本發(fā)明是涉及一種單酶生物傳感器，可以用于單分子dna的測(cè)序,也可用于檢測(cè)溶液中濃度極低的底物分子,屬于第三代dna測(cè)序器件。

背景技術(shù)：

dna測(cè)序技術(shù)是近代生命科學(xué)發(fā)展的重要里程碑之一。近十年來(lái)，低成本、高通量dna測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，引起了生命這一高度復(fù)雜系統(tǒng)中最為龐大、最為核心的核酸序列信息爆發(fā)性地增長(zhǎng)，使生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)面臨前所未有的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。生命遺傳密碼的徹底破譯將成為可能，遺傳信息大數(shù)據(jù)的普及將惠及到人類(lèi)社會(huì)每一個(gè)普通成員的生存和健康。

目前大量使用的新一代測(cè)序技術(shù)是所謂的第二代測(cè)序技術(shù)。該測(cè)序技術(shù)通過(guò)對(duì)被測(cè)核酸進(jìn)行平行擴(kuò)增，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，克隆出上百萬(wàn)固相化單鏈核酸模板片段，進(jìn)行高通量并行序列測(cè)定。第二代測(cè)序技術(shù)存在下列不足：(1)dna測(cè)序文庫(kù)制備需要較大量的起始dna樣本；(2)樣本的平行擴(kuò)增可能導(dǎo)致測(cè)序文庫(kù)制備的偏性；(3)制備測(cè)序文庫(kù)需要大量的分子生物學(xué)操作，文庫(kù)制備時(shí)間較長(zhǎng)，成本高；(4)通過(guò)dna生物合成反應(yīng)在dna測(cè)序模板上進(jìn)行逐個(gè)堿基閱讀，一次生化反應(yīng)僅能閱讀一個(gè)堿基且讀長(zhǎng)較短，這也是測(cè)序速度和通量難以提升的瓶頸；(5)測(cè)序結(jié)果報(bào)告周期長(zhǎng)。因此雖然第二代測(cè)序技術(shù)比第一代桑格測(cè)序技術(shù)在測(cè)序通量方面具有巨大優(yōu)勢(shì)，在不到十年時(shí)間內(nèi)使人類(lèi)個(gè)體基因組的測(cè)序成本下降了近萬(wàn)倍，但是與未來(lái)應(yīng)用于實(shí)際的需求相比，第二代測(cè)序技術(shù)仍然是一項(xiàng)昂貴的技術(shù)，不利于推廣應(yīng)用。

第三代測(cè)序技術(shù)是目前國(guó)際學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界追捧的對(duì)象。第三代測(cè)序技術(shù)有如下三個(gè)特點(diǎn)：(1)實(shí)現(xiàn)單分子dna測(cè)序。無(wú)需對(duì)測(cè)序?qū)ο筮M(jìn)行擴(kuò)增，能夠克服由基因擴(kuò)增引起的測(cè)序偏向性；(2)實(shí)現(xiàn)連續(xù)測(cè)序。也就是dna鏈上堿基的閱讀是不間斷的，這一特性不僅能夠大幅度提高測(cè)序速度，也會(huì)使dna的讀長(zhǎng)大幅度增加；(3)更低的測(cè)序成本。第三代測(cè)序技術(shù)在生化反應(yīng)中無(wú)需不斷加入生化試劑，測(cè)序沒(méi)有試劑成本。由上述三個(gè)特征可以看出，第三代測(cè)序技術(shù)的實(shí)現(xiàn)將會(huì)是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的又一里程碑，幫助人們隨時(shí)隨地、實(shí)時(shí)、低成本地獲取人體、環(huán)境各種各樣的核酸信息，隨時(shí)掌控生命體中遺傳與變異、表達(dá)與調(diào)控、感染和防衛(wèi)等事件，真正促進(jìn)4p和精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)現(xiàn)。

目前為止，第三代測(cè)序技術(shù)按原理可以分為三類(lèi)。

(1)成像測(cè)序法

通過(guò)高分辨率成像技術(shù)進(jìn)行核酸序列鑒定，是最早報(bào)導(dǎo)的單分子dna測(cè)序技術(shù)。早在1977年cole等通過(guò)鋨等配位化合物與堿基進(jìn)行特異性結(jié)合，并從電子顯微鏡上觀察到os點(diǎn)陣，獲得了單鏈dna影像(coleetal.molecularmicroscopyoflabeledpolynucleotides:stabilityofosmiumatoms.jmolbiol(1977)vol.117,387-400)。近二十多年來(lái)，有許多用掃描探針顯微鏡對(duì)核酸分子進(jìn)行顯微成像和堿基識(shí)別的報(bào)導(dǎo)，不過(guò)其識(shí)別的準(zhǔn)確度和速度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到dna測(cè)序的要求(driscolletal.atomic-scaleimagingofdnausingscanningtunnelingmicroscopy.nature(1990)vol.346,294-296；tanakaetal.partialsequencingofasinglednamoleculewithascanningtunnelingmicroscope(2009)vol.4,518-522)。

(2)合成測(cè)序法

本世紀(jì)初，美國(guó)加州理工發(fā)表了單分子合成測(cè)序的成果。在玻片上構(gòu)建單分子dna測(cè)序文庫(kù)，采用具有可切除封閉基團(tuán)的熒光標(biāo)記堿基進(jìn)行測(cè)序(harrisetal.single-moleculednasequencingofaviralgenome.science(2008)vol.320,106–109.)，但是該方法測(cè)序通量低、讀長(zhǎng)短、錯(cuò)誤率高且產(chǎn)品成熟度差，并沒(méi)有形成銷(xiāo)售。picbio等公司在核苷酸的磷酸分子上修飾熒光基團(tuán)，通過(guò)檢測(cè)合成過(guò)程中能夠自動(dòng)切除的熒光基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)單分子dna堿基的連續(xù)閱讀(eidetal.real-timednasequencingfromsinglepolymerasemolecules.science(2009)vol.323,133-138.)。為了提高單分子熒光檢測(cè)的靈敏度，其芯片采用z波導(dǎo)腔。該技術(shù)能夠自動(dòng)、快速、并行地實(shí)現(xiàn)單分子dna測(cè)序，但測(cè)序成本高、通量低，準(zhǔn)確性較差。

(3)納米孔測(cè)序法

納米孔測(cè)序方法使單鏈dna分子在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下穿過(guò)納米尺度的微孔，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)過(guò)孔電流的變化，識(shí)別過(guò)孔單鏈dna上的堿基(michael.oxfordnanoporeannouncementsetssequencingsectorabuzz.naturebiotechnol.(2012)vol.30,295–296.)。制備納米孔的材料可以采用天然的或經(jīng)改造的蛋白質(zhì)分子(如α溶血素(clarketal.continuousbaseidentificationforsingle-moleculenanoporednasequencing.naturenanotechnol.(2009)vol.4,265-270.)、msp蛋白(manraoetal.readingdnaatsingle-nucleotideresolutionwithamutantmspananoporeandf29dnapolymerase.naturebiotechnol.(2012)vol.30,349–353；cherfetal.automatedforwardandreverseratchetingofdnainananoporeatprecision.naturebiotechnol.(2012).vol.30,344–348.))，也可以使用微納加工制備的固態(tài)納米孔(如氮化硅(iqbaletal.solid-statenanoporechannelswithdnaselectivity.naturenanotechnol.(2007)vol.2,243-248.)、石墨烯(garajetal.grapheneasasubnanometertrans-electrodemembrane.nature(2010)vol.467,190-193.))。生物納米孔在單鏈dna分子堿基的準(zhǔn)確識(shí)別方面還存在技術(shù)瓶頸。固態(tài)納米孔由于孔徑的可控性和穩(wěn)定性、單鏈過(guò)孔速度、納米孔長(zhǎng)度等因素，尚未實(shí)現(xiàn)dna鏈單個(gè)堿基的識(shí)別。一些公司通過(guò)在納米孔上構(gòu)建場(chǎng)效應(yīng)器件、引入可檢測(cè)橫向隧道電流的對(duì)電極、組裝具有分子識(shí)別功能的分子基團(tuán)、增加熒光標(biāo)記分子等方法，試圖提高單堿基識(shí)別能力。

生命系統(tǒng)中存在著多種能夠高效精準(zhǔn)識(shí)別核酸堿基序列的蛋白質(zhì)分子。將蛋白質(zhì)分子在識(shí)別堿基時(shí)其分子構(gòu)象產(chǎn)生的微小變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，并進(jìn)行放大和快速測(cè)定，無(wú)疑是一種理想的測(cè)序方法。本發(fā)明就是針對(duì)目前單分子dna測(cè)序存在的成本高、準(zhǔn)確率低、重復(fù)性差等問(wèn)題，通過(guò)檢測(cè)dna聚合酶或rna聚合酶等蛋白質(zhì)分子在核酸合成過(guò)程中導(dǎo)電率的波動(dòng)情況，推斷單鏈核酸上的堿基序列，發(fā)展一種低成本、快速核酸測(cè)序器件。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)分子電子器件及其制備方法，利用該蛋白質(zhì)分子電子器件來(lái)實(shí)現(xiàn)快速、低成本的核酸測(cè)序或核酸分子的檢測(cè)。

當(dāng)酶與底物反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)構(gòu)象漲落，這種構(gòu)象漲落可引起單個(gè)蛋白質(zhì)的電特性發(fā)生微小變化。例如：對(duì)于dna聚合酶等與核酸相互作用的酶類(lèi)，當(dāng)四種不同堿基沿單鏈核酸模板合成時(shí)，酶的構(gòu)象會(huì)因被合成堿基種類(lèi)的不同產(chǎn)生微小差異，并引起相應(yīng)的電導(dǎo)率變化。因此通過(guò)檢測(cè)溶液中單個(gè)核酸酶導(dǎo)電率的差異，可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)核酸分子的合成測(cè)序。

由此，本發(fā)明提出了一種基于納米復(fù)合結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子電子器件，通過(guò)檢測(cè)溶液中單個(gè)酶分子的電導(dǎo)率來(lái)表征其構(gòu)象漲落的動(dòng)力學(xué)特征，從而檢測(cè)蛋白質(zhì)的活性及其與底物分子的生化反應(yīng)過(guò)程。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種蛋白質(zhì)分子電子器件，包括懸空膜結(jié)構(gòu)、納米對(duì)電極和蛋白質(zhì)或其復(fù)合物分子，其中：懸空膜結(jié)構(gòu)的膜上具有一納米孔，納米孔的直徑小于等于10納米；納米對(duì)電極包括兩個(gè)納米電極，分別設(shè)置在納米孔兩側(cè)，電極之間的間隙為1～100納米；單個(gè)蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)復(fù)合物分子組裝在納米孔處，連接兩個(gè)納米電極。

進(jìn)一步的，所述懸空膜結(jié)構(gòu)的懸空膜可以是硅、氮化硅、二氧化硅、云母、石墨烯等薄膜材料。

所述納米電極的材料通常為金、鉑、鈀或它們的合金等金屬材料，或者是這些材料中的兩種或更多種的合金；還可以是石墨烯等非金屬導(dǎo)電材料，例如碳納米管。

所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物分子根據(jù)不同的檢測(cè)目的進(jìn)行選擇，包括dna聚合酶、rna聚合酶、dna外切酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、脲酶等蛋白質(zhì)及其與其他生物分子組成的復(fù)合物，例如，可以利用dna聚合酶或rna聚合酶實(shí)現(xiàn)單分子dna測(cè)序，利用dna外切酶實(shí)現(xiàn)dna序列的檢測(cè)，利用逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)現(xiàn)rna測(cè)序，利用脲酶檢測(cè)液體中的尿素。

所述蛋白質(zhì)也可以和一種或多種生物大分子(包括其他蛋白質(zhì)、核酸、糖、脂以及其他生物高分子材料等)進(jìn)行交聯(lián)，構(gòu)建成的多功能的蛋白質(zhì)復(fù)合體。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子電子器件可以通過(guò)下述方法制備：

1)制備懸空膜結(jié)構(gòu)；

2)在懸空膜上制備納米對(duì)電極，組成納米對(duì)電極的兩個(gè)納米電極的尖端之間的距離在1～100納米，除尖端外，納米電極的其余部分覆蓋絕緣層；

3)在懸空膜上、兩個(gè)納米電極之間加工出直徑小于等于10納米的納米孔；

4)對(duì)納米電極進(jìn)行化學(xué)修飾，然后使蛋白質(zhì)或其復(fù)合物分子交聯(lián)到納米孔處，與兩個(gè)納米電極的尖端相連。

上述步驟1)，可以利用微納加工手段對(duì)si/sio2/sin基片進(jìn)行處理，制備出以si/sio2為支架，支架上附著一定厚度的sin膜的懸空膜結(jié)構(gòu)。其中，所述sin膜的厚度優(yōu)選為30～150納米。也可以利用微納加工手段加工出石墨烯材料的懸空膜結(jié)構(gòu)。

上述步驟2)可采用電子束光刻工藝制備納米對(duì)電極，其中所述絕緣層可以是氧化鋁或其他材料的絕緣層。兩個(gè)納米電極尖端之間的距離優(yōu)選為10納米。

上述步驟3)優(yōu)選利用高能聚焦電子束(tem)加工納米孔。

上述步驟4)對(duì)納米電極進(jìn)行化學(xué)修飾的目的是使電極表面帶上化學(xué)基團(tuán)，以便進(jìn)一步組裝蛋白質(zhì)分子。可采用巰基化合物對(duì)納米電極進(jìn)行修飾，例如將納米電極浸泡在含巰基化合物的有機(jī)溶劑中，避光反應(yīng)一段時(shí)間。巰基與電極材料金等發(fā)生反應(yīng)，通過(guò)金硫鍵連接，巰基化合物另一端的基團(tuán)(如羧基)游離在外，可以與蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)交聯(lián)組裝在一起。所述巰基化合物例如巰基乙酸、巰基十一烷酸等，所述有機(jī)溶劑常用的有乙醇等。

上述步驟4)，將化學(xué)修飾后的納米電極置于含有蛋白質(zhì)或其復(fù)合物分子的溶液中進(jìn)行交聯(lián)，蛋白質(zhì)或其復(fù)合物分子被納米孔捕獲并固定在兩個(gè)納米電極間。

在上述蛋白質(zhì)分子電子器件基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提出了一種檢測(cè)裝置，包括溶液槽、蛋白質(zhì)分子電子器件、一對(duì)電化學(xué)電極和微弱電流檢測(cè)平臺(tái)，其中所述蛋白質(zhì)分子電子器件的懸空膜結(jié)構(gòu)將溶液槽分隔為兩部分，懸空膜結(jié)構(gòu)兩邊的溶液只能通過(guò)納米孔連通；所述電化學(xué)電極分別放置在兩邊的溶液中，用于驅(qū)動(dòng)并檢測(cè)縱向過(guò)孔電流；所述蛋白質(zhì)分子電子器件中的兩個(gè)納米電極分別通過(guò)導(dǎo)線(xiàn)連接微弱電流檢測(cè)平臺(tái)，通過(guò)檢測(cè)通過(guò)蛋白質(zhì)或其復(fù)合物分子的橫向隧道電流，得到蛋白質(zhì)或其復(fù)合物分子的導(dǎo)電率變化狀況。

所述電化學(xué)電極可以采用常見(jiàn)的銀/氯化銀電極、鉑絲電極等。

根據(jù)通過(guò)蛋白質(zhì)或其復(fù)合物分子電流值(即橫向隧道電流)的變化，可以確定蛋白質(zhì)構(gòu)象的動(dòng)力學(xué)特征，從而獲得蛋白質(zhì)催化反應(yīng)底物的信息或dna、rna序列信息。而且，可以在單一芯片上實(shí)現(xiàn)多器件陣列化制備。每個(gè)蛋白質(zhì)分子電子器件可以作為一個(gè)結(jié)構(gòu)單元，在同一芯片上同時(shí)平行加工數(shù)萬(wàn)個(gè)相同的結(jié)構(gòu)單元，可以實(shí)現(xiàn)高通量的單分子檢測(cè)。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子電子器件的一個(gè)具體應(yīng)用就是作為核酸序列的檢測(cè)器件，將核酸聚合酶等蛋白質(zhì)分子對(duì)核酸單鏈上堿基識(shí)別的特異性和納米復(fù)合結(jié)構(gòu)上單個(gè)核酸聚合酶的電流測(cè)定相結(jié)合，向溶液槽的溶液中添加核酸模板及合成原料(四種核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)，通過(guò)納米對(duì)電極檢測(cè)核酸聚合酶在合成過(guò)程中導(dǎo)電率的變化，實(shí)現(xiàn)核酸單鏈上堿基序列的檢測(cè)。

當(dāng)生物酶與底物結(jié)合和反應(yīng)時(shí)其蛋白質(zhì)構(gòu)象漲落導(dǎo)致動(dòng)力學(xué)特性產(chǎn)生微小變化，并引起通過(guò)酶分子電流的變化。因此，利用本發(fā)明基于蛋白質(zhì)分子電子器件的檢測(cè)裝置還可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子活性和生化反應(yīng)過(guò)程的檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明可作為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ牡谌鷾y(cè)序方法，采用納米復(fù)合結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子電子器件具備如下優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需制備特殊的dna測(cè)序文庫(kù)，無(wú)需對(duì)核酸進(jìn)行標(biāo)記，可進(jìn)行超長(zhǎng)、連續(xù)、快速、精準(zhǔn)的堿基閱讀，可制備成高通量平行的分子器件，可實(shí)現(xiàn)超低成本的dna測(cè)序等，具體描述如下：

(1)本發(fā)明將單個(gè)酶分子固定于對(duì)電極之間，通過(guò)捕捉蛋白質(zhì)電導(dǎo)率的變化，實(shí)現(xiàn)核苷等底物生化反應(yīng)過(guò)程的監(jiān)測(cè)，無(wú)需對(duì)測(cè)序?qū)ο筮M(jìn)行擴(kuò)增和放大，即可直接對(duì)單鏈核酸分子測(cè)序，能夠克服由基因擴(kuò)增引起的測(cè)序偏向性。如果采用rna逆轉(zhuǎn)錄酶，則可直接對(duì)rna鏈測(cè)序，無(wú)需對(duì)rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

(2)本發(fā)明提出的單個(gè)酶分子的電特性檢測(cè)是在生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)的，也就是通過(guò)納米復(fù)合結(jié)構(gòu)實(shí)時(shí)檢測(cè)每個(gè)單體核苷酸的合成過(guò)程。因此，該器件可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)、不間斷的測(cè)序，這一特性不僅能夠大幅度提高測(cè)序速度，也會(huì)使dna或rna的讀長(zhǎng)大幅度增加。

(3)本發(fā)明提出的核酸測(cè)序器件，在測(cè)序過(guò)程中除了一次性加入普通核苷酸單體(如四種dntp)外，無(wú)需加入其他生化試劑，在核酸測(cè)序過(guò)程中試劑成本僅僅為幾美元。

(4)本發(fā)明通過(guò)在納米孔兩邊加上一對(duì)電化學(xué)電極，由于核酸帶有負(fù)電，對(duì)被測(cè)序的核酸形成電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)，大幅度提高納米孔和蛋白質(zhì)對(duì)核酸的捕獲效率，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)測(cè)序。

(5)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)可以在單一芯片上實(shí)現(xiàn)多器件的陣列化制備，在同一芯片上可以同時(shí)平行加工數(shù)萬(wàn)個(gè)相同的結(jié)構(gòu)單元，對(duì)數(shù)萬(wàn)條核酸分子同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，實(shí)現(xiàn)高通量的單分子測(cè)序。

(6)本發(fā)明提出的納米復(fù)合結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子器件還可以作為檢測(cè)單個(gè)生物酶活性的研究平臺(tái)，而以前沒(méi)有任何方法可以研究單個(gè)酶分子在生化反應(yīng)過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)行為。同時(shí)，通過(guò)固定不同的生物酶分子，可以檢測(cè)多種底物分子，成為一種超高靈敏度的生物傳感器，為極微量底物檢測(cè)提供新技術(shù)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明一種納米孔-對(duì)電極芯片結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明一種基于納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)分子電子器件的結(jié)構(gòu)及檢測(cè)電路示意圖。

圖3是實(shí)施例1中通過(guò)原子力顯微鏡(afm)表征的蛋白質(zhì)組裝結(jié)果。

圖中：1-懸空膜結(jié)構(gòu)，1a-si基底，1b-sio2膜，1c-sin膜，2-緩沖液，3-納米對(duì)電極，4-絕緣層，5-蛋白質(zhì)分子，6-縱向電極。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：基于納米孔-對(duì)電極結(jié)構(gòu)的dna聚合酶分子電子器件

(1)納米孔-對(duì)電極結(jié)構(gòu)的制備：利用光刻、干法刻蝕、濕法刻蝕、反應(yīng)離子束刻蝕等一系列微納加工手段對(duì)si/sio2/sin基片進(jìn)行處理，制備得到具有尺寸為2平方微米、厚度為30納米的sin膜的懸空膜結(jié)構(gòu)1，如圖1所示。其中，sio2膜1b作為絕緣緩沖層，起到支撐sin膜1c、減少電學(xué)測(cè)量中電容效應(yīng)的作用；si基底1a主要起支撐sio2膜1b的作用。懸空膜結(jié)構(gòu)1的材料并不限于si/sio2/sin，也可以采用石墨烯等其他材料制備懸空膜結(jié)構(gòu)。在懸空膜結(jié)構(gòu)1上，采用常規(guī)的電子束光刻工藝制備納米對(duì)電極3，加工流程包括氧化、涂膠、電子束曝光、金屬沉積、pr清洗、boe刻蝕，以及再次涂膠、電子束曝光，制備出尖端暴露、其余部位被氧化鋁絕緣層4覆蓋的納米金(或鈀、鉑及其合金)對(duì)電極3。納米金電極寬50納米，兩電極間隙10納米，結(jié)構(gòu)參見(jiàn)圖1和圖2。然后利用300kv的高能聚焦電子束(tem)在懸空膜中心、納米金電極對(duì)之間加工直徑小于等于10納米的納米孔，得到納米孔-對(duì)電極芯片。該納米孔-對(duì)電極芯片可單個(gè)使用，也可做成陣列形式，并行使用，提高通量。

(2)納米對(duì)電極表面的修飾：用巰基乙酸(或巰基十一烷酸)的乙醇溶液(濃度1mm)對(duì)納米對(duì)電極表面進(jìn)行化學(xué)修飾。具體加工流程為：將納米孔-對(duì)電極芯片用等離子體發(fā)生器(plasmagenerator)處理后放在去離子水中浸泡5分鐘，氮?dú)獯蹈?；浸泡在無(wú)水乙醇中短時(shí)間保存；配制濃度為1毫摩的巰基乙酸(或巰基十一烷酸)的乙醇溶液，將納米孔-對(duì)電極芯片放入其中浸泡，室溫下避光反應(yīng)24小時(shí)；結(jié)束后取出納米孔-對(duì)電極芯片，用去離子水浸泡30分鐘并用氮?dú)獯蹈伞?/p>

(3)納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)的化學(xué)交聯(lián)法制備：向離心管中注入500微升n-羥基丁二酰亞胺(nhs)溶液(100mm)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)溶液(100mm)的1:1(體積比)混合溶液(起活化羧基的作用)，放入進(jìn)行過(guò)化學(xué)修飾的納米孔-對(duì)電極芯片，將200微升q5高保真dna聚合酶(50微克/毫升)滴入離心管中，避光保存1小時(shí)，使q5高保真dna聚合酶與化學(xué)修飾過(guò)的納米對(duì)電極進(jìn)行交聯(lián)，q5高保真聚合酶(圖2中的蛋白質(zhì)分子5)被納米孔捕獲并固定在納米對(duì)電極間，如圖2所示。結(jié)束后將芯片取出，放在去離子水中浸泡，保存?zhèn)溆?。獲得的納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)具有檢測(cè)dna生物合成過(guò)程的功能。

(4)將納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)芯片封裝于一個(gè)微型溶液槽中，溶液槽分隔成兩部分。從溶液槽兩邊的進(jìn)液端口順序注入3ml超純水、3ml氯化鉀緩沖液(1m)，通過(guò)芯片中間的納米孔將分隔的溶液槽連通。如圖2所示，在溶液槽的兩邊的緩沖液2中分別放置一個(gè)銀/氯化銀電極作為縱向電極6，構(gòu)建納米孔通道的縱向電學(xué)回路，用于驅(qū)動(dòng)核酸序列的過(guò)孔行為，并監(jiān)測(cè)過(guò)孔電流。從納米對(duì)電極3處引出導(dǎo)線(xiàn)，連接微弱信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)，構(gòu)建通過(guò)蛋白質(zhì)分子的橫向電學(xué)回路，用于檢測(cè)核酸反應(yīng)過(guò)程中微弱的過(guò)蛋白電流，以此識(shí)別堿基種類(lèi)。

(5)通過(guò)縱向電極施加0.1～1伏的電壓，監(jiān)測(cè)縱向過(guò)孔電流。當(dāng)q5高保真聚合酶被納米孔捕獲并固定在納米對(duì)電極間時(shí)，過(guò)孔電流大小從納安量級(jí)降低到0.1納安量級(jí)水平，電流的波動(dòng)值在0.1納安量級(jí)。檢測(cè)所用微弱信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)包括：微電極固定臺(tái)、微小電信號(hào)檢測(cè)屏蔽箱、微電流放大器、微小信號(hào)發(fā)生器等，可采用axon700b膜片鉗放大系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)原子力顯微鏡(afm)觀察，確認(rèn)q5高保真dna聚合酶被固定在納米對(duì)電極3之間，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看到黃色的納米金電極，白色點(diǎn)狀物為修飾的蛋白，證明蛋白質(zhì)被成功組裝在納米金電極上。將溶液槽中氯化鉀緩沖液更換為超純水，通過(guò)圖2所示的檢測(cè)電路對(duì)蛋白質(zhì)的導(dǎo)電率進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)電路置于電學(xué)信號(hào)檢測(cè)屏蔽箱內(nèi)。

(6)在施加負(fù)極電壓的微型溶液槽的溶液中加入適量的單鏈dna模板序列和引物，以及相應(yīng)的四種dntps，在納米對(duì)電極3兩端施加0.1～1v電壓，監(jiān)測(cè)q5高保真dna聚合酶合成時(shí)納米對(duì)電極間的電流信號(hào)變化。dna合成速度約為1至10堿基/微秒。納米對(duì)電極間電流的波動(dòng)值表示dna聚合酶合成堿基種類(lèi)，用于鑒別對(duì)應(yīng)合成的堿基。

(7)記錄蛋白質(zhì)分子電子器件納米對(duì)電極間的電流波動(dòng)譜，分析dna模板序列。

實(shí)施例2：基于納米孔-對(duì)電極結(jié)構(gòu)的rna聚合酶分子電子器件

(1)納米孔-對(duì)電極結(jié)構(gòu)的制備：同實(shí)施例1。

(2)納米對(duì)電極表面的修飾：同實(shí)施例1。

(3)納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)的化學(xué)交聯(lián)法制備：：向離心管中注入500微升nhs溶液(100mm)與edc溶液(100mm)的1:1混合溶液，放入進(jìn)行過(guò)化學(xué)修飾的納米孔-對(duì)電極芯片，將200微升rna聚合酶(50微克/毫升)滴入離心管中，避光保存1小時(shí)，使rna聚合酶與納米對(duì)電極進(jìn)行交聯(lián)。結(jié)束后取出，放在去離子水中浸泡，保存?zhèn)溆?。該納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)具有檢測(cè)dna序列的功能。

(4)將納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)芯片封裝于一個(gè)微型溶液槽中，溶液槽分隔成兩部分。從溶液槽兩邊的進(jìn)液端口順序注入3ml超純水、3ml氯化鉀緩沖液(1m)，通過(guò)芯片中間的納米孔將分隔的溶液槽連通。在溶液槽的兩邊的緩沖液中分別放置一個(gè)銀/氯化銀電極，構(gòu)建納米孔通道的縱向電學(xué)回路，從納米對(duì)電極處引出導(dǎo)線(xiàn)，連接微小信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)，用于驅(qū)動(dòng)核酸序列的過(guò)孔行為，并監(jiān)測(cè)過(guò)孔電流。從納米對(duì)電極處引出導(dǎo)線(xiàn)，連接微弱信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)，構(gòu)建通過(guò)蛋白質(zhì)分子的橫向電學(xué)回路，用于檢測(cè)核酸反應(yīng)過(guò)程中微弱的過(guò)蛋白電流，以此識(shí)別堿基種類(lèi)。

(5)通過(guò)縱向電極施加0.1～1伏的電壓，監(jiān)測(cè)縱向過(guò)孔電流。當(dāng)rna聚合酶被納米孔捕獲并固定在納米對(duì)電極間時(shí)，過(guò)孔電流從納安量級(jí)降低到0.1納安量級(jí)水平，電流的波動(dòng)值在0.1納安量級(jí)。微弱信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)包括：微電極固定臺(tái)、微小電信號(hào)檢測(cè)屏蔽箱、微電流放大器、微小信號(hào)發(fā)生器等。

(6)在施加負(fù)極電壓的微型溶液槽的溶液中加入適量的雙鏈dna模板序列，以及相應(yīng)的四種核糖核苷酸，在納米對(duì)電極兩端施加0.1～1v電壓，監(jiān)測(cè)rna聚合酶合成時(shí)納米對(duì)電極間的電流信號(hào)變化。rna合成速度約為1至10堿基/微秒。納米對(duì)電極間電流的波動(dòng)值表示rna聚合酶合成不同堿基，用于鑒別對(duì)應(yīng)合成的堿基類(lèi)別。

(7)記錄蛋白質(zhì)分子電子器件納米對(duì)電極間的電流波動(dòng)譜，分析dna模板序列。

實(shí)施例3：基于納米孔-對(duì)電極結(jié)構(gòu)的dna外切酶分子電子器件

(1)納米孔-對(duì)電極結(jié)構(gòu)的制備：同實(shí)施例1。

(2)納米對(duì)電極表面的修飾：同實(shí)施例1。

(3)納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)的化學(xué)交聯(lián)法制備：向離心管中注入500微升nhs溶液(100mm)與edc溶液(100mm)的1:1(體積比)混合溶液，放入進(jìn)行過(guò)化學(xué)修飾的納米孔-對(duì)電極芯片，將200微升dna外切酶(50微克/毫升)滴入離心管中，避光保存1小時(shí)，使dna外切酶與化學(xué)修飾過(guò)的納米金對(duì)電極進(jìn)行交聯(lián)。結(jié)束后取出，放在去離子水中浸泡，保存?zhèn)溆?。該納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)具有檢測(cè)dna序列的功能。

(4)將納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)芯片封裝于一個(gè)微型溶液槽中，溶液槽分隔成兩部分。從溶液槽兩邊的進(jìn)液端口順序注入3ml超純水、3ml氯化鉀緩沖液(1m)，通過(guò)芯片中間的納米孔將分隔的溶液槽連通。在溶液槽的兩邊的緩沖液中分別放置一個(gè)銀/氯化銀電極，構(gòu)建納米孔通道的縱向電學(xué)回路，用于驅(qū)動(dòng)核酸序列的過(guò)孔行為，并監(jiān)測(cè)過(guò)孔電流。從納米對(duì)電極處引出導(dǎo)線(xiàn)，連接微弱信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)，構(gòu)建通過(guò)蛋白質(zhì)分子的橫向電學(xué)回路，用于檢測(cè)核酸反應(yīng)過(guò)程中微弱的過(guò)蛋白電流，以此識(shí)別堿基種類(lèi)。結(jié)構(gòu)如圖2所示。

(5)通過(guò)縱向電極施加0.1～1伏的電壓，監(jiān)測(cè)縱向過(guò)孔電流。當(dāng)dna外切酶被納米孔捕獲并固定在納米對(duì)電極間時(shí)，過(guò)孔電流從納安量級(jí)降低到0.1納安量級(jí)水平，電流的波動(dòng)值在0.1納安量級(jí)。微弱信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)包括：微電極固定臺(tái)、微小電信號(hào)檢測(cè)屏蔽箱、微電流放大器、微小信號(hào)發(fā)生器等。

(6)在施加負(fù)極電壓的微型溶液槽的溶液中加入適量的單鏈dna模板序列，在納米對(duì)電極兩端施加0.1～1v電壓，監(jiān)測(cè)dna外切酶剪切dna模板鏈堿基時(shí)納米對(duì)電極間的電流信號(hào)變化。納米對(duì)電極間電流的波動(dòng)值表示dna外切酶剪切不同堿基，用于鑒別對(duì)應(yīng)的堿基類(lèi)別。

(7)記錄蛋白質(zhì)分子電子器件納米對(duì)電極間的電流波動(dòng)譜，分析dna模板序列。

實(shí)施例4：基于納米孔-對(duì)電極結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄酶分子電子器件

(1)納米孔-對(duì)電極結(jié)構(gòu)的制備：同實(shí)施例1。

(2)納米對(duì)電極表面的修飾：同實(shí)施例1。

(3)納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)的化學(xué)交聯(lián)法制備：向離心管中注入500微升nhs溶液(100mm)與edc溶液(100mm)的1:1(體積比)混合溶液，放入進(jìn)行過(guò)化學(xué)修飾的納米孔-對(duì)電極芯片，將200微升逆轉(zhuǎn)錄酶(50微克/毫升)滴入離心管中，避光保存1小時(shí)，使逆轉(zhuǎn)錄酶與納米金電極進(jìn)行交聯(lián)。結(jié)束后取出，放在去離子水中浸泡，保存?zhèn)溆?。該納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)具有檢測(cè)dna序列的功能。

(4)將納米孔-對(duì)電極-蛋白質(zhì)芯片封裝于一個(gè)微型溶液槽中，溶液槽分隔成兩部分。從溶液槽兩邊的進(jìn)液端口順序注入3ml超純水、3ml氯化鉀緩沖液(1m)，通過(guò)芯片中間的納米孔將分隔的溶液槽連通。在溶液槽的兩邊的緩沖液中分別放置一個(gè)銀/氯化銀電極，構(gòu)建納米孔通道的縱向電學(xué)回路，用于驅(qū)動(dòng)核酸序列的過(guò)孔行為，并監(jiān)測(cè)過(guò)孔電流。從納米對(duì)電極處引出導(dǎo)線(xiàn)，連接微弱信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)，構(gòu)建通過(guò)蛋白質(zhì)分子的橫向電學(xué)回路，用于檢測(cè)核酸反應(yīng)過(guò)程中微弱的過(guò)蛋白電流，以此識(shí)別堿基種類(lèi)。結(jié)構(gòu)如圖2所示。

(5)通過(guò)縱向電極施加0.1～1伏的電壓，監(jiān)測(cè)縱向過(guò)孔電流。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶被納米孔捕獲并固定在納米金對(duì)電極間時(shí)，過(guò)孔電流大小從納安量級(jí)降低到0.1納安量級(jí)水平，電流的波動(dòng)值在0.1納安量級(jí)。微弱信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)包括：微電極固定臺(tái)、微小電信號(hào)檢測(cè)屏蔽箱、微電流放大器、微小信號(hào)發(fā)生器等。

(6)在施加負(fù)極電壓的微型溶液槽的溶液中加入適量的單鏈rna模板序列和引物，以及相應(yīng)的四種脫氧核糖核苷酸，在納米對(duì)電極兩端施加0.1～1v電壓，監(jiān)測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶合成時(shí)納米對(duì)電極間的電流信號(hào)變化。dna合成速度約為1至10堿基/微秒。納米對(duì)電極間電流的波動(dòng)值表示逆轉(zhuǎn)錄酶合成不同堿基，用于鑒別對(duì)應(yīng)合成的堿基類(lèi)別。

(7)記錄蛋白質(zhì)分子電子器件納米對(duì)電極間的電流波動(dòng)譜，分析dna模板序列。