融合蛋白分子和它的使用方法
【專利說明】
[0001 ]本發(fā)明要求于2013年3月15日提交的美國臨時申請No. 61/802，169的優(yōu)先權(quán)。本發(fā) 明也要求于2012年6月4日提交的美國臨時申請No.61/655,428的優(yōu)先權(quán)，現(xiàn)已放棄。運兩個 申請均通過整體引用合并入本申請中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及包含細(xì)胞因子部分和祀子導(dǎo)向部分的融合分子。細(xì)胞因子部分包含一 個或多個細(xì)胞因子。祀子導(dǎo)向部分包含一個或多個配體。每個配體是能夠識別祀子(包括但 不局限于，細(xì)胞或病毒顆粒)表面受體的小膚、蛋白、或小分子。
【背景技術(shù)】
[0003] 細(xì)胞因子，例如淋己因子、趨化因子和生長因子，是由包括淋己細(xì)胞、單核細(xì)胞在 內(nèi)的多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生，在人類生理和疾病控制中有廣泛的作用。運幾種細(xì)胞因子在臨 床上證明能夠有效的治療多種疾病。
[0004] 例如，白細(xì)胞介素-2(化-2)，作為一種細(xì)胞因子已經(jīng)被美國食品及藥物管理局 (FDA)W及世界上其它機構(gòu)批準(zhǔn)，在臨床上可用于治療轉(zhuǎn)移性腎癌和惡性轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。 然而，目前市場上的IL-2的治療窗由于存在副作用而有著一定的局限性，比如毛細(xì)血管滲 漏綜合癥(CLSKIL-2的作用機制是通過促進整個生理循環(huán)中T細(xì)胞的增殖而發(fā)揮作用，而 不是特異性的針對原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤。因此，如果IL-2能夠祀向作用于腫瘤細(xì)胞，那么其 治療窗會增加。
[0005] 美國專利USRE33653E描述了一個IL-2突變體的復(fù)合物和使用方法。US4935356A描 述了在大腸桿菌中表達和純化IL-2的方法。US8580267B2公布了一種用化療藥物結(jié)合免疫 細(xì)胞因子治療腫瘤的方法，即由細(xì)胞因子(例如IL-2)、與腫瘤新生血管抗原結(jié)合的抗體(例 如腫糖蛋白tenascin-C)、聯(lián)合治療的化療藥物（例如替莫挫胺）的聯(lián)合治療。EP0229998B1 描述了一種融合蛋白，該蛋白至少包含IL-2的一部分（與IL-2的C端和N端的氨基酸序列基 本一致），但其不具有生物學(xué)活性，同時不包含IL-2至少前100個氨基酸。
[0006] 干擾素蛋白a(IFN-a)由白細(xì)胞產(chǎn)生，主要參與病毒感染引起的先天性免疫應(yīng)答。 IFN-a蛋白包含 13個亞型：IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、 IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21。編碼運些IFN-a分子的基因成簇排列于第9號染色 體上。美國專利US7611700B2描述了具有蛋白酶抗性的修飾后的IFN-a多膚。
[0007] Lee JH等人描述了 "KISS1基因，運是一種新型的抑制人類惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移的基 因 "（Lee JH，et al.Journal of the 化tional Cancer Institute'Vol.88(23):1731-1737(1996))。據(jù)報道，1(1551編碼至少4個功能性的多膚產(chǎn)物:1(133969^11-54(又名轉(zhuǎn)移抑 制素）、1^1339691:;[]1-14、1(1339邱1:;[]1-13、1(1339691:;[]1-10，分別含有54、14、13、10個氨基酸 (Kotani Μ et al.J.Biol.Chem.Vol.276(37):34631-34636(2001);0htaki T.et al.， 化ture Vol. 411(6837) :613-671(2001))。四種產(chǎn)物均含有相同的10個氨基酸，C端均為酷 胺化的氨基酸，但N端長度不同。它們是KISS1R(-個G蛋白偶聯(lián)受體）的功能性配體(US 6699965 B1)dKISS1/KISS1R與包括青春期啟動在內(nèi)的生殖系統(tǒng)的發(fā)育相關(guān)(Popa SM et al.，Annu.Rev.F*hysiol .Vol 70:213-38(2008))。據(jù)報道，Kisspeptins能夠抑制腫瘤細(xì)胞 的轉(zhuǎn)移化ee JH and Welch DRJnt.J.Cancer.V〇1.71(6):1035-1044(1997))。轉(zhuǎn)移抑制素 衍生物還具有卓越的生物學(xué)活性(例如:癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制活性、癌細(xì)胞生長抑制活性等）（詳 情見US 6800611 B2，US 7625869 B2，US 8361968 B2，US 8592379 B2)eUS7112662B2描述 了一個抗轉(zhuǎn)移抑制素抗體及其使用方法，從而轉(zhuǎn)移抑制素及其衍生物可被高度靈敏性地特 異量化。
[0008] 融合蛋白或嵌合蛋白（由不同來源的幾個部分組成）是由兩個或多個編碼單獨蛋 白的基因整合編碼而產(chǎn)生。美國專利US8076288B2記述了融合多膚有降低血糖的活性。 US7569384B2公布了白蛋白融合蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明設(shè)及一個融合分子的復(fù)合物，包含一個細(xì)胞因子部分和一個祀子導(dǎo)向部 分。細(xì)胞因子部分由一個或多個細(xì)胞因子組成。祀子導(dǎo)向部分由一個或多個配體組成。每個 配體為能夠識別祀標(biāo)(包括但不局限于細(xì)胞或病毒顆粒等)上受體的多膚、蛋白或者的小分 子。祀子導(dǎo)向部分把融合分子帶到祀標(biāo)上，因此使細(xì)胞因子在祀位上發(fā)揮作用。從而細(xì)胞因 子的活性能夠得到加強。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，細(xì)胞因子是IL-2的一部分或者一個突變體?；蛘呲?化因子可 W 是 GM-CSF、TNF-alpha、IFN-alpha、IFN-be 化或 IFN-gamma。
[0011] 在某些實施例中，有的融合蛋白的配體部分至少包含一個Kisspeptin的片段或突 變體。該部分把融合分子帶到祀子免疫細(xì)胞上，細(xì)胞因子部分刺激免疫細(xì)胞的增殖，從而增 強了對祀子的免疫應(yīng)答。
[0012] 在另一些實施例中，有的融合分子的配體部分至少包含一個內(nèi)皮素-1、內(nèi)皮素-2 或內(nèi)皮素-3的片段或突變體，細(xì)胞因子部分包含至少一個IL-2,或TNF-alpha，或IFN-al地日，或INF-beta，或INF-gamma的片段或突變體。
[0013] 本發(fā)明還公布了用細(xì)胞因子-配體融合蛋白治療人類疾病的方法。在某些方面，引 起轉(zhuǎn)移性腎癌或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤等人類癌癥的腫瘤細(xì)胞是祀點。另外，病毒感染的細(xì)胞及 病毒顆粒也是祀點。細(xì)胞因子-配體融合蛋白用來治療某種或者多種由病毒感染引起的疾 病。
[0014] 在接下來的細(xì)述及附件的聲明中會進一步掲示本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點。上述所 提及的實施例的一個、多個或所有特點可能會結(jié)合到本發(fā)明中形成新的內(nèi)容。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明中一個細(xì)胞因子-配體融合分子案例的原理圖。
【具體實施方式】
[0016] 本發(fā)明設(shè)及包含一個功能部分和祀點導(dǎo)向部分的融合分子。功能部分包含一個或 多個細(xì)胞因子。祀點導(dǎo)向部分包含一個或多個表達或附著在祀細(xì)胞上的受體所對應(yīng)的配 體。配體是一個多膚、蛋白或者小分子。祀點包括腫瘤細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞或病毒顆粒等。 配體-細(xì)胞因子融合蛋白增強了免疫應(yīng)答。祀點導(dǎo)向部分使融合蛋白在祀細(xì)胞位點處聚集， 功能部分在祀位點處發(fā)揮作用，從而提高了融合蛋白抗祀細(xì)胞的活性。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，細(xì)胞因子至少是W下白介素的一部分或者是白介素 突變體：IL2、IL15、IL4、IL13、IL7、IL9、IL21、IL3、IL5、GM-CSF、IL6、IL11、IL27、IL30、IL31 (+non IL 0SM、LIF、CNTFCTF1)、IL12、IL23、IL27、IL35、IL14、IL16、IL32、IL：M、IL10/IL22、 IL19、IL20、IL24、IL26、IL28A、IL28B、IL29、ILlA、ILlB/ILlF2、lRa/ILlF3、ILlF5、ILlF6、 比1尸7、比1尸8、比1尸9、比1尸10、比1尸11、比16、比174、比178和比25。
[0018] 在另一種實施方式中，上述IL-2至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突變體。
[0019] APTSSST邸TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ化E邸LKPLEEVLNLAQSKN FHLRP畑LISNINVIVLELKG沈TTFMCEYADETATIVEFLNR W口FCQSIISTLT(SEQ ID N0:1).
[0020] 在另一種實施方式中，細(xì)胞因子包含至少一個TNF家族的因子，上述TNF家族包括 TNFA/TNFSF2、Lymphotoxin(TNFB/LTA，TNFC/LTB)、TNFSF4、TNFSF5/CD40LG、TNFSF6、 TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSFl 0、TNFSFl 1、TNFSFl 3B 及 EDA。
[0021] 在另一種實施方式中，上述TNFA包含至少下列氨基酸序列的一部分或其突變體。
[0022] VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGV 化畑 NQLVVP 沈化化 IYSQ 化 FKGQGCPSTHV1XT HTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGD化SAEINRPDYLDFAESGQVYFGI IAL(沈Q ID N0:3).
[0023] 在另一種實施方式中，細(xì)胞因子至少包含干擾素的一部分或干擾素突變體，上述 干擾素包括IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、 IFNA16、IFNA17、IFNA21、IFNB1、IFNK、IFNW1和IFNG。
[0024] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，上述IFNA1至少包含下列氨基酸序列的一部分或 其突變體。
[0025] MASPFALLMVLWLSCKSSCSLGCDL 陽 THSLDNRRTLMLLAQMSRISPSS 化 MD 畑 DFGFPQ 邸抑 GNQFQKAPAI SVLHELIQQIFNLFTT邸SSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRR口LYL TEKKYSPCAWEVVRAEIMR化化S?L犯RLR服E(沈Q ID N0:5).
[00%]在另一種實施方式中，上述IFNA2至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突變體。
[0027] MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQM 服 ISLFS 化邸畑 DFGFPQ 邸 FGNQFQKAETIP VLHEMIQQIFNLFST邸SSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMK邸SILAVRKYFQRITLYLK EKKYSPCAWEVVRAEIMRSF化S?L犯SLRSKE(沈Q ID N0:6).
[0028] 在另一種實施方式中，上述IFNBl至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突變體。
[0029] MTNK 化 LQIA 化 LCFSTTALSMSYNLLG 化 QRSSNFQCQKLLWQLNGRLEY 化邸 RMN抑 I 陽 EIKQLQQFQKEDAA LTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGW肥TIVE化LANVYHQINHLKTVLE邸LEK邸FTRGKLMSSLHLKRYYGRIL肌L KAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQ ID NO:7).
[0030] 在另一種實施方式中，上述IFNG至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突變體。
[0031] MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESD服IMQSQIVSFYF KLFKNF 邸 DQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNK 邸畑 DF 邸 LTNYSVTDLNVQ 服 AI 肥 LIQVMAELSPAAKTGK 服 R SQMLFRGRRASQ(SEQ ID NO:8).
[0032] 在另一種實施方式中，上述內(nèi)皮素-3至少包含下列氨基酸序列的一部分或其突變 體。CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW(沈Q ID N0:9)
[0033] 在另一種實施方式中，細(xì)胞因子至少包含W下一個趨化因子:(XL1、CCL2/MCP-1、 CCL3/MIP-la、CCL4/MIP-10、CCL5/RANTES、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLll、CCL12、CCL13、 (XL14、(XL15、(XL16、(XL17、(XL18、(XL19、(XL20、(XL21、(XL22、(XL23、(XL24、(XL25、 (XL26、(XL27、(XL28、CXCL1 /KC、CX化2、CX化3、CX化4、CX化日、CX化日、CX化7、CX化8/1L8、 CX化9、CX化10、CX化11、CX化12、CX化13、CX化14、CX化1日、CX化1日、CXCL17、CX3CL1、X化1和 ax2。
[0034] 在另一種實施方式中，有的細(xì)胞因子至少包含W下一個趨化因子:KITLG、CSF和 SPP1。
[0035] 在另一種實施方式中，趨化因子為GM-CSF，或TNF-alpha，或IFN-alpha，或FN-beta，或IFN-邑amma。
[0036] 在另一種實施方式中，有的細(xì)胞因子至少包含生長因子的一個片段或者突變體， 生長因子選自包含腎上腺髓質(zhì)素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌移動因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋 白（BMPs)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、表皮生長因子化GF)、紅細(xì)胞生成素化P0)、纖維母 細(xì)胞生長因子(FGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨隧細(xì)胞集落刺 激因子（GM-CSF)、生長分化因子9(GDF9)、肝細(xì)胞生長因子（HGF)、肝癌衍生生長因子 (皿GF)、膜島素樣生長因子（IGF)、促移行因子；肌生成抑制蛋白（GDF-8、神經(jīng)生長因子 (NGF)和其他神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板源生長因子(PDGF)、促血小板生成素(TP0)、轉(zhuǎn)變生長因 子α(TGF-a)、轉(zhuǎn)變生長因子β(TGF-β)、腫瘤壞死因子α(TNF-a)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、 Wnt信號通路、胎盤生長因子(P1G巧。
[0037] 在另一種實施方式中，有的配體部分至少包含內(nèi)皮素-1、內(nèi)皮素-2或內(nèi)皮素-3的 一部分或其突變體，細(xì)胞因子部分至少包含比-2，或TNF-alpha，或IFN-al地a，或INF-beta， 或INF-gamma的一部分或其突變體。
[0038] 在另一種實施方式中，有的配體包含能結(jié)合一個或多個受體的膚段或蛋白的一部 分或其突變體，運些受體包括:在肝炎病毒化AV，或皿V，或HCV)感染之前或之后，表達在肝 細(xì)胞表面的受體、乙型肝炎病毒表面抗原化BVsAg)、人體免疫缺損病毒甜120 WIV)、人體免 疫缺損病毒gp4UHIV)、或人類流感病毒的血凝素、SARS冠狀病毒膜粒蛋白E2、SARS冠狀病 毒纖突蛋白、SARS冠狀病毒血球凝集素醋酶糖蛋白。