本發(fā)明涉及一種高效煙草花粉活力檢測方法，屬于煙草良種繁育技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在煙草雜交制種中，通常需要早期采集父本花粉，經(jīng)過一段時間儲藏，當花粉需求量較大時，可保障花粉的充足供應(yīng)；或為了減少父本種植量，當年采集的花粉經(jīng)低溫干燥儲藏可多年使用，經(jīng)過長期儲藏的花粉在使用之前，都必須做花粉活力檢測，花粉活力鑒定方法的選擇顯得至關(guān)重要。

據(jù)資料報道，花粉活力鑒定方法主要分三類：一類是染色法，如氯化三苯基四氮唑(ttc)染色法、碘鉀(i-ki)染色法、熒光染色法、甲基蘭染色法等；二類是花粉離體萌發(fā)測定法，如葡萄糖花粉萌發(fā)培養(yǎng)法、蔗糖花粉萌發(fā)培養(yǎng)法等；三類是花粉授粉結(jié)實檢測法。碘鉀(i-ki)染色法、熒光染色法由于能使未成熟和衰老的花粉著色，而這些花粉不一定具有受精能力，致使花粉活力測定值偏高；花粉授粉結(jié)實檢測法是根據(jù)結(jié)實情況判斷花粉活性，結(jié)果比較準確，但由于授粉到每個柱頭的花粉量較多，無法定量判斷花粉的活力；花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)檢測花粉活力是目前得到認可的較為準確的檢測方法。

煙草花粉活力是指煙草花粉在特定條件下進行離體培養(yǎng)能夠萌發(fā)并形成有效花粉管(花粉管長度在花粉粒直徑1倍以上)，試驗過程中發(fā)現(xiàn)在花粉離體培養(yǎng)液中添加適宜濃度的硼酸和鈣離子能有效促進花粉管的形成。煙草花粉活力用百分數(shù)表示，即所檢測花粉能形成有效花粉管的花粉粒數(shù)占總花粉粒數(shù)的百分比。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種高效煙草花粉活力檢測方法。采用該方法，可以快速準確檢測煙草花粉活力，在煙草雜交制種過程中，為花粉的采集、儲藏利用提供技術(shù)保障。

技術(shù)方案具體步驟如下：

1)花粉萌發(fā)培養(yǎng)液的配制：分別取蔗糖100g、硼酸150mg、氯化鈣20mg分別用蒸餾水溶解，定溶于1l的定溶瓶中備用；或取葡萄糖30g、硼酸50mg、氯化鈣20mg用蒸餾水溶解，定溶于1l的定溶瓶中備用。兩種配方可任選其一。

2)載玻片的制作：取1-2滴培養(yǎng)液滴于凹形載玻片上，將少量待檢花粉與培養(yǎng)液均勻混合，蓋上蓋玻片。每批次制作三個載玻片。

3)花粉萌發(fā)培養(yǎng)：將步驟2)中載玻片，放入墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿，再將培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，暗箱保濕培養(yǎng)3h。

4)花粉活力觀察：將步驟3)中載玻片置于三目生物顯微鏡下觀察，顯微倍數(shù)為100倍。每次觀察4個視野，在每個視野內(nèi)分別統(tǒng)計花粉?？倲?shù)和能夠萌發(fā)并生長出有效花粉管的花粉粒數(shù)。

5)花粉活力統(tǒng)計：計算步驟4)中每個載玻片各個視野觀察到的能夠萌發(fā)并生長出有效花粉管的花粉粒數(shù)的總和占各個視野觀察到的花粉粒數(shù)總和的百分比，即得到每個載玻片的花粉活力，計算3個載玻片的花粉活力的平均值，即得到該批次煙草花粉活力。計算公式為：

每個載玻片花粉活力％＝(∑每個視野能夠萌發(fā)并生長出有效花粉管的花粉粒數(shù)/∑每個視野花粉粒總數(shù))×100。

每批次花粉的花粉活力％＝∑每個載破片花粉活力/3。

本發(fā)明方法中，花粉萌發(fā)是指花粉在培養(yǎng)過程中能夠形成有效花粉管，花粉管的長度須達花粉粒直徑1倍以上，花粉管長度小于花粉粒直徑即視為無花粉活力?；ǚ刍盍Ψ譃?個級別：

花粉活力差：≤40％。

花粉活力較差：＞40％，≤60％。

花粉活力中等：＞60％，≤80％

花粉活力強：＞80％。

有益效果

(1)以本發(fā)明方法檢測煙草花粉活力，可以快速準確檢測花粉活力大小。

(2)經(jīng)本發(fā)明檢測的花粉可以保障花粉的質(zhì)量，提高雜交制種的座果率，排出因花粉質(zhì)量問題造成制種產(chǎn)量損失的可能。

(3)本發(fā)明較其他檢測方法便于觀察計數(shù)，結(jié)果準確可靠，優(yōu)勢更明顯。

本發(fā)明適用于烤煙、白肋煙、馬里蘭煙等煙草花粉活力檢測。

附圖說明

圖1是ttc染色法花粉粒染色顯微鏡觀察圖。

圖2是實施例中各處理方法的花粉活力柱形圖。

圖3是10％蔗糖+150mg/l硼酸+20mg/cacl2培養(yǎng)花粉粒萌發(fā)顯微鏡觀察圖。

圖4是3％葡萄糖+50mg/l硼酸+20mg/cacl2培養(yǎng)花粉粒萌發(fā)顯微鏡觀察圖。

圖中，1為著色具有活力的花粉粒，2為未著色無活力的花粉粒，3為正常萌發(fā)并能形成有效花粉管的花粉粒，4為未萌發(fā)無活力的花粉粒。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。下述實施方式中所使用實施步驟如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

共設(shè)15種不同的花粉檢測鑒定方法以及不同的培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度(處理設(shè)計方法見表1.)。供試材料為burley37新鮮花粉，每處理設(shè)三次重復(fù)，每重復(fù)觀察4個視野。

表1不同花粉檢測鑒定處理方法

按照不同的處理方法，分別配制培養(yǎng)液，制作載玻片，恒溫保濕暗箱培養(yǎng)，在三目生物顯微鏡下觀察，每個載玻片觀察4個視野，統(tǒng)計各處理方法的花粉活力。

ttc染色法是利用有活性花粉粒在呼吸作用過程中產(chǎn)生的nadh2或nadph2將無色的ttc還原成紅色的ttf而使花粉粒染成紅色，無活力的花粉呼吸作用較弱，ttc的顏色變化不明顯，不能使花粉粒著色，見圖1。ttc染色法更適用于新鮮花粉的活力檢測，對于過分干燥或經(jīng)長期干燥低溫保存的花粉其花粉呼吸作用較弱，染色效果不理想。其特點是簡便快捷，但重復(fù)性差，色度的深淺不易分辨，影響對花粉活力的判斷。

葡萄糖及蔗糖萌發(fā)發(fā)芽檢測法是比較可靠和準確的煙草花粉活力鑒定方法，但需要加入適宜濃度的硼酸和鈣離子，以促進花粉管的形成，判定花粉活力。在未加入硼酸和鈣離子的葡萄糖及蔗糖溶液中培養(yǎng)花粉，只能使花粉粒的萌發(fā)孔形成小凸起，或花粉粒膨脹后破裂，內(nèi)容物溢出，形成花粉管的數(shù)量較少，無法判定花粉真實活力。

從上述實驗結(jié)果(見圖2)可以看出，處理a(ttc法)檢測新鮮花粉活力較高，可達74.8％，比較接近實際新鮮花粉活力水平，但實驗的重復(fù)性差，著色深淺不易分辨，按照此方法檢測出的花粉活力可信度不高；處理n、o兩種方法檢測新鮮花粉活力可達86.8％、91.3％，與實際新鮮花粉活力非常相近，實驗結(jié)果認為采用該兩種處理方法檢測出的花粉活力可信度高。其余方法檢測出新鮮花粉活力在6.6％-45.4％之間，與實際新鮮花粉活力水平相差較大，其檢測結(jié)果準確性差。

綜合分析實驗結(jié)果，培養(yǎng)液采用10％蔗糖+150mg/l硼酸+20mg/cacl2(見圖3)或3％葡萄糖+50mg/l硼酸+20mg/cacl2(見圖4)，制作載玻片，在25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，暗箱保濕培養(yǎng)3h的處理方法是鑒定花粉活力最好，最可靠的方法。

上述實施例僅為本發(fā)明的較佳方式，凡采用本發(fā)明申請專利范圍所做的等同替換或均等變化應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。