本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域；具體地說，本發(fā)明涉及新型的噻唑類衍生物其合成方法及其作為二氫乳清酸脫氫酶(Dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)抑制劑在治療DHODH介導(dǎo)的疾病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

二氫乳清酸脫氫酶(Dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)是一種含鐵的黃素依賴型線粒體酶，催化嘧啶從頭合成的第四步反應(yīng)，即將二氫乳清酸脫氫轉(zhuǎn)化成乳清酸，該步驟是嘧啶從頭合成的限速步。因此，抑制DHODH，可以阻斷嘧啶的從頭合成。對于大多數(shù)生物來說，嘧啶堿基可以通過從頭合成與補(bǔ)救合成兩種途徑得到。對于人體內(nèi)靜息的淋巴細(xì)胞，補(bǔ)救合成途徑獲得的嘧啶足以滿足其代謝需求，但免疫激活的淋巴細(xì)胞對于嘧啶堿基的需求是靜息狀態(tài)下的8倍，因此必須啟動從頭合成途徑來滿足其生理需求。而對于快速分化、惡性增殖的腫瘤細(xì)胞，補(bǔ)救合成途徑得到的嘧啶同樣無法滿足其生長需求，必須啟動從頭合成途徑。因此，DHODH抑制劑可以抑制免疫激活的淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的DNA或RNA合成，從而有效減少它們的數(shù)量，用來抗腫瘤以及治療自身免疫性疾病。

人類的二氫乳清酸脫氫酶通過N末端的特殊結(jié)構(gòu)附著在線粒體內(nèi)膜上，其催化過程需要結(jié)合黃素單核苷酸(Flavin mononucleotide,FMN)和輔酶Q(COQ)作為輔因子。從結(jié)構(gòu)上看，hsDHODH主要分為N末端的α螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域和C末端的α/β桶狀結(jié)構(gòu)區(qū)域，C末端是發(fā)生氧化還原的主要位點。其催化過程通過兩個半反應(yīng)完成：首先，二氫乳清酸被氧化為乳清酸，同時FMN接受兩個氫原子被還原為FMNH2；隨后，COQ接受FMNH2的兩個氫原子使其還原為FMN。

理論上講，任何可以結(jié)合在底物或者輔因子結(jié)合區(qū)域的化合物都可以抑制DHODH的生理作用，從而阻斷DNA或RNA的合成。通過設(shè)計底物類似物，如甲基取代的二氫乳清酸、5-氟乳清酸，競爭性地結(jié)合在底物二氫乳清酸的結(jié)合位點，從而阻斷乳清酸的合成。目前，臨床上使用的hsDHODH抑制劑主要針 對COQ結(jié)合通道，如布奎那(Brequinar)、來氟米特(Leflunomide)和特立氟胺(Teriflunomide,A771726)。Brequinar主要用于抗腫瘤以及器官移植引起的宿主排異反應(yīng)，但Brequinar治療窗窄，且與順鉑或環(huán)孢菌素A聯(lián)合用藥時會出現(xiàn)較嚴(yán)重的毒副作用，如白血球、血小板減少以及黏膜炎等。Leflunomide被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等多種自身免疫缺陷癥，A771726為其活性代謝產(chǎn)物，經(jīng)臨床觀察，長期使用Leflunomide也會產(chǎn)生明顯的毒副作用，如腹瀉、肝酶異常，皮疹以及高血壓等。

因此，本領(lǐng)域急需研究開發(fā)高效、低毒的DHODH抑制劑有很重要的學(xué)術(shù)價值與現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)全新、DHODH抑制活性高、毒性低、安全性好的化合物。

在第一方面，本發(fā)明提供式I所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、溶劑化物，

式中

R¹選自H、鹵素、C₁-C₆烷基或C₁-C₆鹵代烷基；

R²選自H、C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀鹵代烷基、C₁-C₁₀烷氧基或C₁-C₁₀鹵代烷氧基、或羥基C₁-C₆烷基或羥基C₁-C₆鹵代烷基；

R³選自H、C₁-C₆烷基或C_1-6鹵代烷基；

R⁴選自H、鹵素、C₁-C₆烷基或C₁-C₆鹵代烷基、或C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆鹵代烷氧基，m＝0～3；

R⁵選自H、鹵素、OH、NR⁶R⁷、C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆鹵代烷氧基；

R⁶和R⁷彼此獨立選自：H或C₁-C₃烷基或C₁-C₃鹵代烷基。

在具體的實施方式中，所述化合物如下式II所示：

式中

R¹選自H、F、Cl、Br、C₁-C₃烷基或C₁-C₃鹵代烷基；

R²選自H、C₁-C₆烷基或C₁-C₆鹵代烷基、C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆鹵代烷氧基、或羥基C₁-C₃烷基或羥基C₁-C₃鹵代烷基；

R³自H、C₁-C₃烷基或C_1-3鹵代烷基；

R⁴選自H、F、Cl、Br、C₁-C₃烷基或C₁-C₃鹵代烷基、C₁-C₃烷氧基或C₁-C₃鹵代烷氧基；

R⁵選自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、OCH₃。

在具體的實施方式中，R¹選自H、F、C₁-C₃烷基；R²選自C₁-C₃烷基；R³選自H、C₁-C₃烷基；R⁴選自H或Cl；R⁵選自H。

在第二方面，本發(fā)明提供選自下組的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、溶劑化物：

在第三方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有本發(fā)明第一或第二方面所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

在優(yōu)選的實施方式中，所述藥物組合物是適于口服的劑型，包括但不限于片劑、溶液劑、混懸液、膠囊劑、顆粒劑、粉劑。

在第四方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一或第二方面所述的化合物在制備治療或預(yù)防DHODH介導(dǎo)的疾病，或抑制DHODH的藥物中的用途。

在具體的實施方式中，所述DHODH介導(dǎo)的疾病是自身免疫疾病、器官移植排異、細(xì)菌感染、寄生蟲疾病、病毒性疾病、或腫瘤。

在具體的實施方式中，所述自身免疫疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、牛皮癬。

在第五方面，本發(fā)明提供利用本發(fā)明第一或第二方面所述的化合物或第三方面所述的藥物組合物治療或預(yù)防DHODH介導(dǎo)的疾病方法，所述方法包括將本發(fā)明第一或第二方面所述的化合物或第三方面所述的藥物組合物給予有此需要的對象。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具體實施方式

發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)了一系列噻唑類衍生物，它們的結(jié)構(gòu)骨架完全不同于文獻(xiàn)報道過的高活性DHODH抑制劑(例如來氟米特、特立氟胺、布奎那)。這些化合物在分子、細(xì)胞及動物水平測試中顯示出顯著的DHODH抑制活性，同時毒性較低、安全性較好，具有良好的成藥前景。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

術(shù)語定義

本文中涉及到的一些基團(tuán)定義如下：

本文中，“烷基”指碳鏈長度為1-10個碳原子的飽和的支鏈或直鏈烷基，優(yōu)選的烷基包括長2-8個碳原子、1-6個、1-4個碳原子、1-3個碳原子不等的烷基。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、庚基等。烷基可以被1個或多個取代基取代，例如被鹵素或鹵代烷基取代。例如，烷基可以是被1-4個氟原子取代的烷基，或者烷基可以是被氟代烷基取代的烷 基。

本文中，“烷氧基”指被烷基取代的氧基。優(yōu)選的烷氧基是長1-6個碳原子的烷氧基，更優(yōu)選為長1-4個碳原子的烷氧基。烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基等。在具體的實施方式中，烷氧基可以是取代的烷氧基，例如，鹵素取代的烷氧基。在具體的實施方式中，優(yōu)選鹵素取代的C₁-C₃烷氧基。

本文中，“鹵素”指氟、氯、溴和碘。在優(yōu)選的實施方式中，鹵素是氯或氟。

本文中，“氨基”指結(jié)構(gòu)式為“NR_xR_y”的基團(tuán)，其中，R_x和R_y可獨立選自H或C₁-C₃烷基或C₁-C₃鹵代烷基。在具體的實施方式中，本文所述的“氨基”是指NH₂。

本發(fā)明的化合物

本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)了一系列結(jié)構(gòu)骨架全新的噻唑類衍生物，這些化合物在分子、細(xì)胞及動物水平測試中顯示出顯著的DHODH抑制活性，同時毒性較低、安全性較好，具有良好的成藥前景。

在具體的實施方式中，本發(fā)明的化合物如以下結(jié)構(gòu)通式所示：

式中

R¹選自H、鹵素、C₁-C₆烷基或C₁-C₆鹵代烷基；

R²選自H、C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀鹵代烷基、C₁-C₁₀烷氧基或C₁-C₁₀鹵代烷氧基、或羥基C₁-C₆烷基或羥基C₁-C₆鹵代烷基；

R³選自H、C₁-C₆烷基或C_1-6鹵代烷基；

R⁴選自H、鹵素、C₁-C₆烷基或C₁-C₆鹵代烷基、或C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆鹵代烷氧基，m＝0～3；

R⁵選自H、鹵素、OH、NR⁶R⁷、C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆鹵代烷氧基；

R⁶和R⁷彼此獨立選自：H或C₁-C₃烷基或C₁-C₃鹵代烷基。

在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的化合物如下式II所示：

式中

R¹選自H、F、Cl、Br、C₁-C₃烷基或C₁-C₃鹵代烷基；

R²選自H、C₁-C₆烷基或C₁-C₆鹵代烷基、C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆鹵代烷氧基、或羥基C₁-C₃烷基或羥基C₁-C₃鹵代烷基；

R³自H、C₁-C₃烷基或C_1-3鹵代烷基；

R⁴選自H、F、Cl、Br、C₁-C₃烷基或C₁-C₃鹵代烷基、C₁-C₃烷氧基或C₁-C₃鹵代烷氧基；

R⁵選自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、OCH₃。

在更優(yōu)選的實施方式中，R¹選自H、F、C₁-C₃烷基；R²選自C₁-C₃烷基；R³選自H、C₁-C₃烷基；R⁴選自H或Cl；R⁵選自H。

在上述化合物的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種藥物組合物，該組合物含有治療有效量的本發(fā)明的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的鹽的例子包括但不限于無機(jī)和有機(jī)酸鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、扁桃酸鹽和草酸鹽；以及與堿例如鈉羥基、三(羥基甲基)胺基甲烷(TRIS，胺丁三醇)和N-甲基葡糖胺形成的無機(jī)和有機(jī)堿鹽。

雖然每個人的需求各不相同，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明藥物組合物中每種活性成分的最佳劑量。一般情況下，本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，對哺乳動物每天口服給藥，藥量按照約0.0025到50毫克/公斤體重。但最好是每公斤口服給藥約0.01到10毫克。例如，單位口服劑量可以包括約0.01到50毫克，最好是約0.1到10毫克的本發(fā)明化合物。單位劑量可給予一次或多次，每天為一片或多片，每片含有約0.1到50毫克，合宜地約0.25到10毫克的本發(fā)明化合物或其溶劑化物。

本發(fā)明的藥物組合物可被配制成適合各種給藥途徑的制劑形式，包括但不 限于被配制成用于腸外，皮下，靜脈，肌肉，腹腔內(nèi)，透皮，口腔，鞘內(nèi)，顱內(nèi)，鼻腔或外用途徑給藥的形式，用于治療腫瘤和其他疾病。給藥量是有效地改善或消除一個或多個病癥的藥量。對于特定疾病的治療，有效量是足以改善或以某些方式減輕與疾病有關(guān)的癥狀的藥量。這樣的藥量可作為單一劑量施用，或者可依據(jù)有效的治療方案給藥。給藥量也許可治愈疾病，但是給藥通常是為了改善疾病的癥狀。一般需要反復(fù)給藥來實現(xiàn)所需的癥狀改善。藥的劑量將根據(jù)病人的年齡，健康與體重，并行治療的種類，治療的頻率，以及所需治療效益來決定。

本發(fā)明的藥物制劑可以給予任何哺乳動物，只要他們能獲得本發(fā)明化合物的治療效果。在這些哺乳動物中最為重要的是人類。

本發(fā)明的化合物或其藥物組合物可用于治療各種DHODH介導(dǎo)的疾病。本文中，DHODH介導(dǎo)的疾病是自身免疫疾病、器官移植排異、細(xì)菌感染、寄生蟲疾病、病毒性疾病、或腫瘤。在具體的實施方式中，所述自身免疫疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、或牛皮癬。

本發(fā)明的藥物制劑可用已知的方式制造。例如，由傳統(tǒng)的混合，制粒，制錠，溶解，或冷凍干燥過程制造。制造口服制劑時，可結(jié)合固體輔料和活性化合物，選擇性研磨混合物。如果需要或必要時加入適量助劑后，加工顆?；旌衔铮@得片劑或錠劑芯。

合適的輔料特別是填料，例如糖類如乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇；纖維素制劑或鈣磷酸鹽，例如磷酸三鈣或磷酸氫鈣；以及粘結(jié)劑，例如淀粉糊，包括玉米淀粉，小麥淀粉，大米淀粉，馬鈴薯淀粉，明膠，黃芪膠，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可增加崩解劑，比如上面提到的淀粉，以及羧甲基淀粉，交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，或褐藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。輔助劑特別是流動調(diào)節(jié)劑和潤滑劑，例如，硅石，滑石，硬脂酸鹽類，如鎂硬脂酸鈣，硬脂酸或聚乙二醇。如果需要，可以給錠劑核芯提供可以抵抗胃液的合適包衣。為此，可以應(yīng)用濃縮糖類溶液。這個溶液可以含有阿拉伯樹膠，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/或二氧化鈦，漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。為了制備耐胃液的包衣，可使用適當(dāng)?shù)睦w維素溶液，例如醋酸纖維素鄰苯二甲酸或羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸。 可向藥片或錠劑核芯的包衣加入染料或色素。例如，用于識別或為了表征活性成分劑量的組合。

因此，本發(fā)明還提供一種治療EGFR介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括給予需要的對象以本發(fā)明的化合物或包含本發(fā)明化合物的藥物組合物。

給藥方法包括但不限于本領(lǐng)域周知的各種給藥方法，可根據(jù)患者的實際情況加以確定。這些方法包括但不限于腸外、皮下、靜脈、肌肉、腹腔內(nèi)、透皮、口腔、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、鼻腔或外用途徑給藥。

本發(fā)明也包括本發(fā)明化合物在制備治療EGFR介導(dǎo)的疾病用的藥物中的用途。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本領(lǐng)域的公知常識和本發(fā)明的內(nèi)容可以知曉，本發(fā)明化合物因其中所含的羧基而能形成鹽或酯，進(jìn)而可以形成前藥。

本發(fā)明的優(yōu)點

1.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一系列結(jié)構(gòu)全新的噻唑類衍生物；

2.本發(fā)明的化合物是高效、低毒的DHODH抑制劑，從而具備很重要的學(xué)術(shù)價值與現(xiàn)實意義。

以下結(jié)合具體實施案例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步描述，但以下實施案例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制，所有依據(jù)本發(fā)明的原理和技術(shù)手段采用的各種施用方法，均屬于本發(fā)明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

實施例1

2-甲基氨基硫脲(1)

稱取2.5g(17.3mmol)甲基肼硫酸鹽于250ml單口瓶中，加入100ml乙醇，攪拌下加入1.6g(20.8mmol)硫氰酸銨，加熱至回流，反應(yīng)72h后，將反應(yīng)液冷至室溫，抽濾，濾液旋干硅膠柱層析(DCM/MeOH＝40:1)，分第二個副產(chǎn)物，得白色粉末狀固體0.63g，產(chǎn)率34.2％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 7.36(s,2H),4.89(s,2H),3.41(s,3H).GC-MS(EI)calcd for C₂H₇N₃S[M]⁺105.0,found 105.0.

2-甲基-1-(2-羧基芐差基)氨基硫脲(2)

稱取80mg(0.76mmol)化合物(1)于50ml單口瓶中，加入20ml乙醇，攪拌下加入鄰羧基苯甲醛114mg(0.76mmol)，加熱至回流，TLC監(jiān)測反應(yīng)至原料轉(zhuǎn)化完全，將反應(yīng)液冷至室溫，旋干溶劑，硅膠柱層析(DCM/MeOH＝120:1)，得白色粉末狀固體100mg，產(chǎn)率56％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.36(br,1H),8.56(s,1H),8.51(s,1H),8.31(d,J＝7.8Hz,1H),8.25(s,1H),7.88(d,J＝8Hz,1H),7.59(t,J＝7.2Hz,1H),7.50(t,J＝7.2Hz,1H),3.77(s,3H).LC-MS(ESI)calcd for C₁₀H₁₂N₃O₂S[M]⁺238.1,found 238.1.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S1

稱取100mg(0.42mmol)化合物(2)于50ml單口瓶中，加入10ml乙醇，攪拌下加入65μL(0.42mmol)2’-氯-2-溴苯乙酮，升溫至回流，TLC跟蹤反應(yīng)至原料轉(zhuǎn)化完全，將反應(yīng)液冷至室溫，旋干溶劑，硅膠柱層析(DCM/MeOH＝120:1)，得黃色粉末狀固體106mg，產(chǎn)率67.9％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ 13.30(s,1H),8.62(s,1H),8.02(d,J＝7.6Hz,1H),7.98–7.90(m,2H),7.66(t,J＝7.6Hz,1H),7.56–7.49(m,2H),7.47(s,1H),7.43(td,J₁＝7.4Hz,J₂＝1.2Hz, 1H),7.36(td,J₁＝7.6Hz,J₂＝1.6Hz,1H),3.68(s,3H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 168.98,168.57,147.11,136.94,135.17,133.42,132.48,131.51,131.09,130.98,130.75,130.16,129.45,129.19,127.63,126.51,111.41,32.88.HRMS(ESI)calcd for C₁₈H₁₅N₃O₂SCl[M+H]⁺372.0574,found 372.0575.

采取類似的方法，本發(fā)明人利用相應(yīng)的起始材料進(jìn)一步合成了以下化合物：

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-乙基-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S2

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.32(br,1H),8.64(s,1H),7.98–7.91(m,3H),7.66(t,J＝7.5Hz,1H),7.56–7.46(m,2H),7.45–7.39(m,2H),7.34(t,J＝6.8Hz,1H),4.32(q,J＝6.8Hz,2H),1.27(t,J＝7.0Hz,3H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.56,168.36,147.34,137.00,135.42,133.53,132.50,131.53,131.12,130.92,130.72,130.22,129.42,129.19,127.62,126.62,111.22,40.38,10.33.HRMS(ESI)calcd for C₁₉H₁₇N₃O₂SCl[M+H]⁺386.0730,found 386.0728.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-丙基-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S3

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.35(br,1H),8.65(s,1H),7.98(d,J＝8.0Hz,1H),7.95-7.92(m,2H),7.67(t,J＝7.2Hz,1H),7.54(d,J＝8.0Hz,1H),7.5(t,J＝7.6Hz,1H),7.45-7.42(m,2H),7.36(t,J1＝7.6Hz,J2＝1.6Hz,1H),4.25(t,J＝7.2Hz,2H),1.82-1.73(m,2H),0.97(t,J＝7.4Hz,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ 168.54,168.22146.95,136.63,134.96,133.17,132.11,131.10,130.74,130.55,130.34,129.82,129.04,128.80,127.26,126.09,110.77,46.31,17.98,11.17.HRMS(ESI)calcd for C20H19N3O2SCl[M+H]+400.0887,found 400.0879.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-異丙基-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S4

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.35(br,1H),8.91(s,1H),7.99(d,J＝8.0Hz,1H),7.95-7.92(m,2H),7.67(t,J＝7.6Hz,1H),7.54(d,J＝8.0Hz,1H),7.52(t,J＝7.6Hz,1H),7.46-7.42(m,2H),7.36(td,J₁＝7.6Hz,J₂＝1.6Hz,1H),5.22-5.11(m,1H),1.57(d,J＝6.8Hz,6H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.22,168.21,146.90,137.32,135.23,133.14,132.07,131.06,130.64,130.58,130.39,129.88,128.97,128.78,127.28,125.91,111.12,49.61,18.07,18.07.HRMS(ESI)calcd for C₂₀H₁₉N₃O₂SCl[M+H]⁺400.0887,found 400.0885.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-(2-丁基)-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S5

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.32(br,1H),8.91(s,1H),7.99(d,J＝8.0Hz,1H),7.95-7.90(m,2H),7.67(t,J₁＝7.6Hz,1H),7.55-7.48(m,2H),7.46-7.42(m,2H),7.36(td,J₁＝7.6Hz,J₂＝1.6Hz,1H),5.00-4.93(m,1H),2.35-2.24(m,1H),1.92-1.81(m,1H),1.54(d,J＝6.8Hz,3H),0.88(t,J＝7.2Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 168.66,168.19,146.97,137.03,135.24,133.19,132.13,131.04,130.67,130.58,130.39,129.70,128.98,128.77,127.29,125.91,111.04,55.67,25.26,16.33,11.14.HRMS(ESI)calcd for C₂₁H₂₁N₃O₂SCl[M+H]⁺414.1043,found 414.1029.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-(2-戊基)-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S6

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.35(br,1H),8.91(s,1H),7.98(d,J＝7.6Hz,1H),7.94(d,J＝8.0Hz,1H),7.91(dd,J₁＝7.6Hz,J₂＝1.6Hz,1H),7.67(t,J＝7.6Hz,1H),7.53(d,J＝8.0Hz,1H),7.49(t,J＝7.6Hz,1H),7.46-7.42(m,2H),7.36(td,J₁＝7.6Hz,J₂＝1.6Hz,1H),5.14-5.06(m,1H), 2.34-2.25(m,1H),1.82-1.73(m,1H),1.53(d,J＝6.8Hz,3H),1.34-1.24(m,2H),0.89(t,J＝7.4Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 168.68,168.20,146.98,137.04,135.30,133.20,132.14,131.00,130.68,130.59,130.40,129.68,128.99,127.30,125.90,111.09,53.81,34.20,19.46,16.46,13.60.HRMS(ESI)calcd for C₂₂H₂₃N₃O₂SCl[M+H]⁺428.1200,found 428.1193.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-羥乙基-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S7

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.24(br,1H),8.75(s,1H),7.98-7.01(m,3H),7.66(t,J＝7.6Hz,1H),7.54(d,J＝8.0Hz,1H),7.49(t,J＝7.6Hz,1H),7.45-7.41(m,2H),7.36(td,J＝7.6Hz,J＝1.6Hz,1H),4.35(t,J＝6.4Hz,2H),3.76(t,J＝6.4Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.64,168.23,146.87,136.89,134.91,133.15,131.99,131.19,130.71,130.46,130.32,130.16,129.04,128.79,127.22,126.28,110.78,56.24,47.46.HRMS(ESI)calcdfor C₁₉H₁₇N₃O₃SCl[M+H]⁺402.0679,found 402.0678.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(4-三氟甲基-2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S8

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 14.02(br,1H),8.66(s,1H),8.21(d,J＝8.0Hz,1H),8.17(s,1H),8.02(d,J＝8.0Hz,1H),7.95(d,J＝7.6Hz,1H),7.56-7.53(m,2H),7.43(t,J＝7.6Hz,1H),7.37(t,J＝7.6Hz,1H),3.70(s,3H). ¹³C NMR(100MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.33,167.17,146.79,138.38,135.01,132.91,131.12,130.70,130.37,129.14,128.57,128.25,128.20,127.26,127.04,125.10,122.40,111.51,32.68.HRMS(ESI)calcd for C₁₉H₁₄N₃O₂SClF₃[M+H]⁺440.0447,found 440.0433.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(4-甲基-2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S9

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.30(br,1H),8.59(s,1H),7.96(d,J＝7.6Hz,1H),7.92(d,J＝8.0Hz,1H),7.75(s,1H),7.54(d,J＝7.6Hz,1H),7.49-7.46(m,2H),7.43(t,J＝7.6Hz,1H),7.36(t,J＝7.6Hz,1H),3.66(s,3H),2.38(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.60,168.35,146.68,138.54,136.64,133.03,132.70,132.07,131.11,130.86,130.67,130.34,129.83,129.00,127.21,126.04,110.84,32.39,20.69.HRMS(ESI)calcd for C₁₉H₁₇N₃O₂SCl[M+H]⁺386.0730,found 386.0738.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基-4-氟芐叉基)肼基]噻唑S10

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.28(br,1H),8.14(s,1H),7.93(dd,J₁＝7.6Hz,J₂＝1.6Hz,1H),7.61(dd,J₁＝7.0Hz,J₂＝1.8Hz,1H),7.55-7.49(m,3H),7.44-7.41(m,1H),7.36(td,J₁＝7.6Hz,J₂＝1.6Hz,1H),3.68(s,3H). ¹³C NMR(100MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.55,168.01,159.74(d,¹J＝249Hz),146.67,133.68,133.10,131.50,131.12,130.72,130.32,130.10(d,³J＝8.8Hz),129.06,127.23,125.53(d,⁴J＝3.1Hz),121.75(d,²J＝11.8Hz),118.76(d,²J＝22Hz),111.13,32.28.HRMS(ESI)calcd for C₁₈H₁₄N₃O₂FSCl[M+H]⁺390.0479,found 390.0475.

(E)-5-甲基-4-苯基-2-[1-甲基-2-(4-甲基-2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S11

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ 13.24(br,1H),8.54(s,1H),7.91(d,J＝8.0Hz,1H),7.73(s,1H),7.64-7.53(m,2H),7.46-7.42(m,3H),7.33(t,J＝7.4Hz,1H),3.60(s,3H),2.44(s,3H),2.38(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 168.35,165.40,145.43,138.33,135.76,135.16,132.68,132.22,130.86,129.62,128.24,128.24,127.85,127.85,127.06,125.89,119.27,31.85,20.68, 12.24.HRMS(ESI)calcd for C₂₀H₂₀N₃O₂S[M+H]⁺366.1276,found 366.1273.

(E)-5-甲基-4-苯基-2-[1-甲基-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S12

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.32(br,1H),8.58(s,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.92(d,J＝7.6Hz,1H),7.68-7.63(m,3H),7.50-7.43(m,3H)，7.34(t,J＝7.4Hz,1H),3.62(s,3H),2.44(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.24,165.36,145.47,135.66,135.13,134.90,131.98,130.58,129.70,128.59,128.25,128.25,127.86,127.86,127.09,125.94,119.44,31.93,12.24.HRMS(ESI)calcd for C₁₉H₁₆N₃O₂S[M-H]^-350.0963,found 350.0951.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S13

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.46(br,1H),8.60(s,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.92(d,J＝8.0Hz,1H),7.64(t,J＝7.4Hz,1H),7.56(d,J＝7.6Hz,1H),7.49-7.39(m,4H),3.56(s,3H),2.15(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.98,166.46,144.56,136.46,135.29,134.54,133.25,132.50,132.31,131.05,130.72,130.26,130.01,129.09,127.49,126.42,121.85,32.46,12.16.HRMS(ESI)calcd for C₁₉H₁₇N₃O₂SCl[M+H]⁺386.0730,found 386.0727.

(E)-5-乙基-4-(2-氯苯基)-2-(2-羧基芐叉肼基)噻唑S14

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 12.57(br,2H),8.79(s,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.88(d,J＝8.0Hz,1H),7.62(t,J＝7.5Hz,1H),7.56–7.51(m,1H),7.46(t,J＝7.5Hz,1H),7.44-7.36(m,3H),2.49(q,J＝7.5Hz,1H),1.13(t,J＝7.5Hz,3H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 169.28,165.92,144.14,140.84,135.89,135.46,133.99,133.03,133.02,131.46,130.81,130.73,130.60, 129.73,128.09,127.73,127.01,20.99,17.25.HRMS(ESI)calcd for C₁₉H₁₇N₃O₂SCl[M+H]⁺386.0730,found 386.0729.

(E)-5-甲基-4-(2-氯苯基)-2-(2-羧基芐叉肼基)噻唑S15

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 12.7(br,2H),8.77(s,1H),7.99(d,J＝7.6Hz,1H),7.87(d,J＝7.2Hz,1H),7.62(t,J＝7.4Hz,1H),7.562-7.543(m,1H),7.481-7.397(m,4H),2.14(s,3H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.65,165.18,144.49,140.16,135.25,134.56,133.21,132.46,130.83,130.14,130.03,129.11,127.45,126.37,119.49,12.15.HRMS(ESI)calcd for C₁₈H₁₅N₃O₂SCl[M+H]⁺372.0574,found 372.0569.

(E)-4-(2-氯苯基)-2-(2-羧基芐叉肼基)噻唑S16

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.2(br,1H),12.4(br,1H),8.82(s,1H),8.00(d,J＝7.6Hz,1H),7.88(t,J＝7.0Hz,2H),7.64(t,J＝7.4Hz,1H),7.6(dd,J＝7.6Hz,1H),7.48(td,J＝7.6Hz,1H),7.42(td,J＝7.8Hz,1H),7.36(m,2H).¹³CNMR(125MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.63,167.77,147.63,140.76,135.08,133.71,132.43,131.54,131.23,130.83,130.83,130.26,129.47,129.28,127.69,126.47,109.26.HRMS(ESI)calcd for C₁₇H₁₃N₃O₂SCl[M+H]⁺358.0417,found 358.0417.

(E)-5-甲基-4-苯基-2-(2-羧基芐叉肼基)噻唑S17

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 12.7(br,2H),8.77(s,1H),7.99(d,J＝7.6Hz,1H),7.87(dd,J＝8.0Hz,1H),7.63-7.59(m,3H),7.48-7.43(m,3H),7.33(t,J＝7.2Hz,1H),2.43(s,3H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.66, 164.72,146.00,140.05,135.64,135.24,132.36,130.83,130.12,129.08,128.73,128.73,128.35,128.35,127.51,126.33,117.61,12.74.HRMS(ESI)calcd for C₁₈H₁₆N₃O₂S[M+H]⁺338.0963,found 338.0954.

(E)-4-苯基-2-(2-羧基芐叉肼基)噻唑S18

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.45(br,1H),12.49(br,1H),8.81(s,1H),7.99(d,J＝7.6Hz,1H),7.87(m,3H),7.63(t,J＝7.4Hz,1H),7.47(t,J＝7.2Hz,1H),7.41(t,J＝7.6Hz,2H),7.33(s,1H),7.30(t,J＝7.4Hz,1H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d_6,ppm)δ 168.53,168.53,150.97,140.58,135.02,134.99,132.31,130.74,130.15,129.15,128.96,128.96,127.90,126.34,125.90,125.90,104.20.HRMS(ESI)calcd for C₁₈H₁₆N₃O₂S[M-H]^-322.0650,found 322.0656.

(E)-4-(2,5-二氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S19

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.31(br,1H),8.63(s,1H),8.02-8.00(m，2H)，7.93(d，J＝7.2Hz，1H)，7.67(t，J＝7.6Hz，1H)，7.63(s，1H)，7.58(d，J＝7.6Hz,1H),7.50(t,J＝7.2Hz,1H),7.43(dd,J₁＝7.2Hz,J₂＝2.8Hz,1H),3.68(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 168.68,168.15,145.13,136.79,134.70,134.21,132.14,132.06,131.85,130.59,130.17,129.76,129.20,128.84,128.58,126.13,112.31,32.49.HRMS(ESI)calcd for C₁₈H₁₄N₃O₂SCl₂[M+H]⁺406.0184,found 406.0187.

(E)-4-苯基-2-[1-甲基-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S20

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.31(br,1H),8.62(s,1H),8.02(d,J＝7.6Hz,1H),7.94-7.91(m,3H),7.66(t,J＝7.2Hz,1H),7.49(t,J＝7.2Hz,1H),7.45-7.40(m,3H),7.31(t,J＝7.2Hz,1H),3.71(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 169.45,168.20,150.18,136.35,134.80,134.49,132.07,130.60, 129.71,128.76,128.56,128.56,127.59,126.09,125.54,125.54,105.97,32.51.HRMS(ESI)calcd for C₁₈H₁₆N₃O₂S[M+H]⁺338.0963,found 338.0963.

(E)-4-(3-氯苯基)-2-[1-甲基-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S21

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆,ppm)δ 13.32(br,1H),8.63(s,1H),8.01(d,J＝7.6Hz，1H)，7.97(s，1H)，7.93(d，J＝7.6Hz，1Hz，1H)7.88(d，J＝8.0Hz，1H)，7.66(t,J＝7.6Hz,1H),7.61(s,1H),7.50(t,J＝7.6Hz,1H),7.45(t,J＝7.6Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),3.71(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 169.57,168.18,148.56,136.64,136.50,134.72,133.48,132.06,130.59,130.44,129.76,128.81,127.28,126.12,125.16,124.05,107.56,32.52.HRMS(ESI)calcdfor C₁₈H₁₅N₃O₂SCl[M+H]⁺372.0574,found 372.0574.

(E)-5-甲基-4-(2-氯苯基)-2-[1-(2-戊基)-2-(2-羧基芐叉基)肼基]噻唑S22

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 13.29(br,1H),8.85(s,1H),7.98(d,J＝8.0Hz,1H),7.92(d,J＝7.6Hz,1H),7.65(t,J＝7.6Hz,1H),7.56-7.54(m,1H),7.51-7.41(m,4H),5.05-4.96(m,1H),2.29-2.22(m,1H),2.16(s,3H),1.75-1.67(m,1H),1.46(d,J＝7.2Hz,3H),1.28-1.23(m,2H),0.87(t,J＝7.6Hz,3H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆,ppm)δ 168.23,166.06,144.08,136.14,135.46,134.09,132.79,132.09,131.93,130.58,129.64,129.60,129.48,128.56,126.95,125.73,121.62,53.39,34.01,19.41,16.35,13.58,11.52.HRMS(ESI)calcd for C₂₃H₂₅N₃O₂SCl[M+H]⁺442.1356,found 442.1354.

實施例2

hsDHODH蛋白的培養(yǎng)與純化

蛋白的培養(yǎng)：按照常規(guī)方法，例如Sambrook等，分子克?。簩嶒炇抑改?NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，根據(jù)GenBank中的hsDHODH基因序列獲得hsDHODH蛋白。

將測序正確的重組質(zhì)粒pET-19b-DHODH轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，隨機(jī)挑取菌種接種于含100μM氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃、230rpm搖床培養(yǎng)過夜。按1:200的比例接種于500mL含100μL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃、230rpm擴(kuò)大培養(yǎng)。待菌體OD值達(dá)到0.8-1時，向培養(yǎng)基中加入IPTG，使IPDG終濃度為0.5mM，25℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)。于4℃、4000rmp離心收集誘導(dǎo)后菌體，用去離子水洗滌之后再次離心收集菌體沉淀，于-80℃保存。

蛋白的純化：蛋白的純化使用裂解液重懸菌體。裂解液中含有50mMHEPES(pH 8.0)，0.15M NaCl，10mM咪唑，10％甘油，0.1％Triton X-100，并加入少許大豆蛋白酶抑制劑，重懸混合均勻后超聲破碎菌體。破碎液離心30min，取上清和沉淀進(jìn)行蛋白電泳以確定蛋白存在形式。將上清液加入Ni-NTA層析柱中，收集穿過液，然后用含20mM咪唑的裂解液洗樹脂3-4次，最后用含300mM咪唑的裂解液洗脫，收集洗脫后蛋白液。取以上10μL蛋白樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，測定目的蛋白含量。最后，將洗脫后的蛋白液在透析液中透析從而去除咪唑，即得純品蛋白。

實施例3

式Ⅰ所示化合物的酶水平活性測試

酶水平活性測試的原理是：首先二氫乳清酸(Dihydroorotate,DHO)在DHODH的催化下氧化脫氫生成乳清酸(Orotate,OA)，同時伴隨黃素單核苷酸(Flavin mononucleotide,FMN)接受2H⁺及2e^-還原為還原型黃素單核苷酸(FMNH₂)；隨后輔酶Q(C_OQ)作為氫受體接受FMNH₂的電子和質(zhì)子還原為還原型輔酶Q(C_OQH₂)，還原型輔酶Q將電子傳遞給顯色底物二氯靛酚鈉鹽(DCIP)，最終DCIP被還原。DCIP在600nm處有最大吸收，而還原態(tài)的DCIP在600nm處沒有吸收。根據(jù)吸光度的減弱程度即可判斷底物DHO被氧化的程度。單位時間內(nèi)底物DHO被氧化程度即為酶促反應(yīng)初速度。加入抑制劑后，酶促反應(yīng)初速度降低。

將純化后的DHODH用測活緩沖液(50mM HEPES,pH 8.0,150mM KCl,0.1％Triton X-100)稀釋至10nM，加入輔酶Q及DCIP，使其終濃度分別為100 μM及120μM，混合均勻后加入96孔板，室溫孵育5min，加入底物DHO啟動反應(yīng)，DHO終濃度500μM。使用BioTek酶標(biāo)儀在600nm處讀取吸光值，每30s讀一次，持續(xù)6min。抑制劑的活性測試即在上述反應(yīng)體系中加入不同濃度的抑制劑，未加抑制劑時酶促反應(yīng)初速度為V₀,，加抑制劑后酶促反應(yīng)初速度Vi,化合物的抑制率由公式(1-Vi/V₀)×100％計算?；衔颕C₅₀的計算，使用Origin 8.0，至少測試8個濃度下的抑制率。實驗過程采用Brequinar(購買自Sigma-Aldrich試劑公司)為陽性對照，每次實驗至少設(shè)三個平行。結(jié)果見表1：

表1

實施例4

式Ⅰ所示化合物的抗腫瘤活性測試(MTT實驗)

MTT實驗的原理：MTT的化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍(lán)，是一種活細(xì)胞代謝物還原劑。MTT為一種黃色染料，能接受氫離子，可用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈。活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源MTT還原為不溶性的結(jié)晶紫甲臢(formazan)，由于死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能還原MTT，故，formazan的生成量僅與活細(xì)胞的數(shù)目成正比。生成的不溶性的formazan可溶于DMSO，于570nm處測定其吸光值，根據(jù)測定的吸光值來計算化合物對于癌細(xì)胞增殖的抑制率。

實驗所用細(xì)胞為人直腸癌細(xì)胞HCT-116，將細(xì)胞配成懸液，以每孔5000個細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL，置于5％CO₂，37℃的培養(yǎng)箱孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底。24小時后加濃度梯度化合物，每孔加10μL，于5％CO2，37℃下孵育72小時后，每孔加10μL MTT(5mg/mL)，繼續(xù)孵育4小時后終止培養(yǎng)，小心棄去孔中培養(yǎng)液，每孔加100μL DMSO，低速振蕩10-30分鐘，使formazan完全溶解，使用BioTek酶標(biāo)儀檢測570nm處吸光值，計算抑制率。抑制劑的抗腫 瘤活性測試即在上述反應(yīng)體系中加入不同濃度的抑制劑，未加抑制劑時吸光值A(chǔ)_O，加抑制劑后吸光值A(chǔ)i,化合物的抑制率由公式(1-Ai/A_O)×100％計算?；衔颕C₅₀的計算，使用Origin 8.0，至少測試8個濃度下的抑制率。實驗過程采用Brequinar(購買自Sigma-Aldrich試劑公司)為陽性對照，每次實驗至少設(shè)三個平行。實驗結(jié)果見表2：

表2

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn) 被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。