(i)中，預(yù)測分?jǐn)?shù)a可藉由將apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度進(jìn)行，例如邏輯回歸分析、判別函數(shù)分析、山脊回歸分析等來獲得，但不限于此。在一實(shí)施例中，預(yù)測分?jǐn)?shù)a可藉由將apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度進(jìn)行邏輯回歸分析來獲得。

在一實(shí)施例中，于上方所述之步驟(i)中，預(yù)測分?jǐn)?shù)a可藉由將apc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度，以下列公式進(jìn)行計(jì)算所獲得：

預(yù)測分?jǐn)?shù)a＝exp(預(yù)測值a)/(1+exp(預(yù)測值a))，

其中預(yù)測值a＝xl+x2×ln(apc)+x3×ln(cox2)+x4×ln(mir-203)+x5×ln(rassf1a)，

又，其中x1可為1.6148至2.8618，x2可為0.0237至0.1559，x3可為0.1169 至0.2581，x4可為0.0058至0.1344，而x5可為0.0436至0.1758。

又，其中l(wèi)n(apc)表apc基因甲基化程度之自然對數(shù)值，apc甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(apc))*1000；其中l(wèi)n(cox2)表cox2基因甲基化程度之自然對數(shù)值，cox2甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(cox2))*1000；其中l(wèi)n(mir-203)表mir-203基因甲基化程度之自然對數(shù)值，mir-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(mir-203))*1000；其中l(wèi)n(rassf1a)表rassf1a基因甲基化程度之自然對數(shù)值，rassf1a甲基化程度由下列公式獲得：2^(ct(β-肌動蛋白)-ct(rassf1a))*1000。

又，在一特定實(shí)施例中，于上方所示之公式中，x1為2.238，x2為0.0898，x3為0.1875，x4為0.0701，而x5為0.1097。

又于上方所述之步驟(ii)中，預(yù)后分?jǐn)?shù)可藉由將年齡、性別、afp值、血管侵犯、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否以及前述計(jì)算之預(yù)測分?jǐn)?shù)a大于一預(yù)先確認(rèn)的參考值與否進(jìn)行多變量存活分析來獲得。

在一實(shí)施例中，于上方所述之步驟(ii)中，預(yù)后分?jǐn)?shù)可藉由將年齡、性別、afp值、血管侵犯與否、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否以及前述計(jì)算所獲得之預(yù)測分?jǐn)?shù)a大于一預(yù)先確認(rèn)的參考值與否，以下列公式進(jìn)行計(jì)算所獲得：

預(yù)后分?jǐn)?shù)＝b1×(年齡)+b2×(性別)+b3×(α-胎兒蛋白指數(shù)是否大于20)+b4×(血管侵犯與否)+b5×(腫瘤大小是否大于5cm)+b6×(臨床分期)+b7×(是否為肝硬化)+b8×(預(yù)測分?jǐn)?shù)a是否大于一預(yù)先確認(rèn)的參考值)，

b1為-0.0224至0.0426，b2為-0.8233至0.7836，b3為0.1798至1.3902，b4為-0.1089至1.0898，b5為-0.9560至0.4118，b6為0.8525至2.2027，b7為-1.9221至-0.2812，而b8為0.3534至2.2217。

其中，年齡直接代入實(shí)際歲數(shù)(年)；性別：男性代入1，女性則代入0；血管侵犯與否：是，代入1，否代入0；腫瘤大小是否大于5cm：是，代入1；否，代入0；臨床階段：iii/iv代入1，i/ii代入0；是否有肝硬化：是，代入1，否，代入0；預(yù)測分?jǐn)?shù)a是否大于一預(yù)先確認(rèn)的參考值：是，代入1；否，代入0。

上述預(yù)先確認(rèn)的參考值為比較一群已知非肝癌個(gè)體以及已知具有肝癌 個(gè)體中之a(chǎn)pc之基因、cox2之基因、rassf1a之基因以及微小rna-203之基因的甲基化程度，代入前方所示公式并進(jìn)一步作出接受者操作特征曲線所獲得的一截?cái)嘀怠Ｉ鲜鲱A(yù)先確認(rèn)的參考值可為在約0.4-0.5之間的一數(shù)值，但不限于此。在一實(shí)施例中，上述預(yù)先確認(rèn)的參考值可為0.45。

在計(jì)算出前述預(yù)后分?jǐn)?shù)之后，根據(jù)預(yù)后分?jǐn)?shù)來評估已罹患肝癌個(gè)體在一預(yù)估存活時(shí)間(年)t的存活機(jī)率。在一實(shí)施例中，預(yù)估存活時(shí)間(年)t之存活機(jī)率＝(s0(t))exp(預(yù)后分?jǐn)?shù))，其中s0(t)為基礎(chǔ)t年存活機(jī)率。

又，在一特定實(shí)施例中，若預(yù)后分?jǐn)?shù)小于0.45之罹癌患者，則5年存活機(jī)率約為69.48％，而若預(yù)后分?jǐn)?shù)大于等于0.45之罹癌患者，則5年存活機(jī)率約為34.19％。

以預(yù)測分?jǐn)?shù)a和afp指數(shù)為準(zhǔn)，以其他變數(shù)復(fù)合值中位數(shù)調(diào)整后，經(jīng)由breslow方法來估計(jì)調(diào)整共變量存活函數(shù)，以說明肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a與afp指數(shù)分群之四種組合之存活函數(shù)差異，afp＜＝20(ng/ml)和預(yù)測分?jǐn)?shù)a＜＝0.45之罹癌患者五年存活機(jī)率為69.48％。afp＞20(ng/ml)和預(yù)測分?jǐn)?shù)a＜＝0.45之罹癌患者，五年存活機(jī)率為48.61％。afp＜＝20(ng/ml)和預(yù)測分?jǐn)?shù)＞0.45之罹癌患者，五年存活機(jī)率約34.19％，afp＞20(ng/ml)和預(yù)測分?jǐn)?shù)＞0.45之罹癌患者，五年活機(jī)率僅剩11.64％。

本發(fā)明又另一實(shí)施態(tài)樣，則提供一種偵測微小rna-203之甲基化的試劑盒。

上述偵測微小rna-203之甲基化的試劑盒，則可包括，一引物對，系由一順向引物與一逆向引物所構(gòu)成，與一第一探針及/或一第二探針，但不限于此。

在一實(shí)施例中，順向引物之序列可包括與seqidno：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而逆向引物之序列可包括與seqidno：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列。又第一探針之序列可包括與seqidno：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而第二探針之序列則可包括與seqidno：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。

在一特定實(shí)施例中，上述本發(fā)明之偵測微小rna-203之甲基化的試劑盒，可包括，一引物對，系由一順向引物與一逆向引物所構(gòu)成，與一第一探針及/或一第二探針。于此特定實(shí)施例中，順向引物之序列為seqidno：2之序列，逆向引物之序列為seqidno：3之序列，第一探針之序列為seqid no：4之序列，而第二探針之序列為seqidno：5之序列。

本發(fā)明又另一實(shí)施態(tài)樣，則提供一種用于評估一個(gè)體是否罹患肝癌及/或評估罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的試劑盒。

上述用于評估一個(gè)體是否罹患肝癌及/或評估罹患肝癌之個(gè)體之預(yù)后的試劑盒，可包括，用于偵測微小rna-203的甲基化之引物對與探針、用于偵測apc之基因的甲基化之引物對與探針、用于偵測cox2之基因的甲基化之引物對與探針，與用于偵測rassf1a之基因的甲基化之引物對與探針，但不限于此。

在一實(shí)施例中，在用于偵測微小rna-203的甲基化之引物對與探針中，引物對可包括一順向引物與一逆向引物，而探針可包括一第一探針及/或一第二探針。順向引物之序列可包括與seqidno：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而逆向引物之序列可包括與seqidno：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列。又第一探針之序列可包括與seqidno：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而第二探針之序列則可包括與seqidno：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。

在一實(shí)施例中，上述試劑盒適用于定量甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)，但不限于此。

實(shí)施例

a.基因甲基化之偵測

(1)臨床血漿檢體

臨床血漿檢體來自國立成功大學(xué)醫(yī)學(xué)院附設(shè)醫(yī)院，計(jì)有健康人50例；肝炎47例(包含b型肝炎21例、c型肝炎26例)；肝炎合并肝硬化57例(包含b型肝炎32例、c型肝炎25例)；肝癌203例(包含b型肝炎81例、c型肝炎30例、b型肝炎合并肝硬化42例、c型肝炎合并肝硬化50例)，總計(jì)357例血漿檢體。此臨床研究經(jīng)國立成功大學(xué)醫(yī)學(xué)院附設(shè)醫(yī)院人體試驗(yàn)委員會審查通過。

(2)血漿游離dna萃取

800μl血漿以qiagenqiaampdnabloodminikit萃取血漿游離dna，萃取方法根據(jù)供貨商建議步驟進(jìn)行。以實(shí)時(shí)定量聚合酶連鎖反應(yīng)(real-timequantitativepolymerase.chainreaction，q-pcr)來測定血漿游離dna的濃度。

(3)亞硫酸氫鈉處理

使用ezdna甲基化試劑盒(zymoresearch)來處理臨床樣本dna，且執(zhí)行亞硫酸氫鈉處理，處理方法根據(jù)供貨商建議步驟進(jìn)行。

(4)實(shí)時(shí)定量甲基化分析(real-timequantitativemethylationanalysis)

將如上所述經(jīng)亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化之dna，以探針基礎(chǔ)之實(shí)時(shí)定量甲基化特異性pcr(qmsp)來進(jìn)行檢測。

各個(gè)反應(yīng)系由1xkapaprobefastmastermix(kapa)、0.5μm順向引物與0.5μm逆向引物以及0.25μm探針?biāo)鶚?gòu)成，總體積為20μl。擴(kuò)增反應(yīng)(amplification)在steponeplus實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)(thermofisherscientificinc.)中進(jìn)行，根據(jù)下列的熱循環(huán)條件：95℃、3分鐘；之后95℃、3秒，60-68℃、20秒及72℃、10秒的55個(gè)循環(huán)。根據(jù)上述記載，以下列公式計(jì)算β-肌動蛋白(β-actin)與目標(biāo)基因之間的ct值差，獲得甲基化程度：

對于血漿樣本：2^[ct(β-肌動蛋白)-ct(目標(biāo)基因)]x1000

偵測微小rna-203、apc、cox2、rassf1a之甲基化所使用之引物對與探針，分別如下所示：

表1

b.基本統(tǒng)計(jì)&anova

于以下顯示apc、cox2、rassf1a以及微小rna-203四個(gè)基因基本敘述統(tǒng)計(jì)，并呈現(xiàn)九個(gè)組別之個(gè)體間差異性。上述九組組別包含，健康成人組、b型肝炎病毒(hbv)感染組、c型肝炎病毒感染組(hcv)、b型肝炎病毒感染+肝硬化組(hbv+cirrhosis)、c型肝炎病毒感染+肝硬化組(hcv+cirrhosis)、肝癌-b型肝炎組(hcc-hbv)、肝癌-c型肝炎組(hcc-hcv)、肝癌-b型肝炎+肝硬化組(hcc-hbv+cirrhosis)以及肝癌-c型肝炎組+肝硬化組(hcc-hcv+cirrhosis)。

(1)apc基因之甲基化的基本敘述統(tǒng)計(jì)

apc基因之甲基化的基本敘述統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2與第1圖所示。

又，上方九組個(gè)體之ln(apc)均值，經(jīng)由anova分析顯示其在統(tǒng)計(jì)上呈現(xiàn)顯著不同。相較于非肝癌群組(包括健康成人組、b型肝炎病毒感染組、c型肝炎病毒感染組、b型肝炎病毒感染+肝硬化組以及c型肝炎病毒感染+肝硬化組)，肝癌群組(包括：肝癌-b型肝炎組、肝癌-c型肝炎組、肝癌-b型肝炎+肝硬化組以及肝癌-c型肝炎組+肝硬化組)之a(chǎn)pc基因甲基化程度明顯升高。

(2)cox基因之甲基化的基本敘述統(tǒng)計(jì)

cox基因之甲基化的基本敘述統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3與第2圖所示。

又，上方九組個(gè)體之ln(cox2)均值，經(jīng)由anova分析顯示其在統(tǒng)計(jì)上呈現(xiàn)顯著不同。相較于非肝癌群組(包括健康成人組、b型肝炎病毒感染組、c型肝炎病毒感染組、b型肝炎病毒感染+肝硬化組以及c型肝炎病毒感染+肝硬化組)，肝癌群組(包括：肝癌-b型肝炎組、肝癌-c型肝炎組、肝癌-b型肝炎+肝硬化組以及肝癌-c型肝炎組+肝硬化組)之cox2基因甲基化程度明顯升高。

(3)微小rna-203基因之甲基化的基本敘述統(tǒng)計(jì)

微小rna-203基因之甲基化的基本敘述統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4與第3圖所示。

又，上方九組個(gè)體之ln(mir-203)均值，經(jīng)由anova分析顯示其在統(tǒng)計(jì)上呈現(xiàn)顯著不同。相較于非肝癌群組(包括健康成人組、b型肝炎病毒感染組、c型肝炎病毒感染組、b型肝炎病毒感染+肝硬化組以及c型肝炎病毒感染+肝硬化組)，肝癌群組(包括：肝癌-b型肝炎組、肝癌-c型肝炎組、肝癌-b型肝炎+肝硬化組以及肝癌-c型肝炎組+肝硬化組)之微小rna-203基因甲基化程度明顯升高。

(4)rassf1a基因之甲基化的基本敘述統(tǒng)計(jì)

rassf1a基因之甲基化的基本敘述統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5與第4圖所示。

又，上方九組個(gè)體ln(rassf1a)均值，經(jīng)由anova分析顯示其在統(tǒng)計(jì)上呈現(xiàn)顯著不同。相較于非肝癌群組(包括健康成人組、b型肝炎病毒感染組、c型肝炎病毒感染組、b型肝炎病毒感染+肝硬化組以及c型肝炎病毒感染+肝硬化組)，肝癌群組(包括：肝癌-b型肝炎組、肝癌-c型肝炎組、肝癌-b型肝炎+肝硬化組以及肝癌-c型肝炎組+肝硬化組)之rassf1a基因甲基化程度明顯升高。

c.邏輯回歸與接受者操作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，roccurve)

罹患肝癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測

以下將利用基因與肝癌之關(guān)連性部份，以邏輯回歸進(jìn)行模式預(yù)測，并找到敏感度與精確度較佳之肝癌預(yù)測機(jī)率為最佳切點(diǎn)。之后透過收方特征操作曲線與其面積估計(jì)，評論該預(yù)測模式對肝癌有無區(qū)分之能力。

九個(gè)群組分別如下：

非肝癌群組包括：健康群組、b型肝炎病毒(hbv)感染組、c型肝炎病毒感染組(hcv)、b型肝炎病毒感染+肝硬化組(hbv+cirrhosis)與c型肝炎病毒感染+肝硬化組(hcv+cirrhosis)(共154位，n＝154)；肝癌群組包括：b型肝炎病毒感染-肝硬化-肝癌組(hcc-hbv+cirrhosis)與b型肝炎病毒感染+肝癌組(hbv-hcc)(共203位，n＝203)

1.單一甲基化標(biāo)記對肝癌之預(yù)測

(1)apc

將前述九個(gè)群組之ln(apc)建立模式。

預(yù)測模式：ln(p/(1-p))＝0.9753+0.1683*ln(apc)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如第5圖所示。根據(jù)第5圖可知，于apc之預(yù)測模式中，roccurve面積為0.6063，而若以0.48為模式最佳截?cái)嘀?，可得到靈敏度為56.2％，專一性為57.1％，整體正確率為56.6％。

(2)cox2

將前述九個(gè)群組之ln(cox2)建立模式。

預(yù)測模式：ln(p/(1-p))＝1.2778+0.2479*ln(cox2)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如第6圖所示。根據(jù)第6圖可知，于cox2之預(yù)測模式中，roccurve面積為0.683，而若以0.45為模式最佳截 斷值，可得到靈敏度為61.1％，專一性為66.2％，整體正確率為63.3％。

(3)mir-203

將前述九個(gè)群組之ln(mir-203)建立模式。

預(yù)測模式：ln(p/(1-p))＝0.6845+0.0942*ln(mir-203)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如第7圖所示。根據(jù)第7圖可知，于mir-203之預(yù)測模式中，roccurve面積為0.518，而若以0.52為模式最佳截?cái)嘀?，可得到靈敏度為49.3％，專一性為43.5％，整體正確率為46.8％。

(4)rassf1a

將前述九個(gè)群組之ln(rassf1a)建立模式。

預(yù)測模式：ln(p/(1-p))＝0.9818+0.1787*ln(rassf1a)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如第8圖所示。根據(jù)第8圖可知，于rassf1a之預(yù)測模式中，roccurve面積為0.6332，而若以0.46為模式最佳截?cái)嘀?，可得到靈敏度為59.8％，專一性為48.6％，整體正確率為55.0％。

2.多重甲基化標(biāo)記對肝癌之預(yù)測

(1)逐步選取法(stepwiseselection)

將以上九個(gè)群組之ln(apc)、ln(cox2)、ln(rassf1a)與ln(mir-203)進(jìn)行逐步選取法分析，上述四種因子進(jìn)入模式順序?yàn)閘n(cox2)、ln(rassf1a)、ln(apc)以及l(fā)n(mir-203)，無移除因子。

(2)最大似然率估計(jì)(maximumlikelihoodestimates)

將以上九個(gè)群組之ln(cox2)、ln(rassf1a)、ln(apc)與ln(mir-203)進(jìn)行最大似然率估計(jì)分析、參數(shù)評估與wald信賴區(qū)間分析，結(jié)果如表6所示。

表6

(3)風(fēng)險(xiǎn)勝算比評估與95％信賴區(qū)間(oddsratioestimatesandprofile-likelihoodconfidenceintervals)

將以上九個(gè)群組之ln(apc)、ln(cox2)、ln(rassf1a)與ln(mir-203)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)勝算比評估與95％信賴區(qū)間分析，結(jié)果如表7所示。

表7

由表7可以得知，ln(apc)每上升一單位，罹患hcc之風(fēng)險(xiǎn)勝算比(oddratio)增加9.4％；ln(cox2)每上升一單位，罹患hcc之風(fēng)險(xiǎn)勝算比則會增加20.6％；ln(mirna-203)每上升一單位，罹患hcc之風(fēng)險(xiǎn)勝算比則會增加7.3％；ln(rassf1a每上升一單位，罹患hcc之風(fēng)險(xiǎn)勝算比則會增加11.6％。四種基因之甲基化程度以cox2基因?yàn)樽罹哂绊懗潭取?/p>

于前述各分析后，以逐步回歸分析，選出ln(apc)、ln(cox2)、ln(mir-203)與ln(rassf1a)四個(gè)變量建立模式。

預(yù)測模式a：

ln(p/(1-p))＝2.238+0.0898*ln(apc)+0.1875*ln(cox2)+0.0701*ln(mirna-203)+0.1097*ln(rassf1a)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如表8以及第9圖所示。

表8.接受者操作特征曲線截?cái)嘀蹬c靈敏度、特異性、偽陽性、偽陰性及整體正確率關(guān)系

根據(jù)表8與第9圖可知，接受者操作特征曲線面積為0.793，表示以預(yù)測模式a對非肝癌及肝癌族群作有無罹患肝癌分類，可得到較佳的分類結(jié)果。若以0.45為模式最佳截?cái)嘀?cutoffvalue)，可得到靈敏度為73.4％，專一性為73.0％，偽陽性21.5％，偽陰性32.9％，整體正確率為73.2％。

另外以交互驗(yàn)證法(cross-validation)(leave-one-out)作模式驗(yàn)證，亦可印證本模式之分類能力，結(jié)果如表9以及第10圖所示。

表9.接受者操作特征曲線截?cái)嘀蹬c靈敏度、特異性、偽陽性、偽陰性及整體正確率關(guān)系

根據(jù)表9，以及第10圖可知，以交互驗(yàn)證法cross-validation(leave-one-out)作模式驗(yàn)證，接受者操作特征曲線面積為0.7818。若以0.47為模式最佳截?cái)嘀担傻玫届`敏度為72.9％、專一性為73％、偽陽性為21.6％以及偽陰性33.3％，整體正確率為72.9％。證明預(yù)測模式之準(zhǔn)確度。

3.afp標(biāo)記對肝癌之預(yù)測

將前述九個(gè)群組之ln(afp)建立模式。

預(yù)測模式：ln(p/(1-p))＝0.7865+0.1198*ln(afp)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如表10以及第11圖所示。最佳切點(diǎn)為0.75時(shí)，靈敏度是55.7％，專一性是56.9％，偽陽性是18.8％，偽陰性是72.3％，整體正確率為56.0％。

表10、afp進(jìn)行接受者操作特征曲線分析時(shí)，最佳切點(diǎn)為0.75之靈敏度、專一性、偽陽性、偽陰性及整體正確率

罹患b型肝炎相關(guān)肝癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測

五個(gè)群組分別如下：

非肝癌群組包括：健康群組、b型肝炎病毒(hbv)感染組與b型肝炎病毒感染+肝硬化組(hbv+cirrhosis)(共100位，n＝100)；肝癌群組包括：b型肝炎病毒感染-肝硬化-肝癌組(hcc-hbv+cirrhosis)與b型肝炎病毒感染+肝癌組(hbv-hcc)(共120位，n＝120)

1.單一甲基化標(biāo)記對b型肝炎相關(guān)肝癌預(yù)測

(1)apc

將前述五個(gè)群組之ln(apc)建立模式。

預(yù)測模式：ln(p/(1-p))＝0.9165+0.1922*ln(apc)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如第12圖所示。

根據(jù)第12圖可知，于apc之預(yù)測模式中，roccurve面積為0.644，而若以0.547為模式最佳截?cái)嘀?，可得到靈敏度為62.5％，專一性為92％，整體正確率為75.9％。

(2)cox2

將前述五個(gè)群組之ln(cox2)建立模式。

預(yù)測模式：ln(p/(1-p))＝1.20072+0.29966*ln(cox2)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如第13圖所示。

根據(jù)第13圖可知，于cox2之預(yù)測模式中，roccurve面積為0.758，而若以0.454為模式最佳截?cái)嘀?，可得到靈敏度為74.16％，專一性為92％，整體正確率為82.27％。

(3)mir-203

將前述五個(gè)群組之ln(mir-203)建立模式。

預(yù)測模式：ln(p/(1-p))＝0.5909+0.1096*ln(mir-203)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如第14圖所示。

根據(jù)第14圖可知，于mir-203之預(yù)測模式中，roccurve面積為0.55，而若以0.565為模式最佳截?cái)嘀?，可得到靈敏度為55％，專一性為83％，整體正確率為67.73％。

(4)rassf1a

將前述五個(gè)群組之ln(rassf1a)建立模式。

預(yù)測模式：ln(p/(1-p))＝0.99403+0.21392*ln(rassfia)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如第15圖所示。

根據(jù)第15圖可知，于rassf1a之預(yù)測模式中，roccurve面積為0.67，而若以0.582為模式最佳截?cái)嘀担傻玫届`敏度為62.5％，專一性為83％，整體正確率為76.36％。

2.多重甲基化標(biāo)記對b型肝炎相關(guān)肝癌預(yù)測

(1)逐步選取法(stepwiseselection)

將以上五個(gè)群組之ln(apc)、ln(cox2)、ln(rassf1a)與ln(mir-203)進(jìn)行逐步選取法分析，上述四種因子進(jìn)入模式順序?yàn)閘n(cox2)、ln(apc)、ln(rassf1a)以及l(fā)n(mir-203)，無移除因子。

(2)最大似然率估計(jì)(maximumlikelihoodestimates)

將以上五個(gè)群組之ln(apc)、ln(cox2)、ln(rassf1a)與ln(微小rna-203)進(jìn)行最大似然率估計(jì)分析、參數(shù)評估與wald信賴區(qū)間分析，結(jié)果如表11所示。

表11

(3)風(fēng)險(xiǎn)勝算比評估與95％信賴區(qū)間(oddsratioestimatesandprofile-likelihoodconfidenceintervals)

將以上五個(gè)群組之ln(apc)、ln(cox2)、ln(rassf1a)與ln(mir-203)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)勝算比估計(jì)與95％信賴區(qū)間分析，結(jié)果如表12所示。

表12

由表12可以得知，ln(apc)每上升一單位，罹患hcc之風(fēng)險(xiǎn)勝算比(oddratio)增加13.6％；ln(cox2)每上升一單位，罹患hcc之風(fēng)險(xiǎn)勝算比則會增加25.4％；ln(微小rna-203)每上升一單位，罹患hcc之風(fēng)險(xiǎn)勝算比則會增加11.5％；ln(rassf1a)每上升一單位，罹患hcc之風(fēng)險(xiǎn)勝算比則會增加13.7％。四種基因之甲基化程度以cox2基因?yàn)樽罹哂绊懗潭取?/p>

于前述各分析后，以逐步回歸分析，選出ln(apc)、ln(cox2)、ln(mir-203)與ln(rassf1a)四個(gè)變量建立模式。

預(yù)測模式b：ln(p/(1-p))＝2.447+0.127×ln(apc)+0.226×ln(cox2)+0.1091×ln(mir-203)+0.1288×ln(rassfia)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如表13，以及第16圖所示。

表13、接受者操作特征曲線截?cái)嘀蹬c靈敏度、特異性、偽陽性、偽陰性及整體正確率關(guān)系

根據(jù)表13以及第16圖可知，接受者操作特征曲線面積為0.865，而此表示以預(yù)測模式b對非b肝相關(guān)肝癌族群及b肝相關(guān)肝癌族群作有無罹患肝癌分類，可得到很好的分類結(jié)果。若以0.4為模式最佳截?cái)嘀?cutoffvalue)，可得 到靈敏度為84.2％，專一性為83.0％，偽陽性14.4％，偽陰性18.6％，整體正確率為83.6％。

另外以交互驗(yàn)證法(cross-validation)(leave-one-out)作模式驗(yàn)證，亦可印證本模式之分類能力，結(jié)果如表14，以及第17圖所示。

表14、接受者操作特征曲線截?cái)嘀蹬c靈敏度、特異性、偽陽性、偽陰性及整體正確率關(guān)系

根據(jù)表13與表14，以及第17圖可知，以交互驗(yàn)證法cross-validation(leave-one-out)作模式驗(yàn)證，接受者操作特征曲線面積為0.8548。若以0.4為模式最佳截?cái)嘀担傻玫脚c原先模式相同之靈敏度、專一性、偽陽性以及偽陰性，證明預(yù)測模式之準(zhǔn)確度。

3.afp標(biāo)記對b型肝炎相關(guān)肝癌預(yù)測

將前述五個(gè)群組之ln(afp)建立模式。

預(yù)測模式：

ln(p/(1-p))＝0.8159+0.1685*ln(afp)

之后進(jìn)行接受者操作特征曲線分析，結(jié)果如表15，以及第18圖所示。最佳切點(diǎn)為0.775時(shí)，相對應(yīng)之a(chǎn)fp(ng/ml)值為12.1545，靈敏度是50.9％，專一性是62.1％，偽陽性是15.7％，偽陰性是76％，整體正確率為53.1％。

表15

根據(jù)上方個(gè)結(jié)果可知，ln(apc)、ln(cox2)、ln(rassf1a)與ln (mir-203)之組合的預(yù)測模型具有最高的正確率。

d.存活分析

(1)單變量存活分析

將已罹患肝癌之病患，依據(jù)年齡、性別、afp值、血管侵犯與否、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否以及肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a是否大于0.45進(jìn)行分類，并進(jìn)行5年死亡之單變量分析，結(jié)果如表16所示。

表16、5年死亡之單變量分析

注：肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a可由以下公式可獲得

預(yù)測分?jǐn)?shù)a＝exp(預(yù)測值a)/(1+exp(預(yù)測值a))

預(yù)測值a＝2.238+0.0898×ln(apc)+0.1875×ln(cox2)+0.0701×ln(mir-203)+0.1097×ln(rassfia)

表16列出各變量分類群組之五年死亡率，并以對數(shù)等級檢定(log-ranktest)進(jìn)行存活函數(shù)檢定，結(jié)果顯示，肝硬化、組織分級、afp(ng/ml)、病理階段、臨床階段、血管侵犯、預(yù)測分?jǐn)?shù)a等七個(gè)變量，各單變量在其分類群組之存活函數(shù)有顯著不同。

而對于肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a之5年存活單變量分析的結(jié)果如第19圖所示。預(yù)測分?jǐn)?shù)a≤0.45，5年存活機(jī)率為75.2％；預(yù)測分?jǐn)?shù)a＞0.45，5年存活機(jī)率為48.3％，p＝0.0052，具顯著差異。

(2)多變量存活分析

將已罹患肝癌之病患，依據(jù)年齡、性別、afp值、血管侵犯與否、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否以及預(yù)測分?jǐn)?shù)a是否大于0.45進(jìn)行分類，并進(jìn)行多變量存活分析。

多變量cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

將已罹患肝癌之病患，依照上述分類進(jìn)行多變量cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，結(jié)果如表17所示。

表17

以cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析進(jìn)行多變量存活函數(shù)分析，其中afp、臨床分期肝硬化、預(yù)測分?jǐn)?shù)a等變量，在其他變量同時(shí)調(diào)整下仍具統(tǒng)計(jì)顯著。若受檢者afp＞20，5年內(nèi)死亡之風(fēng)險(xiǎn)比增加1.0倍；若受檢者之臨床病理分類為第三期以上，5年內(nèi)死亡之風(fēng)險(xiǎn)比增加約3.4倍；若受檢者預(yù)測分?jǐn)?shù)a大于0.45，5年內(nèi)死亡之風(fēng)險(xiǎn)比增加約1.9倍。

多變量cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析所獲得之公式如下：

預(yù)后分?jǐn)?shù)＝b1×(年齡)+b2×(性別)+b3×(α-胎兒蛋白指數(shù)是否大于20)+b4×(血管侵犯與否)+b5×(腫瘤大小是否大于5cm)+b6×(臨床分期)+b7×(是否為肝硬化)+b8×(預(yù)測分?jǐn)?shù)a是否大于0.45)。

其中，b1為0.01398，b2為-0.04761，b3為0.69494，b4為0.50467，b5為-0.18205，b6為1.47360，b7為0.69139，b8為1.08088。

又，年齡直接代入實(shí)際歲數(shù)(年)；性別：男性代入1，女性則代入0；血管侵犯與否：是，代入1，否代入0；腫瘤大小是否大于5cm：是代入1；否代入0；臨床階段：iii/iv代入1，i/ii代入0；是否有肝硬化：是代入1，否代入0；預(yù)測分?jǐn)?shù)a是否大于0.45：是代入1；否代入0。

以breslow方法預(yù)估存活t年之存活機(jī)率＝(s0(t))exp(預(yù)后分?jǐn)?shù))，s0(t)為基礎(chǔ)t年存活機(jī)率?；A(chǔ)t年存活機(jī)率s0(t)函數(shù)如表18所示(依據(jù)文獻(xiàn)breslow，n.(1974)covarianceanalysisofsurvivaldataundertheproportionalhszardsmodel.internationalstatisticalreview，43，43-54.與elisa，t.leeandjohnwenyuwang.(2003)statisticalmethodsforsurvivaldataanalysis.p.321.3rded.wiley，newyork.所記載之計(jì)算方式獲得)。

表18、基礎(chǔ)t年存活機(jī)率s0(t)函數(shù)

(a)以肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a估計(jì)存活機(jī)率

以肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a為準(zhǔn)，以其他變數(shù)復(fù)合值中位數(shù)調(diào)整后，經(jīng)由breslow方法來估計(jì)調(diào)整共變量存活函數(shù)(covariate-adjustedsurvivalfunction)，以說明肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a分群之兩種組合之存活函數(shù)差異，結(jié)果如第20圖所示。

第20圖顯示，預(yù)測分?jǐn)?shù)a＜＝0.45之罹癌患者，五年存活之機(jī)率約為69.48％，而預(yù)測分?jǐn)?shù)＞0.45之罹癌患者，五年存活之機(jī)率約為34.19％。

(b)以預(yù)測分?jǐn)?shù)a及afp指數(shù)評估存活機(jī)率

以預(yù)測分?jǐn)?shù)a和afp指數(shù)為準(zhǔn)，以其他變數(shù)復(fù)合值中位數(shù)調(diào)整后，經(jīng)由breslow方法來估計(jì)調(diào)整共變量存活函數(shù)，以說明肝癌預(yù)測分?jǐn)?shù)a與afp指數(shù)分群之四種組合之存活函數(shù)差異，結(jié)果如第21圖所示。

第21圖顯示，afp＜＝20(ng/ml)和預(yù)測分?jǐn)?shù)a＜＝0.45之罹癌患者五年存活機(jī)率為69.48％。afp＞20(ng/ml)和預(yù)測分?jǐn)?shù)＜＝0.45之罹癌患者，五年存活機(jī)率為48.61％。afp＜＝20(ng/ml)和預(yù)測分?jǐn)?shù)＞0.45之罹癌患者，五年存活機(jī)率約34.19％，afp＞20(ng/ml)和預(yù)測分?jǐn)?shù)＞0.45之罹癌患者，五年活機(jī)率僅剩 11.64％。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何熟習(xí)此技藝者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許之更動與潤飾，因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視后附之申請專利范圍所界定者為準(zhǔn)。