一種旱柳優(yōu)樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基及用于測(cè)定旱柳花粉活力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種旱柳優(yōu)樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基及測(cè)定旱柳花粉活力的方法，屬于 生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 旱柳（Salix matsudana Koidz)為楊柳科、柳屬喬木。旱柳枝條柔軟，樹冠豐滿， 是中國(guó)北方常用的庭蔭樹、行道樹。常栽培在河湖岸邊或孤植于草坪，對(duì)植于建筑兩旁。亦 用作公路樹、防護(hù)林及沙荒造林，農(nóng)村"四旁"綠化等，是早春密源樹種。防護(hù)林及綠化樹 種，亦可作用材樹種。樹形美，易繁殖，深為人們喜愛。其柔軟嫩綠的枝條、豐滿的樹冠及稍 加修剪的樹姿，更加美觀。適合于庭前、道旁、河堤、溪畔、草坪栽植。在北方園林，柳屬的一 些綠化樹種是落葉樹種中綠期最長(zhǎng)的一種。為了妥善保存和合理利用山東的柳樹資源，我 們自2012年以來對(duì)山東各地的柳樹資源進(jìn)行了全面調(diào)查，重點(diǎn)調(diào)查了年齡較大的喬木柳 樹，共選擇優(yōu)樹（Plus tree) 96株，其中83株為旱柳，并進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
[0003] 柳樹花粉包含的基因類型，具有豐富的遺傳多樣性，是種質(zhì)保存和交換以及雜交 育種的重要材料。在柳樹的雜交育種工作中，研究花粉的生活力和育性是必不可少的基礎(chǔ) 性工作。柳樹雄雌異株，為了解決親本花期不一致或遠(yuǎn)距離雜交的困難，更需要保存花粉 的活力。在使用采集和貯存花粉之前，通常要做花粉生活力的鑒定。因此，掌握柳樹花粉 生活力的測(cè)定方法，對(duì)于提高柳樹育種效率具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 花粉是自然條件下的種子植物進(jìn)行雜交遺傳信息交流的載體，了解花粉活力的測(cè) 定方法和花粉保存的條件，有助于進(jìn)行雜交育種的相關(guān)工作?；ǚ凵盍﹄S植物品種不同 而不同，同時(shí)隨外界溫度、濕度、貯藏方式與方法等的影響而變化。測(cè)定花粉生活力的方法 有很多種，如形態(tài)檢驗(yàn)法、染色檢驗(yàn)法、無機(jī)酸測(cè)定法、活體萌發(fā)測(cè)定法、田間授粉檢驗(yàn)法等 (王文莉，2004)，檢驗(yàn)方法不一樣，測(cè)定出的花粉活力也有一定的差異。
[0005] 花粉離體萌發(fā)與花粉管顯微觀測(cè)的結(jié)果較為穩(wěn)定，更能反應(yīng)花粉的發(fā)育狀況和實(shí) 際活力，被認(rèn)為是效果最好、最接近原始結(jié)果的方法（趙宏波等，2007)。但花粉離體萌發(fā)需 要適宜的培養(yǎng)基，否則也難以取得理想的效果。不同植物花粉萌發(fā)需要的培養(yǎng)基種類和濃 度不同，往往要對(duì)基本培養(yǎng)基進(jìn)行篩選或改良。目前，關(guān)于旱柳花粉離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培 養(yǎng)條件還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種旱柳優(yōu)樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基及其 用于測(cè)定旱柳花粉活力的方法，通過篩選、改良培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)條件，解決旱柳花粉離體 萌發(fā)率低的問題，使得旱柳花粉的萌發(fā)率得到大幅度提高，從而提供可靠、有效的測(cè)定旱柳 花粉活力的方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0008] -種旱柳優(yōu)樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基，是以蒸餾水為溶劑，其成分含有8_12g/L的 瓊脂、140-160g/L的蔗糖和0· 1-0. 3g/L的硼酸。
[0009] 優(yōu)選的，該旱柳優(yōu)樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基，是以蒸餾水為溶劑，其成分含有10g/L 的瓊脂、150g/L的蔗糖和0. 2g/L的硼酸。
[0010] 本發(fā)明的旱柳優(yōu)樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的制備方法，步驟如下：
[0011] 將瓊脂加入到蒸餾水中，隔水加熱，溶解后，加入蔗糖和硼酸，攪拌后即成滅菌培 養(yǎng)液；將配好的滅菌培養(yǎng)液趁熱用取樣器滴一滴于載玻片凹槽中央，使其慢慢擴(kuò)散成一略 帶弧度的平面且基本完全鋪滿凹槽，弧面需盡量薄，冷凝后即為旱柳花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基。
[0012] 上述旱柳優(yōu)樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基用于測(cè)定旱柳花粉活力的方法，包括以下步 驟：
[0013] ⑴花粉采集
[0014] 選取發(fā)育正常、無病蟲危害、生長(zhǎng)健壯的旱柳植株，從樹冠中上部剪取直徑 1-2. 5cm、長(zhǎng)1-1. 5m的花枝，在溫度20-25°C，相對(duì)濕度60-70%條件下水培；待雄花序下端 有少量的熟花粉散落時(shí)，收集花粉，放入干燥器內(nèi)，于〇_5°C條件下貯藏；
[0015] (2)花粉離體培養(yǎng)
[0016] 將花粉從干燥器中取出，在0_5°C的溫度和50-90%的相對(duì)濕度條件下，使其吸水 20-28h，將吸水后的花粉均勻撒在位于載玻片上的旱柳花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基上，然后將載 玻片置入有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，并置于25°C的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0017] (3)花粉活力的測(cè)定
[0018] 保持上述溫度條件促使花粉管生長(zhǎng)，離體培養(yǎng)4-10h后，將載玻片在顯微鏡下觀 察，進(jìn)行花粉萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)，以花粉管長(zhǎng)度大于花粉粒直徑為花粉萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每處理重復(fù)3次 以上，每重復(fù)隨機(jī)觀察3~5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率以反映有活力的花粉所占比例。
[0019] 步驟⑵中，花粉的吸水時(shí)間優(yōu)選為24h。
[0020] 步驟（2)中，恒溫光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25°C，光照強(qiáng)度為 50001x〇
[0021] 步驟（3)中，花粉萌發(fā)率的計(jì)算公式為：花粉萌發(fā)率（％) =(萌發(fā)花粉數(shù)/總花 粉數(shù)）X 100%。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] (1)本發(fā)明通過對(duì)離體萌發(fā)培養(yǎng)基的組成和花粉離體的培養(yǎng)條件進(jìn)行了篩選和優(yōu) 化組合，從而更加適合于旱柳花粉的離體萌發(fā)和正常生長(zhǎng)，旱柳優(yōu)樹花粉在本發(fā)明的旱柳 花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基上，溫度25°C，光照強(qiáng)度為50001χ的條件下培養(yǎng)，旱柳優(yōu)樹花粉萌發(fā) 最好，花粉管也能得到較好的生長(zhǎng)。
[0024] (2)與原有的鑒定方法如石蠟切片、形態(tài)觀察等相比，本發(fā)明利用該旱柳優(yōu)樹花粉 離體萌發(fā)培養(yǎng)基與花粉管生長(zhǎng)顯微觀測(cè)技術(shù)測(cè)定花粉活力的測(cè)定結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，花粉 萌發(fā)率反應(yīng)有活力花粉所占比例，花粉管生長(zhǎng)的觀察與測(cè)量反應(yīng)花粉粒發(fā)育是否正常及生 理狀況的優(yōu)劣，為旱柳花粉活力的測(cè)定提供了一種更加有效、可靠的方法。經(jīng)篩選、改良、優(yōu) 化組合和條件后，旱柳優(yōu)樹新鮮花粉的萌發(fā)率最大可接近70%，遠(yuǎn)高于原有文獻(xiàn)的報(bào)道。
【附圖說明】
[0025] 圖1為水培旱柳（商10)的雄花枝；
[0026] 圖2為旱柳（商19)花粉低溫冷藏24h培養(yǎng)6h的花粉萌發(fā)情況；
[0027] 圖3為旱柳（墾1)花粉低