本發(fā)明涉及生物檢測領域，更具體地涉及一種檢測ido2活性的方法。

背景技術：

吲哚胺2，3-雙加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1,ido1)是哺乳動物中催化色氨酸沿著犬尿氨酸途徑(kynureninepathway)代謝的第一個限速酶。研究表明ido1在多種腫瘤組織中有高表達，可以通過降低腫瘤微環(huán)境中色氨酸濃度來抑制淋巴細胞的增殖，在腫瘤免疫逃逸中起到重要作用，因此,目前認為ido1的高表達是導致機體對腫瘤產(chǎn)生免疫耐受的重要因素之一。

ball等在2007年發(fā)現(xiàn)了一種在編碼基因序列、分子結構及生物活性上與ido1都十分相似的酶，并命名為indol1(indoleamine2,3-dioxygenase-likeprotein)，即現(xiàn)在的吲哚胺2，3-雙加氧酶2(indoleamine2,3-dioxygenase2,ido2)。ido2位于ido1基因的下游，在結構上ido2的序列和ido1的序列高度相似，位于人和小鼠的第八號染色體上，在小鼠的腎臟，生殖系統(tǒng)，肝臟中高表達。有研究發(fā)現(xiàn)在胃癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌的癌組織中也有ido2的表達。多項研究表明盡管活性比ido1低，且不起主導作用，但ido2也能催化色氨酸的降解。研究表明，ido2與ido1關系密切，兩者可能共同作用參與腫瘤發(fā)生、腫瘤免疫耐受、炎癥反應等重大疾病或生理活動，因此ido2有望成為繼ido1之后治療人類重大疾病的有效藥物靶標。

ido1在腫瘤的免疫耐受中的重要作用已被人們所承認，并且在基因表達、信號轉(zhuǎn)導、用于具有ido1介導的色氨酸代謝途徑的病理學特征的疾病(包括癌癥、艾滋病、阿爾茨海默病、抑郁癥、白內(nèi)障等重大疾病)的治療等方面成為研究熱點。ido2與ido1的結構相似，編碼基因位置相鄰，并且有研究表明，特異性抑制ido2后可表現(xiàn)出更強的抗腫瘤效果。然而，目前本領域關于ido2的生物學特征、功能與免疫耐受的研究還相對較少，也沒有成熟的ido2檢測方法，阻礙了ido2的進一步研究以及ido2抑制劑的研究。因此，本領域迫切需要開發(fā)完善可靠ido2檢測方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種完善可靠的檢測ido2活性的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種非診斷性地檢測吲哚胺2,3-雙加氧酶2(ido2)活性的方法，包括步驟：

(i)提供一待測ido2樣品，和ph7.2-7.8的緩沖體系，所述緩沖體系中包含濃度為5-500mmol/l的l-色氨酸；

(ii)將所述的待測ido2樣品和緩沖體系混合并反應，獲得含n-甲酰犬尿氨酸的反應混合物；

(iii)對反應混合物進行終止反應；

(iv)對反應混合物進行轉(zhuǎn)化，從而將n-甲酰犬尿氨酸轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸；

(v)對反應混合物進行離心，獲得上清液；

(vi)對上清液進行顯色反應，并測定上清液的吸光度；

(vii)基于測得的吸光度，判斷ido2的酶活性。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(v)中，所述離心的離心力為8000-20000g，較佳地為10000-15000g，更佳地為12000-14000g。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(v)中，所述離心的時間為5-20min，較佳地為8-10min。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述ido2樣品包含重組ido2。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述ido2樣品中重組ido2的含量為80-100％，較佳地為90-100％，按樣品的總重量計。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述重組ido2的編碼基因序列如seqidno.:5、或seqidno.:6所示。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述的重組ido2為人的ido2。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述緩沖體系的ph為7.3-7.7，較佳地為7.4-7.6，更佳地為7.5。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述l-色氨酸的濃度為10-100mmol/l，較佳地為10-50mmol/l。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述的緩沖體系還包含濃度為50mmol/l的磷酸緩沖液、濃度為200μg/ml的過氧化氫酶、濃度為40mmol/l的抗壞血酸、和濃度為20μmol/l的亞甲基藍。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(ii)中，所述反應的溫度為30-42℃，較佳地為35-40℃，更佳地為36-37℃。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(ii)中，所述反應的時間為10-60min，較佳地為20-40min，更佳地為25-30min。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括，位于步驟(ii)之前的步驟：

(ii0)將所述緩沖體系保溫一段時間。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(ii0)中，所述保溫的溫度為30-42℃，較佳地為35-40℃，更佳地為36-37℃。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(ii0)中，所述保溫的時間為2-10min，較佳地為3-5min。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(iii)中，加入三氯乙酸從而終止反應。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(iv)中，所述轉(zhuǎn)化的溫度為60-70℃，較佳地為62-68℃，更佳地為64-65℃。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(iv)中，所述轉(zhuǎn)化的時間為10-20min，較佳地為13-15min。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(vi)中，加入對二甲氨基苯甲醛從而使上清液顯色。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(vi)中，所述對二甲氨基苯甲醛的濃度為2‰-3‰(w/v)。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(vi)中，在波長為488-495nm，較佳地為490-492nm的條件下進行檢測，從而測得上清液吸光度。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種篩選抑制ido2活性的候選化合物的方法，包括步驟：

(a)提供一待測化合物，用本發(fā)明第一方面所述的方法檢測ido2的活性，并判斷待測化合物對ido2的抑制情況，從而選出對ido2有抑制作用的待測化合物，作為經(jīng)初篩的候選化合物。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，在實驗組中，在加入所述的待測化合物并在ido2存在的條件下，測定ido2的酶活，記為mt；并且在不存在所述待測化合物且其他條件相同的對照組中，測定ido2的酶活，記為mc；并對mt和mc進行比較；

其中，如果mt顯著低于mc，則表明所述的待測化合物為抑制ido2的待測化合物，即作為經(jīng)初篩的候選化合物；

如果mt顯著高于mc，則表明所述的待測化合物為促進ido2的待測化合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的“顯著低于”指mt/mc≤1/1.5，較佳地≤1/2，更佳地≤1/3。

在另一優(yōu)選例中，所述的“顯著高于”指mt/mc≥1.5，較佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括，位于步驟(a)之后的步驟：

(b)測試經(jīng)初篩的候選化合物在細胞水平抑制ido2活性的情況，從而選出在細胞水平也能抑制ido2活性的化合物，作為候選化合物。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，還包括設置陽性對照組、和/或陰性對照組。

在另一優(yōu)選例中，在所述方法中還包括：

基于待測化合物對ido2的抑制情況，判斷所述待測化合物對ido2的抑制類型。

在另一優(yōu)選例中，所述“判斷所述待測化合物對ido2的抑制類型”包括步驟：

(i)分別在不同色氨酸濃度的緩沖體系中，用本發(fā)明第一方面所述的方法檢測ido2的活性，測定所述待測化合物在n個不同濃度下對ido2的抑制情況，其中，n為≥3的正整數(shù)(較佳地5≤n≤20，更佳地6≤n≤15)；

(ii)以步驟(i)中測得的數(shù)據(jù)作圖，并判斷待測化合物的抑制類型。

在另一優(yōu)選例中，所述的色氨酸濃度為c1，其中，c1≤50mm，且c1≥10mm。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，在m個不同色氨酸濃度的緩沖體系中，測定待測化合物對ido2的抑制情況，其中，3≤m≤5。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(ii)中，以[s]/v對待測化合物(或抑制劑)濃度[i]、1/v對待測化合物(抑制劑)濃度[i]分別作圖，參照對比dixon作圖法判斷化合物對 ido2的抑制類型。

應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了重組質(zhì)粒的酶切驗證結果。其中，泳道m(xù)：dnamarker；泳道1：pet28a-hido2(2)(ncoi+xhoi雙酶切)；泳道2：pet28a-hido2(1)(ndei+xhoi雙酶切)。

圖2顯示了不同條件下目的蛋白的表達情況。其中，圖2a顯示了導入不同重組質(zhì)粒的大腸桿菌表達的目的蛋白的sds-page電泳結果；圖2b顯示了導入不同重組質(zhì)粒的大腸桿菌表達的目的蛋白的westernblot分析結果；圖2c顯示了不同iptg誘導濃度下重組菌表達的目的蛋白的sds-page電泳結果。圖2a和圖2b中，泳道m(xù)：proteinmarker；泳道1：未誘導組菌體總蛋白；泳道2：pet28a-hido2(1)誘導組菌體總蛋白；泳道3：pet28a-hido2(2)誘導組菌體總蛋白。

圖3顯示了不同處理條件下hido2蛋白的sds-page分析結果。其中，泳道m(xù)：proteinmarker；泳道1：未誘導組總蛋白；泳道2：誘導組總蛋白；泳道3：誘導組破菌后上清總蛋白；泳道4：與ni-nta柱不能特異結合的上清流出液；泳道5：20mmol/l咪唑洗脫下的雜蛋白；泳道6-8：250mmol/l咪唑洗脫下的目的蛋白。

圖4顯示了過分子篩層析柱后的hido2蛋白分析結果。其中，圖4a顯示了目的蛋白在od280nm洗脫峰圖。圖4b顯示了過分子篩層析柱后的hido2蛋白sds-page分析結果。圖4b中，泳道m(xù)：proteinmarker；泳道1-14：目的蛋白洗脫液，其中泳道7-8為峰值處蛋白收集液。

圖5顯示了待測ido2抑制劑對ido2活性的抑制情況。

圖6顯示了典型的判斷抑制類型的dixon圖。其中，圖6a、6b顯示了競爭性抑制劑的dixon圖，圖6c、6d顯示了混合型競爭抑制劑的dixon圖，圖6e、6f顯示了非競爭抑制劑的dixon圖，圖6g、6h顯示了反競爭抑制劑的dixon圖。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)了一種快速、可靠的檢測ido2活性的方法。實驗表明，通過控制反應的ph、底物的濃度和離心的條件，可以在酶水平檢測ido2活性。本發(fā)明的方法便捷、高效，結果可靠，可以用于ido2抑制劑的篩選。在此基礎上，完成了本發(fā)明。

術語

如本文所用，“hido2”是指人的吲哚胺2，3-雙加氧酶。

吲哚胺2，3-雙加氧酶

吲哚胺2，3-雙加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1,ido1)是哺乳動物中催化色氨酸沿著犬尿氨酸途徑(kynureninepathway)代謝的第一個限速酶。研究表明ido1在多種腫瘤組織中有高表達，可以通過降低腫瘤微環(huán)境中色氨酸濃度來抑制淋巴細胞的增殖，在腫瘤免疫逃逸中起到重要作用。

如本文所用，“吲哚胺2，3-雙加氧酶2”，即indoleamine2,3-dioxygenase2(ido2)，是2007年發(fā)現(xiàn)的一種在編碼基因序列、分子結構及生物活性上與ido1相似的酶。ido2位于ido1基因的下游，在氨基酸水平上，人ido1和ido2約有43％的同一性。此外，ido2還具有不同于ido1的表達特性，ido2主要在腎小管，肝臟和精子中表達，但ido1和ido2均通過抗原呈遞樹突狀細胞進行表達。研究表明，ido1和ido2具有不同的表達模式和不同的動力學特性，因此，ido2可能具有不同于ido1的功能。有研究發(fā)現(xiàn)在胃癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌的癌組織中有ido2的表達。

sorensen的研究以及munn等用ido1陽性的樹突狀細胞和t淋巴細胞混合培養(yǎng)，用ido1、ido2特異性抑制劑d-1-甲基色氨酸(dextro-1-methyltryptophan，d-1mt)、l-1-甲基色氨酸(levo-1-methyltryptophan，l-1-mt)處理細胞后發(fā)現(xiàn)t細胞都有增殖的表現(xiàn)，說明抑制了ido1或ido2的活性后對淋巴細胞的增殖有促進作用。而hou等研究發(fā)現(xiàn)，在用黑色素瘤研究中，用ido2的特異性抑制劑d-1-mt和環(huán)磷酰胺連用有明顯的縮小腫瘤的效果，比ido1的特異性抑制劑l-1-mt的效果明顯。而且在d-1-mt組生存率也得到明顯的延長。研究結果表明抑制ido2比抑制ido1在延緩腫瘤生長、減小腫瘤方面更有效果，推測其在免疫耐受中也起到重要作用。

merlo等研究發(fā)現(xiàn)與野生型類風濕性關節(jié)炎小鼠相比，ido2基因敲除的小鼠體內(nèi)致病性自免疫抗體及抗體分泌細胞減少，關節(jié)炎癥狀減輕，而ido1基因敲除的小鼠則無此現(xiàn)象，表明ido2是自體抗體產(chǎn)生及炎癥發(fā)生的重要介導分子。

檢測ido2活性的方法

本發(fā)明提供了一種非診斷性地檢測ido2活性的方法，包括步驟：

(i)提供一待測ido2樣品，；

(ii)在ph7.2-7.8的緩沖體系中，將待測樣品與濃度為5-500mmol/l的l-色氨酸進行反應；

(iii)終止反應并保溫，8000-20000g離心；

(iv)顯色后，檢測反應體系的吸光度。

為更好地理解本發(fā)明的檢測方法，提供一種典型的檢測ido2活性的方法，該方法并不限制本發(fā)明保護范圍。

500μl的標準檢測體系中，將50mmol/l磷酸鉀緩沖液(ph7.5)、200μg/ml過氧化氫酶、40mmol/l抗壞血酸、20μmol/l亞甲基藍、適宜濃度(10-50mmol/l)的底物l-色氨酸混合，混合液于37℃水浴5min后向上述混合液中加入ido2,37℃反應30min，酶促反應結束后加入200μl30％(w/v)三氯乙酸終止反應，然后在65℃水浴鍋中加熱15min，使反應產(chǎn)物完成從n-甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化。13800×g離心10min，吸取上清100μl與等體積的2‰(w/v)對二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液充分混勻，犬尿氨酸可與該溶液反應并使混合液變?yōu)辄S色，使用酶標儀在492nm處檢測其吸光度。

本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：

(a)本發(fā)明的方法便捷、高效，結果可靠。

(b)本發(fā)明的方法可以用于篩選ido2抑制劑。

(c)本發(fā)明的方法可以用于判斷ido2抑制劑的抑制類型、ki值。

(d)本發(fā)明的方法可以用于在酶水平及細胞水平分別測定抑制劑的ic50值。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

實施例1

重組質(zhì)粒pet28a-hido2的構建

本發(fā)明擴增了不同大小的兩個目的基因hido2，分別是全長1263bp的hido2(1)(seqidno.:5)、去除了終止密碼子并從編碼序列5’端去除39bp的長度為1221bp的hido2(2)(seqidno.:6)。

利用上海近岸蛋白生物科技有限公司novorecpcr一步定向克隆(無縫克隆)技術手冊設計pcr引物：引物包括5’端不少于15bp的與載體同源的序列以及20-25bp的目的片段特異性序列，使得到的目的片段兩端有不少于15bp的序列與線性化載體的兩端一致。

擴增hido2(1)的引物為：

f1：5’-cgcgcggcagccatatgatgttgcattttcattattatgatac-3’(seqidno.:1)

r1：5’-gtggtggtggtgctcgagctaaccacgtgggtgaaggattgac-3’(seqidno.:2)

擴增hido2(2)的引物為：

f2：5’-agaaggagatataccatggagccccacagaccgaatgtgaag-3’(seqidno.:3)

r2：5’-gtggtggtggtgctcgagaccacgtgggtgaaggattgactc-3’(seqidno.:4)

2)分別以hido2(1)和hido2(2)的cdna為pcr模板，利用primestarmaxdna聚合酶進行pcr反應獲得目的片段，反應條件為：98℃預變性3min，98℃、10s，55℃、12s，72℃、3min，34個循環(huán)；72℃延伸10min。利用膠回收試劑盒回收pcr擴增產(chǎn)物并進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

3)將質(zhì)粒pet28a用限制性內(nèi)切酶雙酶：與hido2(1)連接的pet28a用ndei、 xhoi酶切；與hido2(2)連接的pet28a用ncoi、xhoi酶切。酶切體系20μl，包括ncoi、xhoi(或ndei、xhoi)各1μl，10×fastdigestbuffer2μl，pet28a10μl，用dnase-free水補齊體積至20μl，37℃水浴酶切1.5小時。反應結束后利用膠回收試劑盒回收線性化質(zhì)粒大片段，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

4)將回收后的hido2(1)與hido2(2)分別與步驟3中線性化的pet28a以3:1-10:1的摩爾比加入pcr管中，并加入novorec重組酶及相應buffer，混勻后在37℃水浴反應20min，反應結束后立刻將重組反應液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞中，37℃恒溫箱中培養(yǎng)過夜，次日挑取選擇性平板上中等大小克隆在含抗生素的lb培養(yǎng)基中擴增，抽提質(zhì)粒，進行雙酶切驗證，并將鑒定正確的陽性克隆送至專業(yè)公司測序。hido2(1)與hido2(2)與pet28a連接后構建的重組載體分別標記為pet28a-hido2(1)和pet28a-hido2(2)。

結果如圖1所示，重組質(zhì)粒pet28a-hido2(1)和pet28a-hido2(2)構建正確，同時，測序結果也表明上述質(zhì)粒構建正確。

實施例2

人源ido2蛋白的獲得

1)篩選重組質(zhì)粒的篩選

將測序驗證正確的2種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，涂平板，37℃恒溫箱中培養(yǎng)過夜，次日從選擇性轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取單克隆分別于含有50μg/ml卡那霉素的10mllb細菌培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。取1ml培養(yǎng)物加入到同樣的50mllb培養(yǎng)基中，37℃孵育至菌液密度在600nm處的od值達到0.6時將溫度降至室溫并加入終濃度為0.5mmol/l的5-ala溶液、0.05mmol/l的iptg溶液，室溫誘導表達過夜。取適量未誘導、iptg誘導后的菌用干浴鍋煮蛋白，sds-page電泳分析并用考馬斯亮藍染色。

結果如圖2a所示，與未誘導組和pet28a-hido2(1)誘導組相比，重組質(zhì)粒pet28a-hido2(2)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達目的蛋白的量更多。

2)iptg誘導濃度的確定

重組質(zhì)粒pet28a-hido2(2)轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞，iptg設置0.025、0.05、0.1mmol/l三個濃度梯度，其他所有培養(yǎng)條件同上，誘導結束 后菌體總蛋白進行sds-page電泳分析并用考馬斯亮藍染色。

結果如圖2c所示，與未誘導組和其他誘導濃度相比，0.05mmol/liptg誘導條件下，目的蛋白的表達量更多。

3)目的蛋白westernblot鑒定

取適量未誘導菌、iptg誘導后的分別轉(zhuǎn)化pet28a-hido2(1)和pet28a-hido2(2)的重組菌，超聲破碎，提取細胞總蛋白，經(jīng)bca法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品及蛋白marker點樣進行sds-page電泳，電泳結束后將page膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到pvdf膜上，5％脫脂牛奶常溫封閉2h。加入hido2一抗(1:200)、gapdh一抗(1:2000)，4℃孵育過夜，經(jīng)pbst(含0.3％tween-20的pbs溶液)溶液洗膜三次，每次10min，然后加入相應的二抗(1:1000)室溫緩慢震蕩1h，pbst洗膜后用化學發(fā)光試劑盒顯色。

結果如圖2b所示，重組質(zhì)粒pet28a-hido2(1)和pet28a-hido2(2)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌均可以表達目的蛋白，且后者表達目的蛋白的量更多。

4)目的蛋白大規(guī)模表達

重組質(zhì)粒pet28a-hido2(2)轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞，次日從選擇性轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取單克隆于含有50μg/ml卡那霉素的50mllb細菌培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。取40ml培養(yǎng)物加入到同樣的1960mllb培養(yǎng)基中，37℃孵育至菌液密度在600nm處的od值達到0.6時將溫度降至室溫并加入終濃度為0.5mmol/l的5-ala溶液、0.05mmol/l的iptg溶液，室溫誘導表達過夜。4℃、5400×g離心10min收集菌體，再用適量預冷的含有終濃度1mmol/lpmsf的pbs重懸菌體，相同條件再次離心，并將收集的菌體-80℃條件下凍存或立即進行下一步的純化。

5)hido2蛋白純化：

用適量預冷的pbs(含1mmol/lpmsf)重懸步驟4)中制備的菌體，高壓破碎(1500bar)；4℃、13800×g離心30min，取上清。將上清流經(jīng)預先用含10mmol/l咪唑的磷酸鹽緩沖液(20mmol/l，ph7.5，包含150mmol/lnacl)平衡過的5ml預裝ni-nta親和層析柱(美國gehealthcare公司)，蛋白掛柱后用10個柱體積的含20mmol/l咪唑的磷酸鹽緩沖液洗去非特異性結合的雜蛋白，再用elutionbuffer(含250mmol/l咪唑的磷酸鹽緩沖液)洗脫下目的蛋白。將得到的hido2蛋 白用10000da超濾離心管(millipore)濃縮至約5ml，得到初步純化的hido2蛋白。取適量上述初步純化的hido2，干浴鍋煮蛋白，sds-page電泳分離并用考馬斯亮藍染色，然后脫色檢測。其余的hido2在aktapurifier蛋白快速純化系統(tǒng)上進行分子篩層析純化，將初步純化的蛋白上柱到預冷的1×pbs平衡的柱子中，在最大od280nm洗脫峰收集洗脫液。蛋白上柱量為5ml。

脫色檢驗結果如圖3所示，比較泳道1和2，可以看出用0.05mmol/liptg誘導后，誘導組在45kda左右有非常明顯的目的蛋白ido2的條帶，且該條帶與文獻報道的人源ido2蛋白分子量大小一致；另從泳道3可以看出菌體裂解后，上清液中含有絕大部分的目的蛋白，將上清流過鎳柱后，上清流出液以及20mmol/l咪唑的磷酸緩沖液洗脫下的液體中均為雜蛋白，不含目的蛋白，最后用250mmol/l咪唑的磷酸緩沖液洗脫下的液體中含有大量目的蛋白hido2。

分子篩層析純化結果如圖4a所示，hido2的洗脫峰在洗脫22ml至31ml時出現(xiàn)，280nm光吸收峰的總峰面積為1470.2mau×ml，hido2的峰面積為1389.3mau×ml，hido2的峰面積占總峰面積的比例約為94.5％，即hido2通過分子篩層析純度達到了94.5％，純度較高。

將目的蛋白的峰尖收集液進行sds-page電泳分析，電泳結果如圖4b所示，經(jīng)過分子篩層析純化步驟后，目的蛋白hido2的純度得到較大程度提高，泳道1-14基本看不到雜蛋白條帶，純度與蛋白峰面積計算出的純度值一致。

實施例3

酶水平hido2活性檢測體系的建立

500μl的標準檢測體系中，將50mmol/l磷酸鉀緩沖液(ph7.5)、200μg/ml過氧化氫酶、40mmol/l抗壞血酸、20μmol/l亞甲基藍、適宜濃度的底物l-色氨酸、待測ido2抑制劑(任選地，在進行抑制劑篩選、定性時加入)混合，混合液于37℃水浴5min后向上述混合液中加入hido2，37℃反應30min，酶促反應結束后加入200μl30％(w/v)三氯乙酸終止反應，然后在65℃水浴鍋中加熱15min，使反應產(chǎn)物完成從n-甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化。離心10min，吸取上清100μl與等體積的2‰(w/v)對二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液充分混勻，犬尿氨酸可與該溶液反應并使混合液變?yōu)辄S色，使用酶標儀在492nm處檢測其吸 光度。

首先利用上述酶活性檢測體系篩選了hido2活性檢測的底物濃度范圍：本領域人源ido1酶活性檢測一直用的底物濃度為150-350μm,反應結束后檢測產(chǎn)物的量其a492值0.3-0.7之間；用上述濃度的底物來檢測hido2反應結果一直很不理想，a492值始終在0.04-0.06之間，即使將底物濃度提高到之前最高濃度的3倍(1.05mm)，產(chǎn)物a492值也沒有明顯提高。經(jīng)過反思、數(shù)次實驗將底物濃度不斷加倍提高，終于發(fā)現(xiàn)對于hido2活性檢測來說底物l-色氨酸濃度要在5mm(a492值0.08-0.09)以上，更優(yōu)的條件是在10mm(a492值大于0.1)以上，最優(yōu)為15-40mm，底物略過量保證產(chǎn)物的生成。

其次，本領域通用的檢測人源ido1的方法中，65℃水浴反應終止后混合液較澄清，之后的離心步驟用的是6000×g即可；而在hido2活性檢測過程中，為了保證產(chǎn)物生成量，底物濃度是略過量的，65℃水浴反應之后混合液有明顯的渾濁現(xiàn)象，經(jīng)過數(shù)次改變離心速度發(fā)現(xiàn)在8000g及以上的速度可以得到澄清的上清液，較佳地在13800×g的速度離心，以便進行下一步的顯色反應。

再者，在上述底物濃度、離心速度確定了的基礎上，驗證hido2活性檢測的最適ph：在500μl的標準檢測體系中加入濃度為40mm的底物l-trp及適量hido2，其他處理同上，分別在ph6.5(通用的ido1檢測ph)和ph7.5條件下進行酶促反應(每個ph設定5個重復)，反應結束后用酶標儀檢測犬尿氨酸產(chǎn)生的黃顏色在492nm處的吸收值。

測定結果：底物濃度及其他實驗處理相同，ph7.5條件下生成產(chǎn)物的量(a492值0.68)約為ph6.5條件下(a492值0.07)的十倍，表明hido2酶促反應在ph為7.5時進行檢測最為合適。

綜上所述，確定了最適ido2酶活檢測條件，其中，底物l-色氨酸濃度要在10mm(a492值大于0.1)以上，較佳地為15-40mm，底物略過量保證產(chǎn)物的生成；反應終止后的離心速度為13800×g，以保證上清液澄清；此外，反應體系的ph在7.5左右，此時的產(chǎn)物生成量最高，檢測準確，靈敏度高。在以下實施例中，均按該最適ido2酶活檢測條件進行檢測。

實施例4

酶水平ido2抑制劑的初步篩選

在實施例3所述的500μl檢測體系(ph7.5)中，加入適宜濃度的底物l-色氨酸(0-40mm)以及終濃度均為10μm的待測ido2抑制劑(包括本發(fā)明化合物、l-1-mt和d-1-mt)混合，混合液于37℃水浴5min后向上述混合液中加入ido2，37℃反應30min，酶促反應結束后加入200μl30％(w/v)三氯乙酸終止反應，然后在65℃水浴鍋中加熱15min，使反應產(chǎn)物完成從n-甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化。138000×g離心10min，吸取上清100μl與等體積的2‰(w/v)對二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液充分混勻，犬尿氨酸可與該溶液反應并使混合液變?yōu)辄S色，使用酶標儀在492nm處檢測其吸光度。

本實施例的待測ido2抑制劑包括本領域體內(nèi)外實驗通用的ido2抑制劑l-1-mt、d-1-mt(均為市售)、以及選自下組的化合物(按常規(guī)方法合成)：

初篩結果如圖5所示，本發(fā)明9個化合物對ido2的抑制率均顯著高于l-1-mt和d-1-mt(抑制率均小于8％)。其中，化合物8對ido2的抑制效果最好，抑制率63％；其余化合物對ido2抑制率為18％-47％。本實施例化合物初篩結果為后續(xù)ic50值、ki值測定以及抑制類型判定提供了數(shù)據(jù)驗證的基礎。

實施例5

ido2抑制類型及ki值的測定

在實施例3所述的500μl檢測體系(ph7.5)中，分別加入不同濃度(20、30、40mm或20、25、35mm)的底物l-色氨酸，并在每一個底物濃度下，加入不同濃度梯度的待測抑制劑，對照組不加抑制劑，混合液于37℃水浴5min后加入10μlhido2(約1μm),37℃反應30min，酶促反應結束后加入200μl30％(w/v)三氯乙酸終止反應，然后在65℃水浴鍋中加熱15min，使反應產(chǎn)物完成從n-甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化。138000×g離心10min，吸取上清100μl與等體積的2‰(w/v)對二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液充分混勻，犬尿氨酸可與該溶液反應并使混合液變?yōu)辄S色，使用酶標儀在492nm處檢測其吸光度。以dixon作圖法(1/v～[i])判定抑制劑類型；以[s]/v～[i]作圖，可以得到抑制劑的ki值。一種典型的判斷抑制類型的dixon圖如圖6所示，其中圖6a、6b顯示了競爭性抑制劑的dixon圖，圖6c、6d顯示了混合型競爭抑制劑的dixon圖，圖6e、6f顯示了非競爭抑制劑的dixon圖，圖6g、6h顯示了反競爭抑制劑的dixon圖。

本實施例的待測抑制劑與實施例4相同。

結果如下表所示：抑制劑l-1-mt和d-1-mt均為ido2的競爭性抑制劑，并且d-1-mt的ki值約為l-1-mt的ki值的10倍，此趨勢與參考文獻pantouris等的研究結果中數(shù)據(jù)趨勢一致，驗證了本發(fā)明檢測體系的可靠性。此外，化合物1-9的ki值均比d-1-mt或l-1-mt的ki值小很多，其中對hido2抑制效果最好的是化合物8，化合物8為反競爭抑制劑，其ki值達到納摩爾水平(0.97μm，即970nm)；其次為化合物2和化合物3，均為反競爭抑制劑，ki值分別為3.51、5.62μm，均小于10μm；抑制效果較差為化合物4，為反競爭抑制劑，ki值為105.1，約為l-1-mt的1/4。本發(fā)明的檢測方法，可以用于多種化合物抑制類型的檢測，并且可以檢測的ki值范圍大，適用于范圍廣。

注：nd：沒有測出。

實施例6

半數(shù)有效抑制濃度ic50值的測定

在實施例3所述的500μl檢測體系中，加入30mm的底物l-色氨酸及不同濃度梯度的抑制劑，對照組不加抑制劑，在最適的檢測條件下進行ido2酶活檢測，反應條件和檢測方法與實施例3相同。以抑制率對抑制劑濃度作圖，利用改良寇氏法計算出ic50值。

本實施例的待測抑制劑與實施例4相同。

測定結果表明：d-1-mt在酶水平抑制ido2的ic50值為262.75，遠高于l-1-mt的ic50值，與現(xiàn)有研究結果的趨勢一致?；衔?-9中，化合物4、6、7的ido2抑制效果較差，ic50值與l-1-mt相近，其余化合物的ic50值均比較低，其中，化合物8、化合物2、化合物3的酶水平的ic50值分別為1.87、7.68、8.26μm(均小于10μm)，分別為l-1-mt的酶水平ic50值的1/30、1/8、1/7，表明上述三種化合物在酶水平對hido2的抑制活力分別是l-1-mt的約30倍、8倍和7倍。本發(fā)明的檢測體系可以有效檢測不同抑制活性的化合物，并可用于ido2抑制劑的篩選。

本發(fā)明中所有數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗(每次實驗同一化合物設定3個重復)的均值。每組實驗數(shù)據(jù)經(jīng)公式計算相對標準偏差rsd(相對偏差/平均值)均小于1.5％，表明我們的數(shù)據(jù)重復性、再現(xiàn)性較好。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。